Астық тұқымдастар дәндері амилазаларының қасиеттері мен ерекшеліктері

Жұмыс түрі: Курстық жұмыс
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 30 бет
Таңдаулыға:

ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ БІЛІМ ЖӘНЕ
ҒЫЛЫМ МИНИСТРЛІГІ

ӘЛ-ФАРАБИ АТЫНДАҒЫ ҚАЗАҚ ҰЛТТЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ

Биология факультеті

Биотехнология, биохимия, өсімдіктер физиологиясы кафедрасы

Бітіру жұмысы

БИДАЙ ТҰҚЫМДАРЫНДАҒЫ АМИЛАЗАНЫҢ МОЛЕКУЛАЛЫҚ ФОРМАСЫН ЗЕРТТЕУ

Орындаған 4 курс студенті________________________ Балтабекова М.Ж.
(қолы, күні)

Ғылыми жетекшісі
б.ғ.д., профессор. ________________________________ Кенжебаева С.С.
(қолы, күні)

М.Ә. Айтхожин ат. МБ және БИ,
Астық тұқымдастар биохимиясы
лабораториясының меңгерушісі,
б.ғ.к., _______________________________ Хакимжанов
А.А.
(қолы, күні)

Норма бақылаушы
б.ғ.к., ассистент__________________________ ___________ Оразова С.Б.
(қолы, күні)

Кафедра меңгерушісінің
рұқсатымен қорғауға жіберілді
б.ғ.д., профессор ___________________________________ _ Карпенюк Т.А.
(қолы, күні)

Алматы, 2010
МАЗМҰНЫ

КІРІСПЕ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 3

1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .4
1.1 Бидай амилазаларының биологиялық
маңызы ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ..4
1.2 Бидай амилазасы және нан сапасы ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..5
1.3 Астық тұқымдастар дәндері амилазаларының қасиеттері мен
ерекшеліктері ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .7
1.4 (-амилаза изоферменттерінің құрылымдық-функционалдық
ерекшеліктері ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ...9
5. Тұқымдағы (-амилаза синтезінің локализациясы ... ... ... ... ... ... ... ... ..11
6. (-амилазаның биосинтезі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .12

1.7 Амилаза белсенділігінің түрлі факторлар әсерінен өзгеруі
1.7.1 Температураның әсері ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..13
1.7.2 Бидай ұрықтарының тыныштық пен өну процестерін фитогормональды
реттеу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..14
1.7.3 ГҚ, АБҚ гормондарының және қанттардың алейрон қабаты мен ұрық
щитогындағы α- және β-амилазаларының индукциясына әсері ... ... ... ... ... ..15
1.7.4 Амилазалар реттелуінің басқа жолдары ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 15
1.8 Амилазаның молекулалық түрлерін зерттеу
1.8.1 β-амилаза белсенділігінің дамуы мен бидайдың өніп жатқан өркен
ұлпаларындағы полиморфизм ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..17
1.8.2 Дамып жатқан бидай дәндеріндегі екі антигендік ерекше β-амилазаларды
анықтау мен сипаттау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ...18
1.8.3 Бидайдың β-амилазаcының изозимдік әртүрлілігі ... ... ... ... ... ... ... ...18

2. ЗЕРТТЕУ ОБЪЕКТІСІ ЖӘНЕ ӘДІСТЕРІ
2.1Зерттеу
объектісі ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ..19
2.2 Амилаза белсенділігін анықтау әдістері
2.2.1 Йод крахмалды
әдіс ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ..19
2.2.2 Электрофорез
әдісі ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... 19
2.2.3
Изоэлектрофокустау ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ...19

3 ЗЕРТТЕУ НӘТИЖЕЛЕР ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛДАУ
3.1 Бидайдың тыныштықтағы дәндегі компоненттік құрамы мен α- және β-
амилазаларының изоферменттік құрамының белсенділігі мен өзгерісінің
динамикасын зерттеу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 20
2. Амилаза активтілігіне фитогормондар мен әр түрлі қанттар әсерін
зерттеу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .23

ҚОРЫТЫНДЫ
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ..26

ПАЙДАЛАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР
ТІЗІМІ ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ... 27

КІРІСПЕ

Амилаза (amylum - крахмал) – крахмал, гликоген және олардың толық емес
ыдырау өнімдерінің (декстриндер мен олигосахаридтер) гидролизін көміртектің
1-ші және 4-ші атомдары арасындағы глюкозидті байланыстарын ыдырату жолымен
катализдейтін ферменттер. Көмірсулар катаболизмінің негізгі ферменттері
болып табылады. Полисахаридтерге әсер ету сипаты бойынша α-, β-, γ-
амилазалар: α-амилазалар жануарлар, өсімдіктер және микроорганизмдерде
кездеседі, оның әсерінен полисахаридтер олигосахаридтерге дейін ыдырайды,
оның қатысуымен жүретін реакцияларында негізінен декстриндер түзіледі. α-
амилаза әлсіз қышқыл қасиеттерге ие. Са2+ пен Cl- оны белсендіреді. β-
амилазалар жоғарғы өсімдіктерге тән, полисахаридтер молекулаларының сыртқы
тізбектерінен мальтоза дисахаридін бөліп тастайды (отщепляет), яғни
мальтозаның және үлкенмолекулярлы декстриндердің түзілуін катализдейді, γ-
амилазалар – глюкоза моносахаридін алып тастайды. Әдетте полисахаридтер
гидролизі әр түрлі амилазалардың біруақытты қатысуымен жүреді. Арпа өніп,
өсіп шыққан тұқымдарының вытяжкасы әсерімен крахмалдың қанттануын
(амилазалардың ферментативті әсері) алғаш рет орыс академигі К.С. Кирхгоф
(1814) бейнелеген [1]. Француз ғалымдары А. Пайен мен Ж. Персомен [1] солод
вытяжкасынан бөлініп алынған амилазалардың тазаланбаған комплексі – диастаз
ферментативті препараттың алғашқысы болды. Кейбір амилазалар кристалды
түрде алынған. Амилазалар ағзалардың әр түрлерінде спецификалық болып
келеді. Олардың физиологиялық рөлі клеткалардағы полисахаридтер қорының
мобилизациясы (мысалы, тұқымның өнуі кезінде) болып табылады. Ас қорыту
процесі кезінде де олардың маңызы зор: амилазалар адамның және жануарлардың
сілекейі мен ұйқы безі шырынында болады. Микроорганизмдер крахмалды
пайдаланып, амилазаны сыртқа шығарады. Спирт пен нан пісіру өндірісіндегі
крахмал заторларын қанттандыру үшін зең саңырауқұлақтары мен бактериялардан
алынатын α-амилазалар қолданылады; крахмалдан глюкоза өндірісінде
глюкоамилаза препараттары қолданылады [1].
Экзо- немесе β-амилаза бидай, арпа сияқты астық тұқымдастарының өніп
жатқан тұқымдарының негізгі крахмал ыдыратушы потенциалын құрайды. Пісіп
жетілген тұқымдағы энзимнің алғы заты көбінесе өну кезіндегі ерігіш,
белсенді гидролаза сияқты байланысқан зимогенді формадан бөлініп алынды
[2]. Крахмал деполяризация реакцияларының инициациясына жауапты болып
есептелетін α-амилазаның синтезімен параллельді β-амилаза өніп жатқан
дәндерде орын алатын крахмалдың үлкен ыдырауында маңызды синергисттік рөл
ойнайды деп күтілуде. Дегенмен, β-амилаза белсенділігінің бұл процесс үшін
маңыздылығы немесе қажеттілігі әлі анық емес. β-амилаза белсенділігі
бойынша жоғары дефицитті арпа дәндері эффективтірек дамыды [2] және арпаның
кейбір жабайы линияларында өнуші тұқымдарында β-амилаза белсенділіктері
онша маңызды болған жоқ. Арпа дәндері β-амилазасы in vitro-да крахмал
гранулаларының гидролизінде де маңызды үлес қоспайтыны туралы қорытындыға
әкеледі [2].
1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ

1.1 Бидай амилазаларының биологиялық маңызы
Амилазалар – көмірсулар метаболизмінің ең маңызды ферменттері –
жоғарғы өсімдіктерде кеңінен таралған, әсіресе астық тұқымдастарда көп
кездеседі. Бұл ферменттер қор полисахариді – крахмалды ыдыратып, оны
клетканың тіршілік процестеріне қатысатын жеңіл сіңетін қанттарға
айналдырады. Амилазаның пісіп жетілудегі және әсіресе өсімдіктің
тұқымдарының өнуіндегі биологиялық маңызы ерекше зор. Сонымен бірге тамақ
өндірісіндегі технологиялық процестердің бірқатары өзінің негізінде астық
тұқымдастарының бұл ферменттерінің әсерінен крахмалдың гидролитикалық
айналуына ие.
Өніп жатқан дәндегі биохимиялық процестердің негізгі бағыты
эндоспермде жинақталған жоғарымолекулалық қосылыстардың интенсивті
гидролизі, оларды дамып жатқан өркенге қол жетімді еріген қалыпқа айналдыру
болып табылады. Сонымен бірге тұқымның тыныс алудағы газалмасу жоғарылайды.
Өніп жатқан дәнге тән ерекшеліктердің бірі өнудің көзге көрінетін
белгілердің пайда болуына дейін жиі байқалатын барлық гидролазалар мен
оксидоредуктазалардың белсендіктерінің жоғарылауы болып табылады. Бұл
ерекшеліктермен өнген бидайдың біріншіден нан пісу мен технологиялық
қасиеттерінің өзгеруі анықталады.
Астық тұқымдастарындағы амилаза белсенділігінің өзгеруіне маңызды
көңіл бөлінді. Бұл классикалық болып кеткен А. И. Опарин (1945) мен А. И.
Бахтың (1950) зерттеулері.
Соңғы кезде орындалған жұмыста белсенді α-амилазасы жоқ дәндердің
өнуге қабілеттілігі мүлдем болмайтыны көрсетілді β-амилазаның α-амилазаға
қарағанда дән өнуіндегі рөлі төменірек. Бұл түсінікті де, өйткені α-амилаза
гидролизінің өнімдері өркен ұлпаларының түзілуіне кететін қарапайым қанттар
да болуы мүмкін. Өніп жатқан және дамып жатқан дәндегі, күріштің әр түрлі
популяцияларының корешоктарында амилаза белсенділігінің динамикасын
зерттегенде өсімдіктердің ұзындығы мен бұл ферменттердің белсенділіктері
арасындағы корреляциясы анықталды. Күріш, бидай және тритикале үшін амилаза
белсенділігі мен пісіп жатқан дәннің арасындағы кері байланыс дәлелденді.
Дәндердің өну қабілеттілігінің жоғалтуының негізгі себебі ұзақ
сақталу болып табылады. Тритикале мен жүгері дәндерінде ұзақ сақтау α- мен
β-амилазаларының инактивациясына көмектесетіні анықталған. Бұл
көрсеткіштердің арасында анық кері байланыс көрсетілген, сақтау мерзімі
қаншалықты көп болса, дәннің амилаза белсенділігі мен тіршілік
қабілеттілігі соншалықты аз болады.
Дәннің биологиялық сапасының, оның тіршілікке қабілеттілігінің
құрылуындағы амилолитикалық ферменттердің, әсіресе α-амилазаның үлкен рөлі
анық көрінеді.

1.2 Бидай амилазасы және нан сапасы
Бидай амилазалары қамыртану мен нан пісіру процесінде айрықша маңызға
ие. Қамыр ашудың алғашқы этаптарында ашытқылар ұндағы бар қанттарды ашытады
деп саналады. Дегенмен, процесс соңына дейін жүру үшін олар жеткіліксіз.
Бұнда негізгі рөлге амилазалардың крахмал гранулаларына әсерінен түзілетін
мальтоза ие. Егер ұн төмен амилолитикалық белсенділікке ие болатын болса,
ұнда мальтозаның жеткілікті мөлшері болмайды, ашу қажет болғандай
интенсивті өтпейді, нан тығыз жұмсағымен, солғын түсті қыртыспен, яғни төмн
сапалы болып шығады.
Қазақстан аудандарының бірқатарында өсірілген бидай дәндеріне α-
амилазаның тамырда өніп кетуіне байланысты жоғары белсенділігі жиірек тән
болады. Бұл үлгілердің дәндерінен шикіпісірілген жабысқақ жұмсағы бар,
төмен қасиетке ие нан алынады. Жоғары және өте жоғары амилаза белсенділігі
өнім қалыптасуына қолайсыз жылдары, әсіресе Батыс Еуропа мен Ұлыбританияның
климаттық жағдайларында, сонымен қатар Қазақстанның орталық, Солтүстік және
Шығыс аудандарында алынған бидайға тән. Пісіп жетіліп жатқан бидайдағы
амилазаның шектен тыс жоғары белсенділігі пісіп жетілу амилазасымен
шартталған және тамырдағы өну эффектісімен байланысты. Солтүстік-Батыс
Еуропаның бірқатар елдерінде өнімнің жинау алдындағы өнуден қарабидай мен
бидай дәндері сапасының төмендеуінен тиетін зиян өнімнің жартысына жуық
жоғалтуына тең. Қазақстанның жаңбыр деңгейі жоғары аудандарда және
сақтаудың қолайсыз жағдайларында жиі пісіп жетілу периодының соңында дәннің
колоста өнуі байқалады.
Бұндай дәннен жасалатын ұнның нан пісіру қасиеттерінің төмендеуінің
тура себебі – өну α-амилазасының және кейбір протеиназалардың
формаларының синтезі. Дәннің жетілу периодындағы жоғарғы ылғалдылық бұл
изоферменттер типінің синтезін бақылайтын гендердің белсенділігіне әкеледі.
Декстриндер мен қанттардың жоғары құрамына әкелетін крахмал гранулаларының
белсенді гидролизі жүреді, ал бұл нан жұмсағының тәттілеу дәмі мен жабысқақ
консистенциясын түсіндіреді. Өну α-амилазасы астық тұқымдастар сорттарын
жинау алдындағы өнуге тұрақтылығын бағалайтын өте ыңғайлы тест болды. Бұл
бағыттағы жақсы зерттеулер Швецияда Дж.Мак-Кеймен жасалды. Сорттардың жинау
алдындағы өнуге тұрақтылығы генетикалық шартталғаны екені анықталған және
де бұл осы белгіге бағытталған селекцияны жүргізуге мүмкіндік береді.
Қазіргі кезде жинау алдындағы өнуге тұрақтылыққа селекция құрылған
бастапқы материалды бағалаудың тез және сенімді әдістер арқасында
эффективті болды. Әдістер негізінде – дәннің тыныштық пен α-амилазаның
белсенділік фазалардың арасындағы байланыс. Технологиялық лабораториялар
практикасындағы амилаза белсенділігін бағалаудың жанама әдісі кеңінен
таралған – инкубатпен толтырылған цилиндр бойымен поршеньнің түсу
жылдамдығы арқылы. Түсу санының көрсеткіштері ұн суспензиясы
тұтқырлығының төмендеу жылдамдығына тәуелді және α-амилазаның
белсенділігімен корреляцияланады. α-амилазаның белсенділігі мен түсу саны
арасындағы Хагберг бойынша корреляцияны бірқатар ғалымдар зерттеген. Түсу
саны мен α-амилаза белсенділігі арасында корреляцияның сорттық
спецификалығы көрсетілді. α-амилаза белсенділігі мен тамырдағы өнуге
тұрақтылық арасындағы корреляция бойынша жеткілікті деректер жиналды. Өнуге
тұрақтылықты шарттайтын генотиптік айырмашылықтар ең алдымен үлгінің
гиббереллин қышқылына сезімталдығымен бейнеленеді. Бұл зерттеулер өнуге
тұрақтылыққа селекцияны өткізуге мүмкіндік берді. Бидайдың тұрақты және
тұрақсыз формаларын будандыстарғанда төмен α-амилаза белсенділігі
доминантты белгі болып табылады. Соңғы жағдай М.Д.Джейл Ұлыбританияда
өсірілетін бидай үлгілерінде өткізген зерттеулер дәлелдейді. Жинау
алдындағы өнуге ұшыраған дәннің гидротермиялық өңдеу α-амилазаны біршама
басуға мүмкіндік береді. α-амилаза белсенділігін басудың бір жолы бұл
белоктың трансляциясының ингибиторы болып қызмет атқаратын абсциз қышқылын
енізу болып табылады. Сонымен бірге абсциз қышқылы өзінің әсерімен
аллостериялық ингибиторларға ұқсас келеді деген пікір де айтылады, α-
амилаза белсенділігінің толқулары дәннің дамуының түрлі стадияларындағы
фермент, абсциз қышқылы мен крахмалдың өзара әсерлесуінің түрлі
кезектіліктің нәтижесі болуы мүмкін. Хобулин қышқылы мен таратанниннің α-
амилаза синтезіне әсерін зерттеу дубильді заттарды гиббереллиндермен
индуцирленген белсенділіктің табиғи реттегіштері ретінде қарастыруға
мүмкіндік береді.
Түсу санының нан көлеміне әсерін зерттеп, Р. Олеред нан көлемі
түсу саны мәнінің 150сек-тан төмен азаюымен азаяды да, бұл қамырдың
физикалық қасиеттерінің өзгеруіне әкеледі. Дж.Кругер мен К.Типплес
амилограммалар сияқты түсу санының көрсеткіштері де бидай дәнінің α-
амилаза белсенділігінің деңгейін сипаттай алады деген қорытынды жасады.
Селекция-генетикалық және биотехнологиялық мақсаттарға α-амилазаның
тез және нақты анықтаудың үлкен маңызымен байланысты жеткілікті сенімді
деректерді алуға мүмкіндік беретін әдістер құрылуда. Түсу санының 240-тан
460сек-қа дейінгі мәні бар дәннің α-амилазасын анықтау үшін анализатор
құрылды. Жинау алдындағы өнудің мәселесі фермент синтезінің индукциясымен
ғана емес, сонымен қатар піспеген тұқымдардағы қалдық белсенділікпен, яғни
латентизация процесінің бұзылуымен де шартталады.
Келтірілген әдебиет деректерінен шетелде астық тұқымдастарының
дәнінен жасалатын өнімдердің сапасына жоғарғы амилаза белсенділігінің
зиянды әсерін алдын алу әдістерді құру бойынша интенсивті биохимиялық,
биотехнологиялық, технологиялық және селекциялық зерттеулер өткізіліп
жатқаны айқын көрінеді. Өкінішке орай, біздің елде қазіргі уақытқа дейін
бұл мәселеге жеткілікті назар аударылмады.
Әдебиетке шолу деректері астық тұқымдастары амилазаларының
қасиеттері, ерекшеліктері және реттелуіне берілген маңызды көрсетеді. Бұл
зерттеулерді өткізудің тәжірибелік қажеттілігі көрсетілді. Ерекше назар дау
туғызатын және аз зерттелген мәселелерге аударылған. Төменде келтірілген
эксперименталды материал олардың кейбіреуін көрсетеді, бұл өз кезегінде осы
зерттеуді өткізудің өзектілігі мен қажеттілігін негіздейді [3].

1.3 Астық тұқымдастар дәндері амилазаларының қасиеттері мен
ерекшеліктері
Амилазалар декстриндер мен қанттардың түзілуімен жүретін крахмал
гранулаларын ыдырататын тұқымның негізгі биокатализаторлары болып табылады.
Бұндағы басты рөлге крахмалдың нативті гранулаларын ыдырату қабілеті бар α-
амилаза (1,4-глюкан-4- глюкогидролаза) ие. α -амилазалық гидролиздің
өнімдері β-(1,4-глюкан-мальтогидролаза) мен γ-амилазалар әсерінен қарапайым
қанттарға айналады. Гидролазалардың бұл тобына көңіл бөлушілік
ферменттердің тұқым сапасының биологиялық және технологиялық бағалау
көрсеткіштерінің қалыптасуындағы маңызымен байланысты.
Крахмал гидролазаларының активтілігі ұрықта орын алмайды, ол өніп
жатқан тұқымның перикарпында, крахмалды бөлігі – эндоспермде, алейрон
қабатында, щитогында шоғырланған. Тыныштықтағы тұқымда β-амилаза щиток пен
алейрон қабатымен бірге белоктық денешіктерде бидай дәнінің қор белоктар
кешенімен бірге орналасады. Егер тыныштықтағы тұқымның β-амилазасы
анатомиялық бөліктерінің барлығында (ұрықтан басқа) орналасса, ά-амилаза
эндосперм бөлігінде табылмаған. Оның өніп жатқан тұқымдағы негізгі синтез
орны – щиток пен алейрон, процесс щитокта басталып (суға салып қойғаннан
кейін 2-6сағаттан кейін), одан кейін алейронға орын ауыстырады. β-амилаза,
щитокта синтезделіп, пісіп жетілу кезінде түзілген және крахмал гранулалары
мен белоктық денешіктермен ассоцияланған ферменті бар эндоспермге
секреттеледі.
Бидай тұқымындағы крахмал гидролазалары алейрон қабаты клеткаларында
орналасып, жануарлар ұлпаларының лизосомалары сияқты мембранды қоршауға
алынған. Бидайдан бөлініп алынған α -амилазаның 80%-ынан артық, ал арпаның
– 50%-ынан артық белсенділігі центрифугалаудың жоғары жылдамдығында тұнатын
алейронның клеткалық фракциясымен байланысты екені анықталды. Ферменті бар
мембраналық органеллалар (лизосомалар) эндоплазмалық ретикулуммен
ассоцияланғаны көрінеді. Бұл жүйе - α -амилаза мен протеаза сияқты
гидролитикалық ферменттердің синтезі мен қорының орны деп тжырымдалады.
Соңғы жылдары α -амилаза синтезінің механизмдеріне аса үлкен көңіл
бөлінуде. Бұл ферменттің тұқымның қалыптасуындағы үлкен рөліне байланысты.
Т. Okyta қызметкерлерімен [4] бар деректерді біріктіріп, α -амилазаның
молекулалық салмағы секреттелетін формадан 1,5кДа-ға артық алғы заты бар
деген дабылды гипотезаны ұсынды. Алғы заты ретіндегі экстрасегмент
(дабыл) рибосомалардың ретикулум мембранасымен байланысуына және фермент
транспортына көмектеседі(способствует). Амилаза алғы затының күріш
щитогының микросомаларында түзіледі. Алғы заттың ыдырауы мен оның
гликолизденуі жүреді. Арпаның алейрон қабаты клеткаларынан α-амилаза
синтезі үшін поли(А)-бай мРНҚ-матрица бөлінген. Сонымен қатар мРНҚ-ның
молекулалық массасы анықталған – 5,8х102кД және бидай ұрығы мен
ретикулоциттер лизаттарынан тұратын жүйелердегі оның жұмыс істеу
қабілеттілігі көрсетілген. Бидай тұқымдарының α -амилазалары үшін мРНҚ
мембранды байланысқан тотальды фракциясынан in vitro синтезделген α
-амилазаға антиденелермен иммунопреципитациясымен бөлініп алынған. α
-амилаздық мРНҚ РНҚ-ң жалпы мөлшерінен 5-10% құрады, оның молекулалық
массасы 5,х102кД. Астық тұқымдастары α-амилазасы биосинтезінің негізгі
индукторы гиббереллин қышқылы болып табылады.
Осылайша, келтірілген әдебиетке шолудан астық тұқымдастар дәндерін-
де α -амилазаның үш түрі бар екені көрінеді: синтезделетін, секреттелетін
және латентті (немесе латенттіден активтенетін). Бидайдың пісіп жетілу
кезеңіндегі ферменттің латентизация мен оның өну процесіндегі активациясы
механизмдері аз зерттелген. Жоғарыда айтылып кеткендей, астық тұқымдастар
дәндеріне мембраналық құрылымдарымен әсерлесуі кезінде оның инактивациясы
тән. Одан басқа, бидай дәндерінде фермент активтілігін реттеуге арналған α
-амилазаның жоғары спецификалық белоктық ингиби- торлары бар екені
анықталды. Бұл белок өте жоғары спецификалыққа ие – басқа астық тұқымдастар
амлазаларын тежемейді. Оның синтезі абсцисс қышқылы бақылауында екені
анықталды. Гиббереллин қышқылы ά-амилазаның синтезін активтендіріп,
ингибитордың жаңадан түзілуін тежеген. Ингибитор-белогы алейрон қабатында
орналасады. Дамып жатқан бидай дәндерінде α -амилаздық белсенділігін
реттеудегі ингибитор белогының маңызды рөлі анықталды.
Бидай мен тритикале дәндеріндегі α-амилаза молекулалары құрылымында
ферменттің крахмал гранулаларымен ассоциациясына жауап беретін байланысу
орталығы бар. Егер ол мөлшері жағынан мальтотиозадан үлкен декстриндер
немесе олигосахаридтеріне толы болса, фермент ерігіш крахмалдың гидролизіне
бастапқы қабілеттілігін сақтайды, бірақ полисахаридтің нативті
гранулаларымен байланыспайды және оларды гидролиздемейді. Бұндай орталықтар
пісіп жетілу де, өну де α-амилазаларына тән. Келтірілген деректер
дәндердегі амилаздық белсенділікті реттеу механизмдерінің көптүрлілігі
туралы куәләйды.
α- мен β-амилазалардың функционалды және молекулярлы гетерогенділігі
туралы сұрақ ерекше көңіл аудартады. Арпа, ячмень, бидай α -амилазасы
компоненттерінің қасиеттерін зерттегенде, шын α - мен β-амилазалардың
арасында аралық қасиеттерге ие ферменттердің өзіндік тобы бар деген
қорытындыға келуге болады. Жоғарыда белгіленгендей, өніп жатқан бидай
дәндерінде пісіп жетілу және өну α-амилазасын айырады. Өну
амилазалары – термотұрақты, жоғары активті ферменттер, ал пісіп жетілу
амилазалары термолабильдірек, әлсіз гидролитикалық қабілеттілікке ие.
Біріншілері (amy-1) 6-шы хромосома локустарымен, ал екіншілері (amy-2) – 7
–ші хромосомамен бақыланатыны көрсетілген. Амилазалардың бұл топтары әр
түрлі сорбталады және крахмал гранулаларын да әр түрлі гидролиздейді. Amy-
1мен amy-2 бидай дәнінен табылған GIII пен GI-ге сәйкес келеді. Үшінші топ
(GII) дәннің даму процесінде пайда болатын және GIII пен GI-дің
изоэлектрикалық нүкте мәндері арасында аралық нүктелерге ие изоферменттер
болып табылады. Бұл топтардың генетикалық детерминанттылығы бірдей емес
және синтез деңгейіндегі активтіліктіліктерінің айырылатын реттеу жүйелері
бар. α -амилаза изоферменттерінің үш тобы бар.
Пісіп жетілу мен өну амилазалары өз қасиеттері бойынша
ерекшеленеді. Ферменттің бірінші түрі тасымалдағышпен (ионалмастырушы
хроматография) әлсіз байланысады және ацетат буферінің төмен концентрациясы
кезінде α-пик ретінде элюирленеді. Өну α-амилазаның компонеттер тобы
буфердің әлдеқайда үлкен иондық күшінде элюирленеді. Ионалмастырушы
хроматография әдісі α -амилаза компоненттерінің функционалды әр түрлі
топтарын бөліп алуға мүмкіндік береді [4].

1.4 (-амилаза изоферменттерінің құрылымдық-функционалдық ерекшеліктері

Ферменттер гетерогендiлiгi табиғатта кең тараған құбылыс. Егер
өсiмдiктердегi ферменттердiң гетерогендiлiгiне арналған тұжырымдарға
шолулар жасасақ, Скандалиос гендерiнiң экспрессиясы даму стадиясына
тәуелдi 46 изоформалар жүйесiн бөледi [5]. Изоферменттердi зерттеулердiң
негiзгi мақсаты – олардың клетка дифференциациясындағы және
физиологиясындағы маңызын анықтау. Көптеген ферменттердiң арасындағы ең көп
зерттелген тұқымның пiсiп жетiлу процесiмен тiкелей байланысты (-амилазаның
изоферменттерi [6].
(-Амилазаның изоферменттiк құрамын зерттеу үшiн тұқым, ұрық, ұрық
қалқаншасы, микроорганизмдер культурасы қолданылады. Бiрақ, кейiнгi кездерi
ұлпа культурасы модель ретiнде және фермент көзi ретiнде көп қолданылып
жүр. Себебi, бұл жүйелер өнiп келе жатқан тұқымға қарағанда ферменттi көп
мөлшерде синтездеуге қабiлеттi және синтезделетiн (-амилаза изоферменттерге
жақсы бөлiнген [5,6].
Күрiш тұқымының (-амилазасының 3 түрлi формасын ажыратады:
синтезделетiн, секреттелетiн және латенттi. Энзим ДДС электрофорез нәтижесi
бойынша А және С топтарының компоненттерiнiң молекулалық салмағы бiрдей
42 және 46 кД болатын бiр-бiрiне жақын орналасқан 2 полипептидтен түзiлген,
ал ферменттiң В тобы молекулалық салмағы 42 кД компоненттен тұрады. Бұл
көп мөлшерде аспарагин және глутамин қалдықтарынан тұратын қышқыл белок.
Фермент бiрнеше изоферменттер түрiнде кездеседi [7,8,9]
Астық тұқымдастары көптеген елдерде, соның iшiнде Қазақстанда негiзгi
өндiрiлетiн өнiм болып саналады. Дәндi дақылдарды сақтау барысында тұқымның
жинақтан бұрын (предуборочное) өнуi (-амилазаның активтiлiгiне тiкелей
тәуелдi. Сондықтан тұқымдағы (-амилазаның биосинтезi мен секрециясының
локализациясы ғана емес, сонымен қатар, латентизазиясын, регуляциясын және
изоферменттерiнiң физико-химиялық қасиеттерiн бiлу өте маңызды.
Өнiп келе жатқан күрiш және жүгерi дәндерiндегi (-амилаза нативтi
электрофорезде СЭҚ әртүрлi болатын 3 топ компоненттерден (А,В,С) тұратын
жоғары дәрежелi гетерогендiлiгiмен сипатталады. Бұл кезде, анодтық топ (А)
өте жақын СЭҚ 4 изоферменттен, В (ортасындағы) және С (катодтық) топтарының
әрқайсысы құрамында 3 компоненттен тұрады. Электрофореграмманы
денситометрлеу амилаза активтiлiгiн келесi топтарға бөлуге мүмкiндiк бердi:
А – жалпының 45(-ке жуығы, В – 20 (, С – 35 (.
(-Амилазаның изоферменттерi үшiн ПААГ-тағы аналитикалық ИЭФ-де
изонүктелер диапазоны анықталған: 4,3-4,6 А тобы үшiн; 5,0-5,2 В тобына;
5,4-6,5 С тобына тән [10].
Күрiш (-амилазасының басқа да физико-химиялық қасиеттерi бойынша
бiрқатар мәлiметтер алынған (кесте 1). Ферменттiң ең маңызды қасиеттерiнiң
бiрi – рН және температура әсерiнiң оптимумы. Бар мәлiметтер бойынша астық
тұқымдастар (-амилазасының әсер ету оптимумы рН 4,0-6,5 мәндерiнiң
ауданында жатады [11,12].

1 кесте
Күрiш (-амилазасының изоферменттерiнiң физико-химиялық қасиеттерi

Изоферменттiк М.с.(кД) ИЭН Т опт.((С) рН опт.
топтар
А 42,44 4,3-4,6 55 5,0
В 42 5,0-5,2 - -
С 42,44 5,4-6,5 30 5,8

(-Амилазаның С тобының активтiлiгi ортадағы Са2+ ионына айтарлықтай
тәуелдi және С және В тобының изоформаларының молекуласының
стабилизациясы мен каталитикалық активтiлiк көрсетуiне ортада кальций
болғаны керек [13].
Осыдан бұрын, арпаның, бидайдың және басқа да астық тұқымдастардың (-
амилазасының циклодекстриндермен байланысындағы ерекшелiктер көрсетiлген
болатын. Циклодекстриндер – амилотикалық ферменттердiң табиғи субстратының
синтетикалық циклдық аналогы. Осы қасиеттерiне қарай иммобилденген
циклодекстриндердi амилолиз ферменттерiн эффективтi аффиндi тазалауға
лиганда ретiнде пайдаланады. (-Амилазаны тазартуға әсiресе (- және (-
циклодекстринсефарозаны қолданады [14,15].
Күрiштiң суспензиялық культурасының (-амилазасының өзiндiк байланысын
анықтауға эпокси-сефароза 6 В - мен коваленттi байланысқан циклодекстриндер
пайдаланылған. Зерттеулердiң нәтижесiнде А тобының изоферменттерi (- және (-
циклодекстринсефарозамен байланысатыны көрсетiлген, ал С тобының
ферменттерi бұл сорбентке туыстық танытпайды. (-Циклодекстринсефарозамен (-
амилазаның екi тобы да байланыспады [14].
Алынған мәлiметтер көптеген амилазаларда кездесетiн құрылымында қосымша
субстрат байланыстыратын орталықта айтарлықтай ерекшелiктiң барлығын
көрсетедi.
Тұқымда фермент активтiлiгiнiң реттелуiне арнайы белоктар – ингибиторлар
қатысады. Арпа дәнiнен алынған ингибитор сiлтiлiк ортада стабильдi, рН 7,0
болғанда максимум активтiлiк көрсетедi. Бiрақ (-амилаза-ингибитор комплексi
тұрақты емес, бұл комплекстi бұқаның сарысу альбуминi стабильдей алады.
Эксперимент нәтижелерi бойынша ингибитордың эффективтiлiгi сондай, оны
биотехнологиияда өсiмдiктердi зиянкестерден сақтауға қолдануға болады [15].

Зиянкес жәндiктер және патогендер (саңырауқұлақтар, бактериялар және
вирустар) өнiмнiң түсiмiнiң төмендеуiнiң тiкелей себепкерлерi. Арпа дәнiнен
бөлiнiп алынған фермент ингнибиторлары (-амилаза мен протеазаға әсер етiп,
жәндiк iшегiндегi астың қорытылуына кедергi жасайды. Әр түрлi ферменттерге
әсер етуiне қарай фермент ингибиторларларын 6 класқа жiктеген [16].
Ферменттiң табиғи субстратпен байланысуы оның ыдырауындағы ең қажеттi
этаптардың бiрi болып саналады [17]. Амилазаны крахмал гранулаларымен
сорбциялағанда изоферменттердiң жеке топтары арасында байланыстыру
ерекшелiктерi байқалған. Катодтық изофрементер (С тобы) субстратқа нашар
байланысып, онымен алыс туыстық көсеттi. Анодтық топтың (А) изоферменттерi
крахмал грануласымен жақсы байланысты. Арақатынастағы ең көп берiктiлiктi
аралық топ (В) компоненттерi көрсеттi. Крахмал грануласымен салыстырғанда
гликоген молекуласы (-амилазамен байланысқанда ешқандай өзiндiлiк
көрсетпедi [18].
Табиғи субстрат – крахмалды изоформалардың гидролиздеу жылдамдығы
арасында да айтарлықтай ерекшелiктер бар. Мысалы, А тобының изоферменттерi
түйiршiктелген крахмалды активтi ыдыратады да, ал С тобының компоненттерi
ерiгiш крахмалға көбiрек өзiндiлiк (специфичность) танытады.
В тобымен салыстырғанда А тобының компоненттерi крахмал гранулаларын
активтi атакалайтыны көрсетiлегн (Кm 0,38% және 0,68% сәйкес). Алынған
мәлiметтер бойынша (-амилазаның А тобы крахмал гранулаларын үстiнен
(поверхностное) ыдыратса, В тобының ферменттерi субстраттың iшкi
құрылымдарын бұзады деуге болады.
Екеуi қосыла әсер еткенде крахмал түйiршiктерiнiң ыдырауы күшейетiнiн
айта кеткен жөн. Бұл кезде кооперативтi эффект пайда болады [19,20].

1.5 Тұқымдағы (-амилаза синтезінің локализациясы
Астық тұқымдастардағы крахмалдың деградациясын жүзеге асыратын негiзгi
ферменттер – амилазалар болып табылады. Активтi (-амилазасы жоқ ұрық өсiп-
өнуге қабiлеттiлiгiн жоғалтатыны белгiлi. Осы ферменттiң активтi түрде
синтезделуi ұрықтың өмiршеңдiк қасиетiн көрсетедi [21].
Әр түрлi дәндi дақылдардың тұқымының (жүгерi, арпа, бидай, күрiш)
алейрон қабаты мен ұрық қалқаншасы - (-амилазаның локализациясы мен
синтезi өтетiн жер екенi белгiлi. Анотомиялық, гистологиялық, және де осы
ферменттiң активтiлiгiн зерттеулер (-амилаза алғашқыда ұрық қалқаншасының
ұлпаларында синтезделетiнiн көрсеттi [22,23,24]. А. МакГрегор арпамен
жасаған тәжiрибесiнде дәннiң өсу барысында (-амилазаның активтiлiгi
алдымен ұрық қалқаншасында, сосын алейрон қабатында пайда болатынын
көрсеттi [24]. Изоэлектрофокустеу және иммуноизотахофорез әдiстерiн қолдана
отырып ферменттiң сандық өзгеруiн анықтау барысында кейбiр астық
тұқымдастарының алейроны мен ұрық қалқаншасының ұлпалары (-амилазаның
бiрдей изозимдерiн өндiретiнi анықталды [25].
Джонс және К.Корнфорд қызметтестерiмен бiрге жасаған жұмыстарында жас
тұқым дәнiнiң пiсiп жетiлу процессi барысында (-амилазаның саны өсiп
отыратынын дәлелдедi [26].
Көптеген авторлар тұқымның өнуiнiң алғашқы кезеңiнде амилаза ферментi
de novo синтезделедi деп есептейдi [23,26,27].
Р.Д. Фирна, Л.Д. Гибсон,Р.А. Палегалардың жұмыстарында тыныштық
күйiндегi және өсу барысындағы бидай тұқымында гидролазалар жануар
ұлпасының лизосомасына ұқсас мембранамен қапталып орналасатынын анықтады
[28]. Ферментi бар мембраналы органеллалар эндоплазмалық тормен байланысып
жатады. Бұл мембраналық құрылым – көптеген гидролазалардың синтезделiп,
Гольджи аппаратының плазмолеммасының цистернасына өтетiн, кейiннен
эндоспермге тасымалданатын орны.
Кейбiр авторлар осы мембраналық құрылым эндоплазмалық торда
синтезделедi деген пiкiрлер айтады [28,29,30].
Сонымен, (-амилаза ферментi пiсiп жетiлу, өсу барысындағы және
тыныштық күйiндегi тұқымның алейрон қабаты мен ұрық қалқаншасының
ұлпаларында орналасқан. (-Амилаза онда мембранамен байланысқан құрылым
ретiнде кездеседi. Тұқымның өсу барысындағы ферменттiң синтезi және оның
эндоспермге секрециясы осы алейрон қабаты мен ұрық қалқаншасында өтедi.
Осы кезде (-амилазаның ең көп мөлшерi алейрон қабатында түзiледi. Толық
пiсiп жетiлу мерзiмiне дейiн белоктық құрамын сақтайтайтын арпа, жүгерi,
күрiш сияқты астық тұқымдастарының дәндерiнде (-амилазаның локализациясы
осы құрылымдарда өтетiнi, сонымен қатар, ферменттiң крахмал түйiршiктерiмен
байланысы анықталған [30,31].

1.6 (-амилазаның биосинтезі

(-амилазаның синтезi ұрық қалқаншасының эпителийi мен алейрон
қабатында өтедi, кейiн сол жерден өсу барысында крахмал тәрiздi эндоспермге
бөлiнедi.
(-амилазаның синтезi ұрық қалқаншасында тұқымды суда жiбiткеннен кейiн
1-6 сағат өткенде басталады да, сосын алейрон қабатында жалғасады. Энзимнiң
алейрон қабатындағы және ұрық қалқаншасындағы биосинтезi, , кейiннен
эндоспермге бөлiнуi – ұлпаның ультраструктурасын айтарлықтай өзгерiске
ұшыратады. Эндоплазмалық ретикулумның және Гольджи комплексiнiң
цистерналарының өсуi мен секреторлық везикулдардың санының артуы жүредi.
Гольджи аппаратының везикулдарының клетка мембранасымен ассоцияциясы
күшейедi. Бұл компортмендер ферменттiң синтезi мен секрециясына қатысады
[32].
Клеткадағы осындай өзгерiстер фитогормонмен әсер еткенде де байқалады,
бұл өсу барысында энзимнiң синтезi мен секрециясына фитогормондардың
қатысатынын көрсетедi [33].
Жапония ғалымдары ұрық қалқаншасында (-амилазаның түзiлуi үшiн N-
сигналды пептидтiң болатынын көрсеттi [21,34,35]. Мийята қызметтестерiмен
бiрге (-амилазаның биосинтезiн бидай тұқымында in vitro және күрiште in
vivo зерттеп, иммунопреципитация және денатурация жағдайындағы
электрофорез әдiстерiмен (-амилазаның алдыңғысын (precursor) тапты [21].
Олар посттрансляциялық модификацияны туникомицин және моненсин
ингибитоларымен зерттедi. Нәтижесiнде (-амилазаның биосинтезiнiң
гипотетикалық схемасын ұсынды.
Осы схема бойынша, мРНК трансляциясының өнiмi – precursor I, ол
органикалық, протеолитикалық процессингке ұшырайды да, precursor II-ге
айналады. Осы процестiң нәтижесiнде сигналды пептид бөлiнiп шығады. Келесi
этапта олигосахаридтердiң precursor II–ге жалғасуы жүредi. Бұл этап
гликозилдеу ингибиторы - туникомицинмен ингибирлендi. Олигосахаридтер-мен
жалғасқан өнiмдi prеcursor III деп атаған. Одан әрi, precursor III-тiң
Гольджи аппаратына тасымалдануы жүредi. Ол жерде манноза және глюкоза
бөлiнедi де, терминалды сахарид жалғанады. Посттрансляциялық модификацияның
бұл сатысы, яғни (-амилазаның клетка iшiлiк транспортында Гольджи
аппаратының алатын орнын анықтау моненсин ингибиторын пайдалану арқылы
зерттелдi. Ол терминалдық қанттардың байланыстарын жауып, белоктардың
транспорты мен секрециясын бәсеңдетедi. Кейiннен, (-амилазаның моненсинмен
құрылымдық модификациясы ферменттiң синтезi мен секрециясына Са2+
иондарының әсер ету эффектiсiмен байланысты екенi дәлелдендi [30,36].
Терминалды қанттар қосылған precursor III ары қарай өз iшiнде өзгерiстерге
ұшырап, толық пiсiп жетiлген ферментке айналады.
Синтездi in vitro зерттеу барысында авторлар (precursor(-дың
малекулалық массасы пiсiп жетiлген ферменттiң малекулалық массасынан көп
екенiн көрсеттi [37].
Астық тұқымдастардың тұқымындағы көптеген (-амилазалар кәдiмгi
секреттелетiн белоктар болып есептеледi және биосинтез бен транспорт
кезiнде гликозильденедi [34,38]. Күрiш клеткаларындағы (-амилазаның синтезi
мен секрециясына гликозильденудiң ингибиторы – моненсиннiң әсерi
зерттелген. Онда С тобының компоненттерiнiң электроқозғалғыштығындағы
өзгерiстер мен секрециясының бiршама тежелгенi көрсетiлген. Моненсин
Гольджи цистерналарындағы терминалды гликозильдену процессiн тежейтiн
болғандықтан, бұл мәлiметтер клеткаiшiлiк транспорт жолдарындағы және
энзим изоформаларының “пiсiп жетiлуiндегi” мүмкiн болатын ерекшелiктердi
көрсетуi мүмкiн [39].

1.7 Амилаза белсенділігінің түрлі факторлар әсерінен өзгеруі
1.7.1 Температураның әсері
(-амилазаның синтезi мен секрециясы үшiн сыртқы температура маңызды
фактор болып саналады. Жоғарғы температураның (38°С) әсерiн зерттеу, (-
амилазаның синтезi мен секрециясын анықтау үшiн өте қажеттi мәселе.
Сондықтан, көптеген авторлар температураның әсерiн зерттей отырып,
температура бұл процесстерге тiкелей әсер ететiнiн анықтады [40]. (-
Амилазаның pI жоғары компоненттерiнiң синтезi мен секрециясының
жылдамдығы жоғары температурамен (38°С) әсер еткен алғашқы уақытта күрт
өседi және, керiсiнше, төменгi температурада (22°С) бұл процесстiң
индукциясы айтарлықтай төмендейдi [41]. Сонымен қатар, бұл аралықтағы
температураның өзгерiсi (-амилазаның pI төмен компоненттерiнiң синтезi мен
секрециясына мүлде әсер етпейтiнiн айта кеткен жөн. Әсер етуiнiң
температуралық оптимумы екi топта да Т 55(С және Т 30(С –ке сәйкес болды.
Температураны 70(С-ке дейiн көтергенде С тобының изоферменттерiнiң
активтiлiгi 60 (-ке дейiн төмендесе, А тобы өзiнiң бастапқы активтiлiгiн 70
(-ке дейiн сақтап қалды.
Көптеген ... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.