Клондық микрокөбейту әдістері

Жұмыс түрі: Материал
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 32 бет
Таңдаулыға:

әл-ФАРАБИ АТЫНДАҒЫ ҚАЗАҚ ҰЛТТЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ

Биология факультеті

Өсімдіктер биотехнологиясы, физиологиясы және биохимиясы кафедрасы.

БІТІРУ ЖҰМЫСЫ

Қазақстан өңірінде жабайы түрінде кездесетін таңқурай мен қара қарақаттың
in vitro жағдайындағы өсу ерекшеліктері.

Орындаған
4 курс студенті ________________________ Калиева А.А.

Ғылыми жетекшісі
б. ғ. к. доцент _________________________ Ережепов Ә.Е

б.ғ.к., а.ғ.қ. _________________________ Мұхитдинова З.Р.

Норма бақылаушы: __________________________ Оразова С.А.

Кафедра меңгерушісі
б. ғ. д., профессор __________________________ Корпенюк Н.А.

АЛМАТЫ, 2010

Мазмұны

РЕФЕРАТ
3

Қысқартылған сөздер тізімі
5

Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..6

1. ӘДЕБИЕТКЕ
ШОЛУ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... 7
1.1Клондық микрокөбейту және оның маңызы
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 7
1.2.Клондық микрокөбейтудің
әдістері ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...8
1.3 Қолтық бүршіктерінің дамуын қоздыру ... ... ...
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 9
1.4 Апикальды меристеманы өсіру
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..1 1
1.5 Клондық микрокөбейтуге әсер ететін
факторлар ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ...12
1.6 Жеміс-жидек өсімдіктерін клондық
микрокөбейту ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..13
1.7 Аса бағалы жидек өсімдіктерін in vitro жағдайына енгізіп
көбейту ... ... ..16

2 Материалдар мен әдістер...
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...19
2.1 Зерттеу обьектілері ... ... ... ... ... ... .
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . ..19
2.1.1 Зерттеу әдістері ... ... ... ... ... ... ... ...
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 20

3 НӘТИЖЕЛЕР ЖӘНЕ
ТАЛҚЫЛАУ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

ҚОРЫТЫНДЫ ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ...

ҚОЛДАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР
ТІЗІМІ ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ...

Реферат

Бітіру жұмысының тақырыбы " Қазақстан өңірінде жабайы түрінде кездесетін
таңқурай мен қара қарақаттың in vitro жағдайындағы өсу ерекшеліктері".
Жұмыс көлемі - , кесте саны - , фотосурет саны -, диаграмма - .
Пайдаланған әдебиеттер саны -

Жұмыстың мақсаты - Қазақстанда ұлттық гермоплазма банкін құруға
жеміс-жидек өсімдіктерінің әртүрлілігін сақтау үшін таңқурайдың Қазақстан
аймақтарында жабайы өсетін Rubus ideas L. және қара қарақаттың Ribes
nigrum L., R. meyeri Maxim. R. hispidulum (Janc.) Pojark. шаруашылыққа
бағалы түрлерін in vitro жағдайына енгізіп, жаппай көбейтіп өсірудің
технологиясын жақсарту болды.
Өсімдіктер биологиясы және биотехнологиясы институтында оқшау алынған
өсімдік клеткалары мен ұлпаларын криосақтау әдістерін жақсарту негізінде,
жеміс-жидек өсімдіктерінің жабайы кездесетін түрлерін in vitro жағдайына
енгізіп микроклондап көбейту арқылы олардың меристемаларының криогенді
коллекциясын жасау жұмыстары алғаш рет жүргізілуде.
Зерттеу жұмыстары 2008-2010 жылдары Шаруашылыққа бағалы жеміс-жидек
өсімдіктерінің клеткалары және ұлпаларының криогенді коллекциясын сақтау
және толықтыру деген Отандық жоба аясында жүргізілді.
Зерттеу әдістері – зерттеу жұмысына таңқурайдың Қазақстан аймақтарында
жабайы өсетін түрі Rubus ideas L. және қара қарақаттың түрлері Ribes nigrum
L., R. meyeri Maxim. R. hispidulum (Janc.) Pojark. қолданылды. Таңқурай
(Rubus ideas L.) мен қара қарақаттың (Ribes nigrum L., Ribes hispidulum
(Janc.) Pojark.) жабайы өсетін түрлерінің үлгілері Іле Алатауына (Үлкен-
Ақсу) және Алтай тауларына (Солтүстік-Батыс етегі, Иванов шатқалы, Серый
луг, Риддер, Алтай ботаника бағы) шыққан экспедиция кезінде әкелінсе, Ribes
meyeri Maxim. Ботаника және фитоинтродукция коллекциясынан алынды.
Экспланттар ретінде таңқурай мен қара қарақаттың көбінесе сабағының
базальды бөліміндегі 1-1,2 см апикальды және қолтық бүршіктері қолданылды.
Қара қарақат пен таңқурай экспланттарын in vitro жағдайына енгізу сәуір-
шілде айларында жүргізілді. In vitro жағдайына енгізілген бүршіктелген
бұтақшалар ай сайын қайтадан отырғызылып көбейтілді. Өсімдік ұлпаларын
бактериялық және саңырауқұлақ инфекцияларынан арылтып залалсыздандыру үшін
құрамында хлоры бар заттар (деохлор, АСЕ, Доместос), сулеманың (HgCl2)
0,1% ерітіндісі және 3% сутек асқын тотығы (Н2О2) қолданылды. Қоректік
ортаны дайындау және экспланттарды өсіру үшін Ф.Л. Калинин, Г.П. Кушнир,
В.В. Сарнацская әдістері [12] қолданылды. Өсімдіктерді in vitro жағдайына
енгізіп көбейтyге әртүрлі деңгейдегі фитогормондар бензиламинопурин (БАП),
индолилмай қышқылы (ИМҚ), гиберелл қышқылы (ГҚ) қосылған Мурасиге және Скуг
(МС) [Murashige, 1974] қоректік ортасы қолданылды. Экспланттар 16-сағаттық
фотопериодта, 4000-5000 лк. люминесцент жарығында және 22-24оС
температурада өсірілді. In vitro жағдайына енгізген өсімдіктердің
бактериялық инфекциядан тазалығы арнайы Viss [Viss ж. басқа., 1991]
ортасында тексерілді. Өсімдіктердің өсу қалпына 5 балл жүйесі бойынша тест
жасалынды. Тәжірибе 5 рет қайталанды. Қайтадан жаңалап отырғызылған сайын
әртүрлі генотиптің орташа көбею коэффициенті мына формуламен есептелді: P =
ab·c: a – қайтадан пайда болған бұтақшалардың саны, b – көбейту үшін
отырғызылған бұтақшалар саны, c – отырғызу саны.

Нәтижелер:
1.Залалсыздандырушы заттардың әртүрлі схемаларын қолдана отырып
зерттеуге алынған таңқурайдың Rubus ideas L. және қара қарақаттың жабайы
Ribes nigrum L., R. meyeri Maxim. түрлерінің үлгілері in vitro жағдайына
енгізілді. Бұл жүргізілген зерттеулерден бұрыннан жиірек қолданылып жүрген
құрамында сынап бар сулема және диацид улы заттарын қолданбай басқа
залалсыздандырушы заттарды да пайдалануға болатындығы дәлелденді.
2. In vitro жағдайына енгізілген таңқурайдың, Rubus ideas L. және қара
қарақаттың түрлері Ribes nigrum L., R. meyeri Maxim микроклон әдісімен
көбейтіліп өсірілді.

ҚЫСҚАРТЫЛҒАН СӨЗДЕР

Кіріспе

Қазақстан территориясында жабайы түрінде кездесетін жеміс-жидек
өсімдіктерінің түрлері антропогендік әсерлермен азайып барады. Қазіргі
кездері, жабайы түрінде кездесетін жеміс-жидек өсімдіктерінің генетикалық
ресурстары тұрақты гендердің әлемдік байлық көзі ретінде жаппай селекция
саласына, шаруашылыққа кеңінен қолданылуда [Жангалиев ж. басқа., 2001].
Жеміс-жидек өсімдіктерінің аса пайдалы жабайы түрлерін сақтап қалу
халықаралық деңгейде аса маңызды көкейтесті мәселе қатарына жатады. Олардың
шаруашылыққа бағалы түрлері мен формаларының биологиялық әртүрлілігін
сақтау Қазақстан ұлттық гермоплазма банкін құру үшін аса қажет.
Жеміс-жидек өнімдерінің аса жоғары сұраныстарына байланысты елімізде
ауыл-шарушылық өндірістерінде өсімдіктерді әртүрлі инфекциядан арылту және
тезірек көбейту мәселелері аса маңызды. Өсімдіктерді in vitro жағдайында
ұлпалары арқылы көбейту әдістерін пайдалана отырып, бір жағынан оларды
инфекциялық аурулардан арылтып қана қоймай, екіншіден, цитокининдердің
көмегімен апекс белсенділігін құлшындырып жаңадан бүршіктер қалыптасу және
даму процестерін тездетуге мүмкіндік туады [1,2,4,29]. Асептикалық in vitro
жағдайында өсімдік ұлпаларын көбейту әдістері селекция жұмыстарында,
қолданбалы ботаникада және биологиялық алуан түрлерді сақтап қалу және
көбейту мәселелерін шешуге кеңінен қолданылады. Бұл әдіспен өсімдіктердің
түрі мен сорттарына қарай, көбейту коэффициентін тез арада 1 1000 ден 1
600000 ға дейін арттыруға болады. Көбейту нәтижесінде, регенеранттар
әртүрлі зиянкес патогенді микрофлорадан арылып, өзгеріске ұшырамай
өздерінің жоғары генетикалық біргелкі сапалық қасиеттерін сақтап қалады.
Бұндай өсімдіктер патогенді микрофлорадан арылған генетикалық біркелкі таза
болады.
Қазіргі таңда өркениетті дамыған елдермен қатар Қазақстан ғалымдары
жеміс-жидек өсімдіктерін in vitro жағдайында көбейтіп өсіру әдісімен
айналысуда. Олардың негізгі мақсаттары іn vitro жағдайында клондық
микрокөбейту арқылы өнімділігі жоғары, сыртқы факторларға төзімді,
патогенді микрофлорадан арылған бастапқы өсімдік түріне тән барлық
белгілері мен қасиеттері сақталған өсімдіктер алу. Елімізде гермоплазма
банкін құру үшін көбейтілген құнды өсімдіктер түрлері, сорттары мен
формаларын асептикалық жағдайда температураны реттеп ұзақ ұақыт сақтауға
болады.
Соңғы кездері, Қазақстанда жабайы түрінде кездесетін қара қарақат
пен таңқурайдың түрлері антропогендік әсерлерден жойылып барады. Сол
себепті, қара қарақат пен таңқурайдың көптеген вирустық және микоплазмалық
ауруларға шалдығатыны белгілі. Аурулардан сауықтыруға қара қарақт пен
таңқурайдың аса бағалы сорттарын in vitro жағдайында меристема арқылы
көбейтіп, генетикалық біркелкі таза өсімдіктер алып Қазақстанның ұлттық
гермоплазма банкін толықтыруға мүмкіндік туады. Жұмыстың мақсаты:
Қазақстанда ұлттық гермоплазма банкін толықтыру үшін бүлдіргеннің
өнімділігі мол, бағалы сорттарын (таңқурайдың Rubus ideas L. және қара
қарақаттың түрлері Ribes nigrum L., R. meyeri Maxim. R. hispidulum (Janc.)
Pojark. ) in vitro жағдайына енгізіп, жаппай көбейтіп өсірудің
технологиясын жақсарту болды.

1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ
1.1Клондық микрокөбейту және оның маңызы
Өсімдіктерді микроклон арқылы көбейту деп өсімдіктердің in vitro
жағдайында жыныссыз жолмен көбеюін айтуға болады. Соның нәтижесінде пайда
болған өсімдіктер бастапқы өсімдікпен және өзара бір-бірімен генетикалық
тұрғыдан айнымастай бірдей болады. Сонымен, клон дегеніміз жыныссыз жолмен,
яғни вегетативтік көбею жолымен түзілетін организм [1,2,12,13,14].
Клондық микрокөбейту дегеніміз - ұлпа мен клетка культурасында
өсімдіктердің жаппай жыныссыз көбеюі. Бұл кездегі алынған өсімдіктер
түрлері алғашқысымен генетикалық жағынан бірдей. Микрокөбейтудің негізінде
өсімдік клеткасына тән тотипотенттілігін қолдану жатыр [1,16,17].
Бұл әдіс вегетативті көбейту әдістеріне қарағанда бірнеше мыңдаған есе
көп өсімдіктердің біртекті отырғызылатын көшеттерін көп мөлшерде алуға
мүмкіндік береді. Микрокөбейтудің коэффициенті аз уақытта немесе жылына 105-
106 өсімдікке жетеді. Мысалы, қарақат, гербера, раушан гүл өсімдіктерінің
бір түрін көбейтіп өсіру әдістерімен жылына бір миллион өсімдік алуға
болады.[2,9,10].
Клондық микрокөбейту мен морфогенезін зерттеуге арналған көптеген
тәжірибелік жұмыстар бар болғанымен, клондық микрокөбейту технологиясы
көптеген ауылшаруашылық өсімдіктері үшін әлі шығарылмаған. Бұның себептері
- нақты, жақсы жұмыс істейтін әдістердің болмауы, олардың күрделілігі,
қоректік ортаның аз кездесетін және қымбат компоненттерді пайдалануы,
өсімдіктердің морфогенетикалық потенциясы туралы білімнің аздығы болып
отыр.
Клондық микрокөбейтудегі алғашқы жұмыстар XX ғасырдың 50 жылдарының
соңында жүргізілді. Мысалы, Ветмор және Морель деген ғалымдар шаңжапырақ
өсімдіктерінің апекстерін көбейтіп өсірді. Олар өте қарапайым құрылымды
ортаны қолданды: Кноп қоректік ерітіндісі және сахароза (3%). Алайда,
жоғарыда айтылған өсімдіктердің апикальды меристемасының осы қоректік
ортада көбейіп өсуі нәтижесіз болып шықты [18,20].
Морель картоп пен георгинаның апикальды меристемалары қоректік орта
витаминдермен, глутатионмен, цистеинмен, кинетинмен байытылған жағдайда
каллус түзе алатынын анықтады. Гибберелл қышқылын қосқан кезде кішігірім
өскін дамыды. Алайда, оның өсуі әлсіз болып, 2-3 айдан соң ұзындығы 1см-ге
де жетпей тоқтап қалды. Бұл Кноп қоректік ерітіндісіндегі К+ және NH+4
иондары аз концентрацияда болғандықтан, шықпай қалғандығы соңынын
анықталады. Кейін қоректік ортаға 13,46мМ 7,56мМ концентрацияда KCI мен
(NH4)2SO4 қосқанда сабақтың апикальд меристемасының өсуі жақсарып,
өсімдіктің дамуы да жақсарады. Осы негізінде кейбір қалампыр, хризантема,
картоп, т.б. шөптесін өсімдіктердің апикальды меристемасының өсуін
жақсартатын құрамы: NH4NO3-12,49мМ, KNO3-9,89мМ, CaCl2 - 2,25мМ, MgSO4 7H2O-
0,50мМ, KH2PO4-0,91мМ сахароза- 58,42мМ, гриббел қышқылы- 28,8 мкМ болған
қоректік орта құрамы шығарылды [20,19].
Клондық микрокөбейту әдістерінің артықшылықтары көбірек. Сондықтан
жақын уақытта жидекті, көкөністі, дәрілік және тағы басқа өсімдіктердің
жаңа және шаруашылық үшін бағалы сорттарының отырғызылатын көшеттерін
алудың биотехнологиясын жақсартуға болады [16,15,14].
Микрокөбейту әдісінің дағдылы вегетативтік көбеюмен салыстырғанда
бірталай артықшылықтары бар, атап айтсақ:
✓ Микрокөбейту арқылы өсімдіктер вирустар мен патогенді
микроорганизмдерден сауықтырылады.
✓ Сұрыптау процесін жылдамдатып жаңа сорттарды тез
көбейтіп, олардың ауылшаруашылық өндірісіне пайдалану мерзімін едәуір
қысқартады.
✓ Вегетативті жолмен көбейе алмайтын өсімдікті, мысалы,
пальманы тек in-vitro жағдайында көбейтуге болады. Осы әдіспен өнеркәсіп
деңгейінде бірқатар өсімдіктерді көбейтеді.
✓ Арнайы бөлмедегі сөрелерде орналасқан пробиркаларда жыл
бойы мыңдаған өсімдіктерді өсіру арқылы теплицалар алаңы үнемделеді.
✓ Кәрі бұтақтардан жас өсімдіктер алуға болады.
✓ Микрокөбейту арқылы әсіресе даму процесінде тыныштық
кезеңі болатын өсімдіктерді көбейтуге тиімді. Өсу процесін жыл бойы үзбеуге
болады.
✓ Көбею коэффиценті өте жоғары. Мысалы, гербера, бүлдірген, қара қарақат,
хризантема, раушан өсімдіктерінің бір өсімдігінен жағдайда бір жылдың
ішінде 1 миллионнан астам клон өсімдіктер алуға болады. Алма ағашының бір
бүршігінен 8 айдың ішінде 60 мыңнан астам өркен шығады. Қарақаттың бір
бұтадағы меристемаларын бөліп алып, өсіріп жылына 50 мыңға дейін өсімдік
алуға болады. Сонымен, микрокөбейтудің коэффиценті басқа вегетативті
әдістермен салыстырғанда мыңдаған есе артық [24,22,21].
Клондық микрокөбейтудің артықшылықтары айқын факт. Өсімдік өсіру мен
селекцияда оның мүмкіншіліктері зор болғандықтан, биотехнологиялық
өндірісте болашақта кеңінен дамиды.

1.2. Клондық микрокөбейту әдістері
Қазіргі кезде клондық микрокөбейту әдісінің бәріне ортақ
классификация жоқ. Алғашқы классификациялардың бірін Мурасиге шығарған.
Ұлпалар культурасындағы экспланттарда болатын морфогенетикалық реакциялар
негізінде мынадай әдістер шығарылды:
1. Қолтық бүршіктерінің белсенделуі;
2. Қосалқы өскіндердің түзілуін қоздыру;
3. Сомалық эмбриогенез;
Кейінгі жұмыстарында Мурасиге әртүрлі морфогенетикалық реакцияларға
негізделген микрокөбейтудің түрі өзгертілген классификациясын ұсынды:
1. қолтық бүршіктерінің белсенділуі
2. қосалқы өркендердің экспланттан тікелей пайда болуы;
3. каллуста қосалқы өркендердің пайда болуы;
4. эксплантат клеткаларында сомалық эмбриогенезді қоздыру;
5. каллуста эмбриоидтардың пайда болуы;
6. in–vitro болған алғашқы сомалық эмбрион ұлпаларында
қосалқы эмбриоидтардың қалыптасуы.
3-6 әдіс қана алынған классификациядан бөлек, морфогенетикалық процестермен
байланысты микрокөбейтудің басқа да бөлінулер бар[25,24,22].
Клондық микрокөбейту процесін түбегейлі 2 түрге бөлуге болады:
1. өсімдікте бұрыннан бар бүршіктің дамуын бәсеңдету (сабақ апексін,
сабақтың қолтық бүршіктерін);
2. бүршік немесе эмбриоидтардың түзілуін қоздыру. Оның өзін 3 тәсілге
бөлуге болады:
а) Эспланттаттың маманданған ұлпаларынан репродуктивті мүшелер, эпидермис,
субэпидерма қабатының клеткалары жинақталған құрылымдардың түзілуі;
б) эксплант клеткаларынан каллустың түзілуі;
в) суспензияда өсіп жатқан клеткалар мен ауыстырылып отырғызылатын каллус
ұлпасының түзілуі.
Бұл классификацияның басқалардан айырмашылығы бүршіктерден пайда
болған өсімдіктер арасындағы түбегейлі айырмашылық. Яғни, олардың ата
аналық түрлерге генетикалық толық ұқсастығы .

1.3. Қолтық бүршіктерінің дамуын қоздыру
Қолтық бүршіктерді оятып, олардың дамуын қоздырып, олардан шыққан
қолтық өркендерді пайдалану өсімдіктерді микрокөбейтудегі ең кең тараған
әдіс. Қолтық меристемалардың өсуі сабақтың ұшын кесіп тастағанда немесе
цитокининмен өңдеген соң басталады. Қоректік ортадағы цитокинидер жанама
бүршіктердің жандануына әсер етеді және толып жатқан қолтық өркендердің
дамуына әкеледі. Тез өсетін өркендердің шоғыры пайда болады, одан жеке
өркендерді бөліп алып жаңа қоректік ортаға отырғызғанда, олар өсіп қайта
шоғырланады. Бірақ барлық өркендерде тамыр пайда бола бермейді. Ал оларды
цитокинині жоқ ортаға көшірсе, өзінен өзі тамырлары өсіп шығады. Қолтық
бүршіктерді ояту үшін қоректік ортадағы фитогормондардың концентрациясын
дұрыс анықтау керек. Цитокинин жоғары мөлшерде қолданылғанда қолтық
өркеннің дамуына мүмкіндік туғызады, бірақ өсімдіктің морфологиясына теріс
әсер етіп кемістіктері бар формалар пайда болады. Қоректік ортада ауксиннің
мөлшері артық болса, каллус түзілуі мүмкін. Каллус меристеманың өсуін
тежейді немесе бастапқы өсімдіктен генетикалық айырмашылықтары бар қосымша
сабақ апекстерінің пайда болуына әкеледі. Ондай жағдайда ортада ауксиннің
концентрациясын төмендетеді немесе оны тіпті қоспайды [21]. Апикальды
басымдылықтың деңгейі тұқым қуалаушы белгі болып табылады және өсімдіктің
әртүрлі мүшелеріндегі гормондық баланспен, фитогормондар тасымалымен,
трофикалық факторлармен байланысты. Қолтық өркенінің өсуін қоздыру үшін
апикальды өсуді тоқтату керек. Яғни, сабақ апексін алып тастау арқылы
немесе өсімдікті гормондық өңдеу арқылы жасауға болады. Апикальдық өсуі
әлсіз болып келген бұтақты және жартылай бұтақты өсімдіктер үшін бұтақшаны
бөлу тәсілдері әдеттегідей болып саналады. Ал, Виксон мен Тиманн
тәжірибелерінде бұршақ өсімдігіне апикальды өсуді, төбелік бүршікті алып
тастау арқылы жойылады. Көптеген жұмыстар арқылы цитокининдер синтезделетін
тамыр, әсіресе, тамыр ұштары. Сондықтан қолтық бүршіктерінің өсуі өсімдік
тамырының бар жоқтығына тікелей байланысты екендігі анықталды. Қолтық
бүршіктердің өсуінде тамырдың әсерін экзогенді цитокининдермен өңдеу
арқылы алмастыруға болады [2,3,16].
Өсімдікте тек негізгі өркен (сабақ) дамығанда, төбелік бүршікті кесіп
алып тастап, кесілген жерге ауксин қосқанда қалпына келеді. Кинетинмен
өңдегенде қайта жойылады. Р.Г.Бутенко қоректік ортаға енгізілген кинетин
апикальды өсуді жойып, рудбекия перилла бүршіктерін өсіруде көптеген қолтық
бүршіктерінің түзілуін болдыратынын көрсетті [2,3,5,6].
Тиманн мен Виксон теориясына сәйкес, өркен төбешігінің меристемалық
ұлпаларында түзілетін ауксин негізгі сабақ бойымен базипетальді
тасымалданады. Қажетті физиологиялық деңгейден көп мөлшерде жиналып қалса,
ауксин қолтық бүршіктерінің өсуін тежейді. Ауксиннің көп концентрациясының
әсерінен қолтық бүршіктеріндегі цитокининдер синтезі тоқтайды деген болжам
бар [25].
Қолтық бүршіктерінің өсуін қоздырып, қолтық өркендерін қолдану -
өсімдікті вегетативті көбейтудің қалыптасқан әдістерінің бірі.
Цитокининдердің физиологиялық әсері анықталып, оларды қолтық
өркендерін бәсеңдету әдісімен өсімдіктерді микрокөбейту үшін қолдану туралы
көптеген мәліметтер пайда бола бастады. Осылайша, клондық микрокөбейтуді
қолтық өркендерін белсендету арқылы жасалатын әдіс апикальдық өсуді немесе
негізгі өскінді жою, немесе көптеген қолтық өркендерін түзуді қоздыратын
цитокининдерді қоректік ортаға енгізу, кейде тіпті екеуін де байланыстыруға
негізделген. Барлық жағдайларда да дамыған өркендерді бір бірінен ажыратып,
қолтық өркендерінің бөлініп көбеюін және жоғары деңгейдегі өркендердің
түзілуін қоздыратын қоректік ортада қайтадан өсіреді [8,9,10].
БАП-тың 2,18-10,13 мкМ концентрациясы қарақат, жүзім, қара өрік
өркендерінің қолтық бүршіктерінің дамуын қоздырады. Авторлардың пікірі
бойынша, бір залалсыз күйде алынған өркен төбешігінен жылына бірнеше мың
өсімдік алуға болады [13,11,8].
Өсімдіктерді микрокөбейтуде негізгі мәселе қоректік ортаға
енгізілетін фитогормондар концентрациясы туралы болады. Мурасигенің
жұмыстарында цитокининдердің жоғары концентрациясы туралы мәліметтер бар.
Сонымен бірге, қоректік орта бойынша және қолтық бүршіктерінің дамуын
қоздыру үшін өсірудің жағдайлары туралы нұсқаулар беріледі.
Қазіргі кезде фитогормондардың концентрациясы алынатын өсімдіктердің
морфофизиологиялық ерекшеліктеріне және өсімдіктерді ұлпа культурасында
ұзақ уақыт бойы микрокөбейту мүмкіндігіне әсер ететіні туралы көптеген
мәліметтер бар. Қоректі ортада фитогормондардың концентрациясы жоғары
болса, отырғызылған экспланттаттардың көптеп өлуі байқалған.
Өркендерді өсіру процесінде ұлпаларда фитогормондар қажет
физиологиялық деңгейден артығырақ жиналып, олардың токсикалық әсері болады
[16,17].

1.4. Апикальды меристеманы өсіру
Соңғы кезде вирусы жоқ өсімдіктерді алу үшін апикальды меристеманы
өсіру, термоөңдеу, хемотерапия және вирустарды сарапқа салу қолданылуда.
Әдетте, вирустан құтылу үшін іn vitro жағдайындағы регенерант
өсімдіктерін алады. Олар инфекцияға шалдықпайды. Яғни, вирустар қоздыратын
аурулармен куресудің негізгі жолы, апикальды меристеманы өсіру [8,27,40].
Бұл әдістің негізін қалаған француз ғалымдары П. Лимассе мен П.
Корнуе. Олар көрсеткендей, теңбіл кеселді темекінің жапырақтарында
вирустың концентрациясы өсімдік бүршігінің апексіне (ұшына) жақындағанда
төмендеген. Өркен ұштарының, яғни, апикальды меристемалардың ұшындағы
бірнеше қабат клеткаларда вирус тіпті болмаған [8,3153,54].
Вирустардың меристема ұлпасында көбеймеуінің себептері жөнінде
әртүрлі пікірлер бар. Бір зерттеушілер болса, меристемада вирустардың
болмауын олардың бір клетка мен екінші клетка арасында баяу қозғалысымен
түсіндіреді. Себебі, меристемада өткізгіш жүйесі жоқ, ал плазмодесмалар
көлемі өте кішкене. Басқалар болса, бұл фактіні меристемаларға тән ерекше
вирустық нуклеопротеидтердің синтезін тежейтін метаболизммен түсіндіреді
[9,5]. Өсімдіктерді вирус ауруларынан сауықтыру мақсатымен апикальды
меристеманы өсіру әдісін бірінші пайдаланған 1952 жылы Г. Морель мен К.
Мартин болды. Олар бұл әдісті нағыз гүлді теңбіл вирусынан сауықтыру үшін
қолданған [48].
Аурудан таза, сауықтырылған өсімдіктері алудың тағы бір әдісі жылумен
өңдеу. Жылумен өңдегенде өсіп келе жатқан өркен ұштарында вирустың көбеюі
күшті тежеледі, сондықтан жаңадан пайда болған меристема клеткаларында
вирустың болмауы мүмкін. Жылумен өңдеу нәтижелі болу үшін донорлық
өсімдіктерді жоғары температурада (34-40оС) өсуге жақсы жағдай жасап
ұзағырақ ұстау қажет. Сол кезде жаңадан өсіп шыққан өркендердің ұштары
вирустан алас болады. Бірақ барлық өсімдіктер ұзақ мерзімді жылумен өңдеуге
шыдамайды. Кейде апикальды меристеманы өсіру үшін вирустық тесттер арқылы
сұрыптау тәсілдері де қоса қолданылады.

1.5. Клондық микрокөбейтуге әсер ететін факторлар
Клондық микрокөбейтуге әсер ететін факторлардың маңызы зор. Жалпы
алғанда in vitro жағдайында регенерацияның жылдамдығы: өсімдіктер
генотипіне өсімдіктер түрінің формасына; сорттары мен будандарына; эксплант
ретінде алынатын өсімдіктің мүшесіне; отырғызылатын қоректік ортаға;
жарықтың әсеріне, сонымен қатар температураның әсеріне де байланысты
болады.
Эксплант алынатын өсімдік неғұрлым жас болса, соғұрлым одан шыққан
өскіннің немесе каллустың регенерацияға қабілеті жоғары болады. Ювенильдік
кезеңдегі өсімдіктерден, яғни өскіндерден алынған каллустың морфогендік
потенциалы ең жоғары болады.
Экспланттың физиологиялық жасы каллуста өтетін морфогенез жолына әсер
етеді. Мысалы, Echeveria elegans жас жапырағының экспланттарынан өскен
каллустарда көбінесе тамырлар пайда болған, қартайған жапырақтарынан
өркендер, ал орта жастағы жапырақтан тамырлар мен өркендер пайда болған
[5,1].
Микрокөбейту үшін эксплант алынатын мүшенің де маңызы зор. Ең жақсысы,
егер эксплант ретінде меристемалық ұлпалар мен мүшелері, атап айтқанда:
өркеннің ұшы, қолтық бүршігі, меристема пайдаланса, in vitro жағдайында
олар жақсы өседі және тотипотенттігі жақсы болады.
Жеміс-жидек өсімдіктерін in vitro жағдайына енгізу эксплант көлеміне
байланысты. Егер эксплант көлемі 0,3-0,5 мм аралығында болса, оның
регенерациялану қабілеттігі өте жоғары болады. Ал эксплант көлемі 0,2-0,3
мм аралығында болса, экспланттың регенерациялану қабілеттілігі өте төмен
болады[2,3,8,9].
Микрокөбейтуде қоректік ортаның орны ерекше. Қоректік ортаның
құрамына, оған қосылған фитогормондардың деңгейіне байланысты өсімдік
ұлпаларының әрбір сортқа, түрге тән морфогентикалық өзгерістер болатыны
белгілі.
Егер де микрокөбейту қолтық бүршіктерін өсіру арқылы өткізілсе,
каллустың пайда болуы өзгереді. Сондықтан бұл әдіске каллус түзілуін
тежейтін басқа қоректік орталары қолайлы келеді. Микрокөбейтудің бірінші
кезеңінде қоректік ортаға антиоксиданттар жиі қосылады, олар гидролиз
өткізетін ферменттердің белсенділігін тежейді, демек эксплантты сақтап
қалады. Антиоксидант ретінде цистеин, глутатион, меркаптоэтанол, аскорбин
қышқылы қолданылады
Қоректік орта минералдық негізгі немесе сұйылтылған МС ортасы
ауксиндермен толықтырылады. Кей кезде тамырлануды жиілету үшін ауксинді
ортаға қоспай өркендердің өздерін онымен өңдейді.
Өсімдіктерге ең жақсы температура шамамен 25ºС. Бірақ әрбір түрдің
табиғатта температураға тәуелділігін еске алу керек. Мысалы, пиязшықты
өсімдіктер үшін табиғатта ең жақсы температура 18ºС болса, монстера үшін
-30ºС болады.
Жеміс-жидек өсімдіктерін in vitro жағдайында өсіргенде күн ұзақтығы
-16 сағат, жарықталу - 4000-5000 лк, жарық көзі – ЛДЦ 40 типтік
люминесценттік лампалар, күндізгі температура – 22-26ºС, түнгі – 18-21ºС
болады [17].

1.6. Жеміс-жидек өсімдіктерін клондық микрокөбейту.
Қазіргі таңда, асептикалық in vitro жағдайында өсімдік ұлпаларын
өсірудің соңғы биотехнологиялық әдістері таңқурай, қара қарақат, сияқты
көптеген жеміс-жидек өсімдіктерін зиянкес аурулардан арылту және көбейту
үшін кеңінен қолданылуда.
Қоректік ортаның құрамына, оған қосылған фитогормондардың деңгейіне
байланысты өсімдік ұлпаларының әрбір сортқа, түрге тән морфогенетикалық
өзгерістер болатыны белгілі. Жеміс-жидек өсімдіктерін in vitro жағдайда
меристемамен көбейтуде көбінде Мурасиге-Скугтың макро- және
микроэлементтері бойынша модификацияланған орталарын қолданамыз. Қоректік
орта құрамы Мурасиге-Скуг бойынша минералды тұздар, 0,5мгл В1,В6, РР
витаминдері, С- 1,0мгл, глюкоза- 30гл, агар- 5,5гл болады[16,12].
Алғашқы экспланттар ретінде термотерапиядан өткен, өсімдік
өскіндерінен бөлініп алынған 0,25-0,5мм көлемді меристемалық төбешіктер
қолданылады.
Жеміс-жидек өсімдігін in vitro жағдайға енгізу эксплант көлеміне
байланысты. Егер эксплант көлемі 0,3-0,5 мм болса, оның регенерациялану
қабілеттілігі өте жоғары болады. Ал эксплант көлемі 0,2-0,3 мм аралығында
болса, экспланттың регенерациялану қабілеттілігі өте төмен болады[2,3].
Эксплантты ортаға енгізуде қоректік ортада тіршілік ете алатын
жағдайын жасау, яғни, цитокини заттарын қосу және оларды өсуін қадағалау
керек.
Эксплантты тамырландыру кезеңінің алдында ұзақ өсіру фазасын енгізу
қажет. Ол үшін БАП-0,1 мгл бар отаға отырғызамыз. Мұндай концентрацияда
экснланттардың қалыпты пролиферациясы жүзеге асады. Жекеленген меристемалық
төбешіктер бірнеше ай бойы жапырақты түзеді. Ортаны ауыстырған соң
экспланттар 3-6 мм ұзындықтағы өскіндер береді. Өскіндер әр 3-4 апта сайын
өткізген 2-3 пассаждан кейін 1-3 см-лік ұзындықта болады. Ортаның жаңалану
эффектісі өте айқын көрініп тұрады. Бұл уақытта жекеленген өркендердің
жапырақтарының қолтықтарында бүйірлік өркендерден шыққан бүршіктер пайда
бола бастайды. Ал кейбір экспланттарда жапырағы қоректік ортаға тура
жанасып қалса, жапырақтың ортасында бүршіктердің пайда болуы байқалады. Бұл
бүршіктерді бөліп алып, жаңа қоректік ортаға ауыстырған соң, олардан
өркендердің түзілуі байқалады. Жапырақ бүршіктерінен шыққан өркендердің
бүйірлік бүршіктің өркендерінен еш айырмашылығы болмайды. Бүршіктердің
тікелей жапырақта пайда болуы БАП-тың меристемалық белсенділігі бар
ұлпаларға (камбийлі) морфогенетикалық әсерінің нәтижесінде болуы мүмкін.
Алғашқы екі-үш пассаждан кейін БАП концентрациясын 3 мгл дейін көбейту
қосымша бүршіктердің жаппай өсуіне әкеледі. Бірақ, бұл кезде негізгі
өркендердің өсу жылдамдығы еш азаймайды. Осылайша, өркен саны геометриялық
прогрессиямен өседі. Бұл кезде тек сорттық ерекшеліктері көрінеді. Олар
қосымша жарып шыққан бүршіктер саны мен өркендер саны бойынша сорттық
ерекшеліктер.
Меристемалық төбешіктерді бөліп алған соң бірден құрамында 1 мгл ден көп
концентрацияда БАП бар ортаға салу олардың ұсқынсыз дамуына әкеледі. Мұндай
ортада жекеленген меристемалық төбешіктер өскін бермейді, олардың түбі
қаптап өсіп кетеді, экспланттар шар тәрізді болып, дамуға қабілетін
жоғалтады. БАП концентрациясын жоғарылату тек қана нақты құрылымы бар
мүшелерге жақсы әсер етуі мүмкін. Сонда да, өсіру барысында
эксплантаттардың бейімделуін, меристемалық төбешіктер мен өркендердің
ортаға енгізілген препаратқа әртүрлі сезімталдығын да жоққа шығаруға
болмайды [18].
Жекеленген меристемалық төбешіктерден қарақат алудың әдісін
өңдеудің келесі кезеңі - алынған өркендердің эффективті өсу жағдайларын
өңдеу. Меристемалық төбешіктерге арналған 0,05-0,1 мгл концентрацияда
индолилмай қышқылын (ИМҚ) қолданудың тиімділігі аз болды. Қарақат
өркендерінің тамырлануы үшін темір хелаты көп, ИМҚ - 2,5 мгл болатын
Мурасиге-Скуг негізіндегі ортаның 2 есе сұйылтылған түрі тура келеді .
Мұндай орта бірнеше рет қайталанса, өркендердің тамырлануын 70-100%-ға
көтереді екен. Қарақаттың тамырланған пробиркалық өсімдігі ары қарай дамуы
үшін залалсызданған субстратқа (31 қатынастағы торф пен құм қоспасы)
отырғызылады. Ол жерде олар вирустық инфекцияның бар-жоқтығын тексеру
мүмкін болатын көлемге дейін өсіріледі [19].
БАП бар ортада дамыған өркендер меристемалық төбешіктерге қарағанда
жұмыста ыңғайлылау құрылымдар болып табылады. Оларды қолданып өсімдік алу
оңайырақ. Бұл туралы 20 мгл концентрациядағы ИМҚ ерітіндісімен өңдеген
соң, қоректік ортадан алынған өркендерді тікелей топырақ субстраттарында
тамырландыру дәлел бола алады [20,5].
Қарақат эксплантының пролиферациясын БАП күшейтеді. БАП-тың 0,5-1мгл
концентрацияда меристемалық төбешіктердің дамуын күшейтеді. БАП-тың
концентрациясын 1,5 мгл көбейткенде қосымша бүршіктер пайда болып,
төбешігі өседі.
Зерттеу жұмыстары 1977-2006 жылдары арлығында И.В Мичурин атындағы
Мичуринск аграрлы университетінде ВНИИ жемісті өсімдіктерді гентика және
селекциялық бағыттағы жұмыстар жүргізілген. Бұл жұмыстардағы зерттеу
материалдары ретінде қара өрік гибридінің алыс екі туыс өкілдерін
зерттеген.
Біріншілік экспланттардың (меристемалардың ұштарын, жапырақтары)
өсімдіктің жер асты мүшелерінен келесі стерилизация мен оқшауландырады.
Ары қарай ұлпа культурасы бойынша жүргізілген эксперименттерде in
vitro жағдайындағы клональды микрокөбейту жолымен алынған өсімдіктер
таңдалынып алынды.
Арнайы тәжірибелерде температураның қарама-қарсы әрекетін және алғашқы
культурадағы ұлпалардың қараңғы әр түрлі экспозициядағы және морфогенезге
температураның әсерін бақылау. Осматикалық қысымның өзгеруі үшін қоректік
ортаға глюкозаның жоғарғы концентрациясы 60-90 гл мөлшерін қосқан.
Қоректік ортаның қараюының тамырға әсерін зерттеу барысында 0,01-0,05%
концентрациялы метилді көк реактивін қолданған. Селекциялық ұлпа
тәжірибесінде тұзға тұрақтандыру үшін культурлы ортаға NaCl 0,25 0,5 1,0
1,5% концентрациясын енгізеді [23,25].

1.8. Аса бағалы жидек өсімдіктерін in vitro жағдайына енгізіп көбейту.

Аса бағалы ... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.