Клондық микрокөбейтудің әдістері
ӘЛ-ФАРАБИ АТЫНДАҒЫ ҚАЗАҚ ҰЛТТЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ
БИОЛОГИЯ ФАКУЛЬТЕТІ
Ботаника және экология кафедрасы
БІТІРУ ЖҰМЫСЫ
БҮЛДІРГЕННІҢ АСА БАҒАЛЫ СОРТТАРЫН IN VITRO ЖАҒДАЙЫНА ЕНГІЗУ МЕН ӨСІРУДІҢ
ЕРЕКШЕЛІКТЕРІ
Орындаған: ___________________________ А. Саттар
Ғылыми жетекшілері:
б.ғ.д., профессор ______________________Н.М. Мұхитдинов
б.ғ.к., а.ғ.қ. ______________________З.Р. Мұхитдинова
Норма бақылаушы К,Т. Абидкулова
Қорғауға жіберілді:
Ботаника және экология
кафедрасының меңгерушісі
б.ғ.д ., профессор С.С. Айдосова
АЛМАТЫ, 2008
Мазмұны
Реферат ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 3
Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .4Әдебиетке
шолу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ...6
1.1 Клондық микрокөбейту және оның
маңызы ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... . 6
1.2 Клондық микрокөбейтудің
әдістері ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..7
1.2.1 Апикальды меристеманы
өсіру ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ...9
1.2.2 Қолтық бүршіктерінің дамуын
қоздыру ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...9
1.2.3 Каллустың бөлініп көбеюі және одан өсімдіктің регенерациясы...10
1.2.4 Клондық микрокөбейтуге әсер ететін
факторлар ... ... ... ... ... ... .. ...11
1.2.5 Жеміс-жидек өсімдіктерін клондық
микрокөбейту ... ... ... ... ... ... ...13
2.Материалдар мен
әдістер ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... 17
2.1 3ерттеу
объекттері ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .,
... ... ... ... 17
2.2 3ерттеу
әдістері ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ...17
2.2.1 Материалдарды залалсыздандыру
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 19
3 Нәтижелер және оларды
талқылау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..20
3.1 Бүлдірген экспланттарын залалсыздандыратын заттарды таңдау ... 20
3.2 Бүлдірген өсімдігінің in vitro жағдайында өсуі мен көбею жиілігі...27
3.3 Бүлдірген бұтақшаларында меристема төбешіктерңнің пайда болуы. 34
Қорытынды ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... 37
Пайдаланған әдебиеттер
тізімі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... 38
-
Реферат
Бітіру жұмысының тақырыбы "Бүлдіргеннің аса бағалы сорттарын in
vitro жағдайына енгізу мен өсірудің ерекшеліктері".
Жұмыс көлемі -41, кесте саны -10, фотосурет саны -6, диаграмма-1.
Пайдаланған әдебиеттер саны -52
Кілтті сөздер - эксплант, асептика, залалсыздандыратын заттар,
фитогормондар, меристема, дифференциация.
Жұмыстың мақсаты - Қазақстанда ұлттық гермоплазма банкін толықтыру
үшін бүлдіргеннің өнімділігі мол, бағалы сорттарын (Адди, Редгонтлит,
Чезена, Сладкий Чарли) in vitro жағдайына енгізіп, жаппай көбейтіп өсірудің
технологиясын жақсарту болды.
Зерттеу әдістері - Қоректік ортаны дайындау үшін Ф.Л. Калинин, В.В.
Сарнацская, В.Е. Полищук әдістерін қолданып дайындадық [8,19]. Асептикалық
жағдайға енгізілген өсімдіктерді ары қарай дамытып өсіруге өсуді реттеуші
гормондардың: бензиламинопуриннің (БАП), индолилмай қышқылының (ИМК),
гиберелл қышқылының (ГК) әртүрлі деңгейдегі концентрациясы қосылған
Мурасиге және Скуг (МС) [49], Ли және де Фоссард [51], Боксус орталары
[52]. қолданылды. Тәжірибелер 5-10 рет қайталанып істелінді. Өсімдіктерді
микроклондау әдісімен көбейтуге арналған пробиркалар 3-5 мың люкс жарықта,
16-сағат фотопериодта, +23-25оС температура сақталатын арнаулы өсіретін
бөлмедегі сөрелерге қойылды. In vitro жағдайына енгізу үшін отырғызылған
өсімдіктер апта сайын мұқиат қаралып, экспланттардың өлгендері, тірілері,
зең басқандары есептелді. Зерттелуге алынған генотиптерді жаңалап
отырғызған сайын өркендердің өсу қалпы және жаңадан пайда болған
бұтақшалардың саны есептелді. Әртүрлі генотиптің отырғызылған сайын орташа
көбею коэффициенті мына формуламен есептелді: P= ab·c: a – қайтадан пайда
болған бұтақшалардың саны, b – көбейту үшін отырғызылған бұтақшалар саны, c
– отырғызу саны.
Нәтижелер:
1.Залалсыздандырушы заттардың әртүрлі схемаларын қолдана отырып
бүлдіргеннің зерттеуге алынған сорттары Адди, Редгонтлет, Чезена және
Сладкий Чарли in vitro жағдайына енгізілді. Бұл жүргізілген зерттеулерден
бұрыннан жиірек қолданылып жүрген құрамында сынап бар сулема және диацид
улы заттарын қолданбай басқа залалсыздандырушы заттарды да пайдалануға
болатындығы дәлелденді.
2. In vitro жағдайына енгізілген бүлдірген сорттары Адди, Редгонтлет,
Чезена және Сладкий Чарли микроклон әдісімен көбейтіліп өсірілді.
Кіріспе
Елімізде аса бағалы жеміс-жидек өсімдіктерінен аурулардан сауыққан
экологиялық таза көшеттер алып өндіріске қажет шикізат қорын кеңейту өзекті
мәселенің бірі болып саналады.
Жеміс-жидек өнімдерінің аса жоғары сұраныстарына байланысты елімізде
ауыл-шарушылық өндірістерінде өсімдіктерді әртүрлі инфекциядан арылту және
тезірек көбейту мәселелері өзекті болып саналады. Өсімдіктерді in vitro
жағдайында ұлпалары арқылы көбейту әдістерін пайдалана отырып, бір жағынан
оларды инфекциялық аурулардан арылтып қана қоймай, екіншіден,
цитокининдердің көмегімен апекс белсенділігін құлшындырып жаңадан бүршіктер
қалыптасу және даму процестерін тездетуге мүмкіндік туады [1,2,4,29].
Асептикалық in vitro жағдайында өсімдік ұлпаларын көбейту әдістері селекция
жұмыстарында, қолданбалы ботаникада және биологиялық алуан түрлерді сақтап
қалу және көбейту мәселелерін шешуге кеңінен қолданылады. Бұл әдіспен
өсімдіктердің түрі мен сорттарына қарай, көбейту коэффициентін тез арада 1
1000 ден 1 600000 ға дейін арттыруға болады. Көбейту нәтижесінде,
регенеранттар әртүрлі зиянкес патогенді микрофлорадан арылып, өзгеріске
ұшырамай өздерінің жоғары генетикалық біргелкі сапалық қасиеттерін сақтап
қалады. Бұндай өсімдіктер патогенді микрофлорадан арылған генетикалық
біркелкі таза болады. Қазір Ресей мен Қазақстан ғалымдары жеміс-жидек
өсімдіктерін in vitro жағдайында көбейтіп өсіру әдісімен айналысуда.
Мақсаты іn vitro жағдайында клондық микрокөбейту арқылы өнімділігі жоғары,
сыртқы факторларға төзімді, патогенді микрофлорадан арылған бастапқы
өсімдік түріне тән барлық белгілері мен қасиеттері сақталған өсімдікті алу.
Біздің ендігі міндетіміз клондық микрокөбейтудің әдістерін жетілдіріу
арқылы клондық микрокөбейтудің тиімділігін пайдалану. биотехнологиялық
өндірісте кеңінен дамыту болып табылады.
Елімізде гермоплазма банкін құру үшін көбейтілген құнды өсімдіктер
түрлері, сорттары мен формаларын асептикалық жағдайда температураны реттеп
ұзақ ұақыт сақтауға болады.
Жеміс-жидек өсімдіктерінің ішінде бүлдірген (Fragaria) жер бетінде
кеңінен таралған. Оны аса жоғары экологиялық бейімділігіне қарай
өнеркәсіпке дайындау үшін әртүрлі топырақ-климат жағдайларында өсіруге
болады.
Қазіргі таңда әлем тарабында сәтті жүргізілген селекциялық жұмыстардың
нәтижесінде тек қана егістікте емес, жабық грунтта тез арада жеміспен
базарды қамтамасыз ететін бүлдіргеннің өнімділігі мол сорттары пайда болды.
Бірқалыпты климат аймақтарында бүлдірген ең негізгі жеміс-жидек түріне
жатады. Оның бір жылдық және екі жылдық сорттары аса жоғары және ұдайы
өнімділігімен, тез арада жеміс беруімен, жемістерінің сапалылығымен керекті
өнім ретінде өндіріс қажеттігін қамтамасыз етеді. Бүлдірген жемісінің
дәмдік сапалылығы, оның емдік қасиеттері тамаққа қолданылатын жеміс ретінде
және одан өңделген өнімдер күннен-күнге өсіп отырған өндіріс қажеттілігіне
жаратылады.
Бүлдіргеннің (Fragaria ananassa) көптеген вирустық және микоплазмалық
ауруларға шалдығатыны белгілі. Аурулардан сауықтыруға бүлдіргеннің аса
бағалы сорттарын in vitro жағдайында меристема арқылы көбейтіп, генетикалық
біркелкі таза өсімдіктер алып Қазақстанның ұлттық гермоплазма банкін
толықтыруға мүмкіндік туады. Жұмыстың мақсаты Қазақстанда ұлттық
гермоплазма банкін толықтыру үшін бүлдіргеннің өнімділігі мол, бағалы
сорттарын (Адди, Редгонтлит, Чезена, Сладкий Чарли) in vitro жағдайына
енгізіп, жаппай көбейтіп өсірудің технологиясын жақсарту болды.
1.ӘДЕБИЕТТЕРГЕ ШОЛУ
1. Клондық микрокөбейту және оның маңызы
Өсімдіктерді микроклон арқылы көбейту деп өсімдіктердің in vitrо
жағдайында жыныссыз жолмен көбеюін айтуға болады. Соның нәтижесінде пайда
болған өсімдіктер бастапқы өсімдікпен және өзара бір-бірімен генетикалық
тұрғыдан айнымастай бірдей болады. Сонымен, клон дегеніміз жыныссыз жолмен,
яғни вегетативтік көбею жолымен түзілетін организм [1,2,16,20,35].
Маманданған ұлпаның тірі клеткалары лайықты қоректік ортада өсіргенде
өздерінің тотипотенттік қасиетін жүзеге асырып, регенерация арқылы бүтін
өсімдікке яғни, бастапқы өсімдік түріне тән барлық белгілері мен қасиеттері
сақталған бүтін өсімдікке айнала алады. Бұны микрокөбейтудің негізіндегі
өсімдік клеткасына тән тотипотенттілігімен түсіндіруге болады. Бұл клондық
көбейту технологиясының негізін қалайды [2,3,28].
Клондық микрокөбейту дегеніміз - ұлпа мен клетка культурасында
өсімдіктердің жаппай жыныссыз көбеюі. Бұл кездегі алынған өсімдіктер
түрлері алғашқысымен генетикалық жағынан бірдей. Микрокөбейтудің негізінде
өсімдік клеткасына тән тотипотенттілігін қолдану жатыр [1,27,49,46].
Бұл әдіс вегетативті көбейту әдістеріне қарағанда бірнеше мыңдаған есе
көп өсімдіктердің біртекті отырғызылатын көшеттерін көп мөлшерде алуға
мүмкіндік береді. Микрокөбейтудің коэффициенті аз уақытта немее жылына 105-
106 өсімдікке жетеді. Мысалы, қарақат, гербера өсімдіктерінің бір түрін
көбейтіп өсіруде жылына бір миллион өсімдік алуға болады [2,9,10].
Клондық микрокөбейту селекция процесін тездетеді. Селекция саласында
жаңа сорттарды 10 жылдың орнына 2-3 жылда алуға болады. Ұлпалардан
өсімдіктерді көбейтуде олардың патогенді микроорганизмдерден және
вирустардан арылуы жүретіні өте маңызды. Микрокөбейту процесінде
өсімдіктерді қайтадан вируспен жұқтыру мүмкіндігі жоқ. Себебі ұлпалардан
алынатын өсімдіктердің біртектілігі әсер етеді. Осылайша микрокөбейту
арқылы өсімдіктің сапасында біраз жақсартуға болады. Ұлпалардан өсімдікті
жыл бойы өсіруге болады. Ал бұл даму циклында тыныштық кезеңі бар
өсімдіктер үшін өте маңызды. Ұзақ ювенильді фазасы бар өсімдіктерді өсірген
кезде, ювенильді фазадан репродуктивті фазаға тез ауыстыруға болады.
Соңында, ұлпалар культурасы әдісімен вегетативті қиын немесе мүлдем
көбеймейтін өсімдіктерді көбейтуге болады [3,2,9,10].
Клондық микрокөбейту мен морфогенезін зерттеуге арналған көптеген
тәжірибелік жұмыстар бар болғанымен, клондық микрокөбейту технологиясы
көптеген ауылшаруашылық өсімдіктері үшін әлі шығарылмаған. Бұның себептері-
нақты, жақсы жұмыс істейтін әдістердің болмауы, олардың күрделілігі,
қоректік ортаның аз кездесетін және қымбат компоненттерді пайдалануы,
өсімдіктердің морфогенетикалық потенциясы туралы білімнің аздығы болып
отыр.
Клондық микрокөбейтудегі алғашқы жұмыстар ХХ ғасырдың 50 жылдарының
соңында жүргізілді. Мысалы, Ветмор және Морель деген ғалымдар шаңжапырақ
өсімдіктерінің апекстерін көбейтіп өсірді. Олар өте қарапайым құрылымды
ортаны қолданды: Кноп қоректік ерітіндісі және сахароза (3%). Алайда,
жоғарыда айтылған өсімдіктердің апикальды меристемасының осы қоректік
ортада көбейіп өсуі нәтижесіз болып шықты [4,46,,47,48].
Морель картоп пен георгинаның апикальды меристемалары қоректік орта
витаминдермен, глутатионмен, цистеинмен, кинетинмен байытылған жағдайда
каллус түзе алатынын анықтады. Гибберелл қышқылын қосқан кезде кішігірім
өскін дамыды. Алайда, оның өсуі әлсіз болып, 2-3 айдан соң ұзындығы 1 см-ге
де жетпей тоқтап қалды. Бұл Кноп қоректік ерітіндісіндегі К+ және NH4+
иондары аз концентрацияда болғандықтан, шықпай қалғандығы соңынан
анықталады. Кейін қоректік ортаға 13,46 мМ және 7,56 мМ концентрацияда KCl
мен (NH4)2SO4 қосқанда сабақтың апикальды меристемасының өсуі жақсарып,
өсімдіктің дамуы да жақсарды. Осы негізінде, кейбір қалампыр, хризантема,
картоп, т.б. шөптесін өсімдіктердің апикальды меристемаларының өсуін
жақсартатын құрамы: NH4NO3- 12,49мМ, KNO3- 9,89мМ, CaCl2- 2,25мМ, MgSO4
7H2O-0,50мМ, KH2PO4- 0,91мМ, сахароза- 58,42мМ, гибберелл қышқылы- 28,8
мкМ болған қоректік орта құрамы шығарылды [44,47,48].
Апикальды меристемадан алынған өсімдіктер вирустық инфекциядан таза
болады, себебі меристемада өткізгіш жүйелері жоқ, ал плазмодесмалар көлемі
өте кішкене. Сөйтіп, алғаш рет картоптың бірнеше бағалы сорттарын
вирустарынан сауықтыру мүмкін болды. Бұл кезде апикальды меристеманы
түйнектен оқшаулап көбейтіп өсірді [8,30,34,35]. .
Клондық микрокөбейту әдістерінің артықшылығы көбірек. Сондықтан жақын
уақытта жидекті, көкөністі, дәрілік және тағы басқа өсімдіктердің жаңа және
шаруашылық үшін бағалы сорттарының отырғызылатын көшеттерін алудың
биотехнологиясын жақсартуға болады [36,37,35].
Микрокөбейту әдісінің дағдылы вегетативтік көбеюмен салыстырғанда
бірталай артықшылықтары бар, атап айтсақ:
← Микрокөбейту арқылы өсімдіктер вирустар мен патогенді
микроорганизмдерден сауықтырылады.
← Сұрыптау процесін жылдамдатып жаңа сорттарды тез көбейтіп, олардың
ауылшаруашылық өндірісіне пайдалану мерзімін едәуір қысқартады.
← Вегетативті жолмен көбейе алмайтын өсімдікті, мысалы, пальманы тек in
vitro жағдайында көбейтуге болады. Осы әдіспен өнеркәсіп деңгейінде
бірқатар өсімдіктерді көбейтеді.
← Арнайы бөлмедегі сөрелерде орналасқан пробиркаларда жыл бойы мыңдаған
өсімдіктерді өсіру арқылы теплицалар алаңы үнемделеді.
← Кәрі бұтақтардан жас өсімдіктер алуға болады.
← Микрокөбейту арқылы әсіресе даму процесінде тыныштық кезеңі болатын
өсімдіктерді көбейтуге тиімді. Өсу процесін жыл бойы үзбеуге болады
← Көбею коэффициенті өте жоғары. Мысалы, гербера, бүлдірген, хризантема,
раушан өсімдіктерінің бір өсімдігінен in vitro жағдайда бір жылдың
ішінде 1 миллионнан астам клон өсімдіктер алуға болады. Алма ағашының
бір бүршігінен 8 айдың ішінде 60 мыңнан астам өркен шығады. Қарақаттың
бір бұтадағы меристемаларын бөліп алып, өсіріп, жылына 50 мыңға дейін
өсімдік алуға болады. Сонымен, микрокөбейтудің коэффициенті басқа
вегетативті көбейту әдістерімен салыстырғанда мыңдаған есе артық
[41,42,43].
Клондық микрокөбейтудің артықшылықтары айқын факт. Өсімдік өсіру мен
селекцияда оның мүмкіншіліктері зор болғандықтан, биотехнологиялық
өндірісте болашақта кеңінен дамиды.
1.2 Клондық микрокөбейту әдістері
Қазіргі кезде клондық микрокөбейту әдісінің бәріне ортақ классификация
жоқ. Алғашқы классификациялардың бірін Мурасиге шығарған. Ұлпалар
культурасындағы экспланттарда болатын морфогенетикалық реакциялар негізінде
мынадай әдістер шығарылды:
1) қолтық бүршіктерінің белсенделуі ;
2) қосалқы өскіндердің түзілуін қоздыру;
3) сомалық эмбриогенез;
Кейінгі жұмыстарында Мурасиге әртүрлі морфогенетикалық реакцияларға
негізделген микрокөбейтудің түрі өзгертілген классификациясын ұсынды:
1) қолтық бүршіктерінің белсенделуі;
2) қосалқы өркендердің экспланттан тікелей пайда болуы;
3) каллуста қосалқы өркендердің пайда болуы;
4) эксплантат клеткаларында сомалық эмбриогенезді қоздыру;
5) каллуста эмбриоидтардың пайда болуы;
6) Іn vitro пайда болған алғашқы сомалық эмбрион ұлпаларында қосалқы
эмбриоидтардың қалыптасуы.
3-6 әдіс қана алынған классификациядан бөлек, морфогенетикалық
процестермен байланысты микрокөбейтудің басқа да бөлінулері бар [49,54,45].
Клондық микрокөбейту процесін түбегейлі 2 түрлі түрге бөлуге болады:
1) өсімдікте бұрыннан бар бүршіктің дамуын белсендету (сабақ апексін,
сабақтың қолтық бүршіктерін);
2) бүршік немесе эмбриоидтардың түзілуін de novo қоздыру. Оның өзін 3
тәсілге бөлуге болады:
a) Эксплантаттың маманданған ұлпаларынан (репродуктивті мүшелер, эпидермис,
субэпидерма қабатының клеткалары) жинақталған құрылымдардың түзілуі;
б) эксплант клеткаларынан каллустың түзілуі;
в) суспензияда өсіп жатқан клеткалар мен ауыстырылып отырғызылатын каллус
ұлпасынан түзілуі.
Бұл классификацияның басқалардан айырмашылығы бүршіктерден пайда
болған өсімдіктер арасындағы түбегейлі айырмашылық. Яғни, олардың ата-
аналық түрлерге генетикалық толық ұқсастығы [5,6]. Яғни, микроклонды
көбейту әдістерін бөлгенде тек олардағы морфогенетикалық процестерге
негізделу керек.
Клондық микрокөбейту әдісі әсемдік (қалампыр, мамыргул), көкеніс
(картоп, томат, сарымсақ), жеміс-жидек (қарақат, алма, жүзім) дақылдарын
көбейту үшін қолданылады. Бұл әдіспен дәнді дақылдар мен астық
тұқымдастарды көбейту қиын.
Сондықтан бұл әдіс тек селекциялық жұмыстарда шағын көлемде қолданылады
[47,18,48,49].
1.2.1 Апикальды меристеманы өсіру
Соңғы кезде вирусы жоқ өсімдіктерді алу үшін апикальды меристеманы
өсіру, термоөңдеу, хемотерапия және вирустарды сарапқа салу қолданылуда.
Әдетте, вирустан құтылу үшін іn vitro жағдайындағы регенерант
өсімдіктерін алады. Олар инфекцияға шалдықпайды. Яғни, вирустар қоздыратын
аурулармен куресудің негізгі жолы, апикальды меристеманы өсіру [8,27,40].
.
Бұл әдістің негізін қалаған француз ғалымдары П. Лимассе мен П.
Корнуе. Олар көрсеткендей, теңбіл кеселді темекінің жапырақтарында
вирустың концентрациясы өсімдік бүршігінің апексіне (ұшына) жақындағанда
төмендеген. Өркен ұштарының, яғни, апикальды меристемалардың ұшындағы
бірнеше қабат клеткаларда вирус тіпті болмаған [8,3153,54].
Вирустардың меристема ұлпасында көбеймеуінің себептері жөнінде
әртүрлі пікірлер бар. Бір зерттеушілер болса, меристемада вирустардың
болмауын олардың бір клетка мен екінші клетка арасында баяу қозғалысымен
түсіндіреді. Себебі, меристемада өткізгіш жүйесі жоқ, ал плазмодесмалар
көлемі өте кішкене. Басқалар болса, бұл фактіні меристемаларға тән ерекше
вирустық нуклеопротеидтердің синтезін тежейтін метаболизммен түсіндіреді
[9,5].
Өсімдіктерді вирус ауруларынан сауықтыру мақсатымен апикальды
меристеманы өсіру әдісін бірінші пайдаланған 1952 жылы Г. Морель мен К.
Мартин болды. Олар бұл әдісті нағыз гүлді теңбіл вирусынан сауықтыру үшін
қолданған [48].
Аурудан таза, сауықтырылған өсімдіктері алыудың тағы бір әдісі жылумен
өңдеу. Жылумен өңдегенде өсіп келе жатқан өркен ұштарында вирустың көбеюі
күшті тежеледі, сондықтан жаңадан пайда болған меристема клеткаларында
вирустың болмауы мүмкін. Жылумен өңдеу нәтижелі болу үшін донорлық
өсімдіктерді жоғары температурада (34-40оС) өсуге жақсы жағдай жасап
ұзағырақ ұстау қажет. Сол кезде жаңадан өсіп шыққан өркендердің ұштары
вирустан алас болады. Бірақ барлық өсімдіктер ұзақ мерзімді жылумен өңдеуге
шыдамайды. Кейде апикальды меристеманы өсіру үшін вирустық тесттер арқылы
сұрыптау тәсілдері де қоса қолданылады.
1.2.2 Қолтық бүршіктерінің дамуын қоздыру
Апикальды басымдылықтың деңгейі тұқым қуалаушы белгі болып табылады және
өсімдіктің әртүрлі мүшелеріндегі гормондық баланспен, фитогормондар
тасымалымен, трофикалық факторлармен байланысты. Қолтық өркенінің өсуін
қоздыру үшін апикальды өсуді тоқтату керек. Яғни, сабақ апексін алып тастау
арқылы немесе өсімдікті гормондық өңдеу арқылы жасауға болады. Апикальдық
өсуі әлсіз болып келген бұтақты және жартылай бұтақты өсімдіктер үшін
бұтақшаны бөлу тәсілдері әдеттегідей болып саналады. Ал, Виксон мен Тиманн
тәжірибелерінде бұршақ өсімдігінде апикальды өсуді, төбелік бүршікті алып
тастау арқылы жойылады. Көптеген жұмыстар арқылы цитокининдер синтезделетін
тамыр, әсіресе, тамыр ұштары. Сондықтан қолтық бүршіктерінің өсуі өсімдік
тамырының бар-жоқтығына тікелей байланысты екендігі анықталды. Қолтық
бүршіктердің өсуінде тамырдың әсерін экзогенді цитокининдермен өңдеу арқылы
алмастыруға болады [2,3,27].
Өсімдікте тек негізгі өркен (сабақ) дамығанда, төбелік бүршікті кесіп
алып тастап, кесілген жерге ауксин қосқанда қалпына келеді. Кинетинмен
өңдегенде қайта жойылады. Р.Г. Бутенко қоректік ортаға енгізілген кинетин
апикальдік өсуді жойып, рудбекия мен перилла бүршіктерін өсіруде көптеген
қолтық бүршіктерінің түзілуін болдыратынын көрсетті 2,3,5,6].
Тиманн мен Виксон теориясына сәйкес, өркен төбешігінің меристемалық
ұлпаларында түзілетін ауксин негізгі сабақ бойымен базипетальді
тасымалданады. Қажетті физиологиялық деңгейден көп мөлшерде жиналып қалса,
ауксин қолтық бүршіктерінің өсуін тежейді. Ауксиннің көп концентрациясының
әсерінен қолтық бүршіктеріндегі цитокининдер синтезі тоқтайды деген болжам
бар [51].
Қолтық бүршіктерінің өсуін қоздырып, қолтық өркендерін қолдану -
өсімдікті вегетативті көбейтудің қалыптасқан әдістерінің бірі.
Цитокининдердің физиологиялық әсері анықталып, оларды қолтық
өркендерін белсендету әдісімен өсімдіктерді микрокөбейту үшін қолдану
туралы көптеген мәліметтер пайда бола бастады. Осылайша, клондық
микрокөбейтуді қолтық өркендерін белсендету арқылы жасалатын әдіс -
апикальдық өсуді немесе негізгі өскінді жою, немесе көптеген қолтық
өркендерін түзуді қоздыратын цитокининдерді қоректік ортаға енгізу, кейде
тіпті екеуін де байланыстыруға негізделген. Барлық жағдайларда да дамыған
өркендерді бір-бірінен ажыратып, қолтық өркендерінің бөлініп көбеюін және
жоғары деңгейдегі өркендердің түзілуін қоздыратын қоректік ортада қайтадан
өсіреді [8,9,10].
БАП-тың 2,18-10,13 мкМ концентрациясы қарақат, жүзім,қара өрік
өркендерінің қолтық бүршіктерінің дамуын қоздырады. Авторлардың пікірі
бойынша, бір залалсыз күйде алынған өркен төбешігінен жылына бірнеше мың
өсімдік алуға болады [12,5,20,29,8].
Өсімдіктерді микрокөбейтуде негізгі мәселе қоректік ортаға
енгізілетін фитогормондар концентрациясы туралы болады. Мурасигенің
жұмыстарында цитокининдердің жоғары концентрациясы туралы мәліметтер бар.
Сонымен бірге, қоректік орта құрамы бойынша және қолтық бүршіктерінің
дамуын қоздыру үшін өсірудің жағдайлары туралы нұсқаулар беріледі.
Қазіргі кезде фитогормондардың жоғары концентрациясы алынатын
өсімдіктердің морфофизиологиялық ерекшеліктеріне және өсімдіктерді ұлпа
культурасында ұзақ уақыт бойы микрокөбейту мүмкіндігіне әсер ететіні туралы
көптеген мәліметтер бар. Қоректі ортада фитогормондардың концентрациясы
жоғары болса, отырғызылған эксплантаттардың көптеп өлуі байқалған.
Өркендерді өсіру процесінде ұлпаларда фитогормондар қажет
физиологиялық деңгейден артығырақ жиналып, олардың токсикалық әсері болады
[49,13].
Цитокининдердің жоғары концентрациясын қолдану көбеюдің жоғары
коэффициентін алу үшін қолдану өсімдіктердің морфологиялық өзгерістердің
пайда болуы, қолтық өркендерінің бөлініп көбеюінің басып төмендеуі,
өркендердің тамырлануға қабілеттілігінің азаюы сияқты клондық микрокөбейту
үшін жағымсыз әсерлер шақырады [18,19].
1.2.3 Каллустың бөлініп көбеюі және одан өсімдіктің регенерациясы
Каллустың бөлініп көбеюден органогенезге ауысуының негізгі шарты -
қоректік ортадағы гормондық факторлардың қатынасы болып табылады.
Цитокининауксин экзогендік гормондардың жоғары қатынасында өркендер
түзіледі. Ал төменгіде - тамырдың түзілуі қоздырылады, ортаңғыда- каллус
бөлініп көбейеді. Бұл заңдылық алғаш Скуг пен Миллермен анықталынды
[13,4,47,40,41].
Жоғарыдағы гипотезаға қарсы келетін мәліметтер бар болып, люцерна
(Medicago sativa) каллусын алдын-ала ауксиннің жоғары концентрациясында
өсіріп, ортадан фитогормондарды алып тастағанда, өркендердің мамандануын
қоздырады. Керісінше, цитокинині көп ортада каллусты өсіргенде, ортадан
фитогормондарды алып тастағанда, тамыр қалыптаса бастайды.
Каллус клеткаларының морфогенезге қабілеттілігі фитогормондар
балансымен анықталатынын дұрыс деп есептеу керек. Бұл фитогормондар балансы
каллус клеткаларымен түзіледі. Және ол эндогенді фитогормондар деңгейіне,
ұлпалардың өсуін қамтамасыз етуші экзогенді реттеушілер деңгейіне,
өсірілетін клеткалардың рецепцияға қабілеттілігіне және әртүрлі гормондық
факторлардың әсеріне байланысты [36,37,38].
Эндогендік және экзогендік фитогормондардың мөлшерлерінің арасындағы
тығыз байланыстың және нақты механизмі әлі белгісіз каллус клеткаларының
морфогенезге қабілеттілігінің бар екенін айта кету керек.
Микрокөбейтудің бұл әдісінің негізінде өсімдіктен оқшауланып, қоректік
ортаға отырғызылған эксплантат клеткаларының дедифференциялану қабілеті
жатыр. Дедифференциялану дегеніміз - клеткалық маманданудың жойылуы
[14,38,40,45].
Вегетациялық фазаның активті периодтарында, яғни, сәуірдің соңынан
шілденің соңына дейінгі аралықта алынған экспланттың регенерациялануы өте
жоғары болады [20,28].
Каллус клеткаларын жаңа қоректік ортаға отырғызып отырып, ұзақ уақыт
бойы in vitro жағдайында өсіруге болады. Бірақ бұл кезде өсірілетін өсімдік
клеткаларында хромосомалар құрылымының өзгеруі, гендік мутациялардың
жинақталуы, өсірілетін клеткалардың морфогенетикалық потенциалының жоғалуы
сияқты микрокөбейту үшін жағымсыз құбылыстар болады. Осының нәтижесінде
каллус клеткаларынан бой қысқа, жапырақтарының дұрыс емес орналасуы, түрі
ұсқынсыз және өміршеңдігінің төмендеуі сияқты морфологиясы өзгерген
өсімдіктердің пайда болуына әкеледі. Каллустан регенерацияланатын
пеларгония өсімдіктері көлемі, жапырақтарының және гүлінің морфологиясы
бойынша бір-бірінен ажыратылады.
Бірақ, белгісіз себептермен, кейбір каллустық клеткаларды ұзақ
өсіргенде, генетикалық тұрақтылығын және морфогенезге қабілеттілігін
сақтайды [15].
2. Клондық микрокөбейтуге әсер ететін факторлар
Клондық микрокөбейтуге әсер ететін факторлардың маңызы зор. Жалпы
алғанда іn vitro жағдайында регенерацияның жылжамдығы: өсімдіктер
генотиптіне өсімдіктер түрінің формасына; сорттары мен будандарына;
эксплант ретінде алынатын өсімдіктің мүшесіне; отырғызылатын қоректік
ортаға; жарықтың әсеріне, сонымен қатар, темпераның әсеріне де байланысты
болады.
- Клондық микрокөбейтуге генотиптің әсері күшті. Мысалы, қосжарнақтылар
шөптекті өсімдіктер және ағаш өсімдіктерге қарағанда регенерацияға қабілеті
едәуір жоғары. Өсімдіктің әр түріне ең тиімді регенерация әдісі іріктеліп
алынады. Эксплант бөлініп алынатын өсімдіктер аурудан сау болу керек.
- Эксплант алынатын өсімдік неғұрлым жас болса, соғұрлым одан шыққан
өскіннің немесе каллустың регенерацияға қабілеті жоғары болады. Ювенильдік
кезеңдегі өсімдіктерден, яғни өскіндерден алынған каллустың морфогендік
потенциалы ең жоғары болады.
Экспланттың физиологиялық жасы каллуста өтетін морфогенез жолына әсер
етеді. Мысалы, Echeveria elegans жас жапырағының экспланттарынан өскен
каллустарда көбінесе тамырлар пайда болған, қартайған жапырақтарынан
өркендер, ал орта жастағы жапырақтан - тамырлар мен өркендер пайда болған
[5,1].
- Микрокөбейту үшін эксплант алынатын мүшенің де маңызы зор. Ең жақсысы,
егер эксплант ретінде меристемалық ұлпалар мен мүшелері, атап айтқанда:
өркеннің ұшы, қолтық бүршігі, меристема пайдаланса, in vitro жағдайында
олар жақсы өседі және тотипотенттігі жақсы болады.
- Экспланттың морфогендік қабілетіне оның көлемі ықпал етеді. Неғұрлым
эксплант кішкене болса, соғұрлым оның органогенезге қабілеті төмендейді.
Ірі экспланттардың генетикалық тұрақтылығы артады. Бірақ бұл кезде олардың
клеткаларында вирустар сақталып қалуы мүмкін. Сондықтан практикада
экспланттың орташа көлемін іріктеп алады.
Жеміс-жидек өсімдіктерін in vitro жағдайына енгізу эксплант көлеміне
байланысты. Егер эксплант көлемі 03,-0,5 мм болса, оның регенерациялану
қабілеттілігі өте жоғары болады. Ал эксплант көлемі 0,2-0,3 мм аралығында
болса, экспланттың регенерациялану қабілеттілігі өте төмен болады
[2,3,8,9].
- Микрокөбейтуде қоректік ортаның орны ерекше. Қоректік ортаның
құрамына, оған қосылған фитогормондардың деңгейіне байланысты өсімдік
ұлпаларының әрбір сортқа, түрге тән морфогенетикалық өзгерістері болатыны
белгілі.
Әрбір өсімдік түрі үшін оның құрамы тәжірибеге сүйеніп іріктеледі. Ең
жиі қолданылатын Мурасиге-Скуг ортасы каллустың пайда болуына және оның
өсуіне лайықты, яғни микрокөбейтудің бірінші кезеңіне ыңғайлы.
Егер де микрокөбейту қолтық бүршіктерін өсіру арқылы өткізілсе,
каллустың пайда болуы ұнамсыз құбылыс. Сондықтан бұл әдіске каллус түзілуін
тежейтін басқа қоректік орталары қолайлы келеді. Микрокөбейтудің бірінші
кезеңінде қоректік ортаға антиоксиданттар жиі қосылады, олар гидролиз
өткізетін ферменттердің белсенділігін тежейді, демек эксплантты сақтап
қалады. Антиоксидант ретінде цистеин, глутатион, меркаптоэтанол, аскорбин
қышқылы қолданылады. Тіпті, эксплантты отырғызу алдында оларды осы
заттардың ерітіндісімен жуады.
Көптеген өсімдіктер айтарлықтай мөлшерде фенолдық заттарды
синтездейді, олардың тотығуы салдарынан ұлпалар қарайып, өсуі тежеледі. Бұл
заттардан құтылу жолдары, ол каллустарды жиі-жиі жаңа ортаға көшіріп
отырғызу немесе қоректік ортаға оларды өздеріне адсорбциялайтын заттарды
қосу, атап айтқанда, активтелген көмір, поливинилпирролидон, т.с.с.
Эксплантты өсіре бастағанда және көбейтуді өткізгенде қоректік ортаның
құрамы күрделі болады, ал тамырландыру үшін қоректік ортадағы заттардың
саны да, мөлшері де азайтылады.
Қоректік орта минералдық негізі немесе сұйылтылған МС ортасы
ауксиндермен толықтырылады. Кей кезде тамырлануды жиілету үшін ауксинді
ортаға қоспай өркендердің өздерін онымен өңдейді. Бұл тәсіл ағаштар мен
бұталарды микрокөбейткенде жақсы нәтиже береді. Бұл жағдайда каллус аз
түзіліп, тамырлар тезірек шығады.
- Физикалық факторлардың ішінде ең маңыздылары жарық. Морфогенез
процестеріне өте жарық жағдайлардың керегі жоқ. 1000-3000 лк 14-16 сағат
фотопериоды жетіп жатады. Өсімдіктерді топыраққа көшіруге дайындағанда
оларға 10000 лк жарық түсіріп баптайды [3,17,18,19].
- Өсімдіктерге ең жақсы температура шамамен 25оС. Бірақ әрбір түрдің
табиғатта температураға талабын еске алу керек. Мысалы, пиязшықты
өсімдіктер үшін табиғатта ең жақсы температура 18оС болса, монстера үшін -
30оС болады.
Жеміс-жидек өсімдіктерін in vitro жағдайында өсіргенде күн ұзақтығы -
16 сағат, жарықталу - 4000-5000 лк, жарық көзі - ЛДЦ- 40 типтік
люминесценттік лампалар, күндізгі температура - 22-26оС, түнгі - 18-21оС
болады [17].
In vitro жағдайында құнды өсімдіктерді алу үшін су алмасудың маңызы
зор. Өсімдіктерде су алмасу бұзылғанда витрификация деген жағымсыз құбылыс
орын алады. Витрификация кезінде өсімдік клеткалары ісінеді, сабақтары
жуандайды, жапырақтары ұзарып, майысып, суланып, әйнек тәрізді болып
кетеді. Бұл морфологиялық өзгерістерге қоса жапырақтардың құрғақ массасы
төмендейді. белок, хлорофилл, целлюлоза, лигнин мөлшері азаяды, ал
кальцийдің мөлшері артады. Жапырақтың су кеңістігі үлкейіп, бос газ
кеңістігі азаяды. Осының әсерінен өсімдік кейін келе жойылады. Бұл
құбылыстар көбінде сұйық ортада өсіргенде байқалады.
Сонымен, клондық микрокөбейту әдісінің тиімділігі әр түрлі
факторлармен шектеледі, бірақ олардың теріс әсерлерін әдісті жетілдіру
арқылы жоюға болады.
2.1.3 Жеміс-жидек өсімдіктерін клондық микрокөбейту
Қазіргі таңда, асептикалық in vitro жағдайында өсімдік ұлпаларын
өсірудің соңғы биотехнологиялық әдістері бүлдірген, таңқурай, қара қарақат,
шие, алма, өрік сияқты көптеген жеміс-жидек өсімдіктерін зиянкес аурулардан
арылту және көбейту үшін кеңінен қолданылуда. Ғалымдардың жан-жақты
зерттеулері нәтижесінде, бүлдірген сорттары да әртүрлі инфекциядан
сауықтандырылып, бір өсімдіктен бірнеше миллион регенеранттар алынып,
жаппай клондау әдісімен өндіріс технологиясы жасалынуда [8,9,10,18]. Бұл
әдіс біраз дамыған елдерде өндіріске қойылуға технологиялық негіздері
жасалынғанмен оның жаңадан шығарылған өнімділігі мол аса бағалы сорттарын
тез арада ысырапсыз көбейту маңызды мәселеге жатады [19,20,29,30].
Бүлдіргеннің көптеген сорттарының in vitro жағдайында біргелкі
дамымайтындығы белгілі, ол тек генотипке ғана емес, көбейту үшін алынған
экспланттарының ерекшеліктеріне де байланысты. Экспланттар ретінде көбінесе
сабақтың базальды бөліміндегі қауыз апекстері және өркен мұртшалары
қолданылады [8,29,30,20]. Қауыз апекстері көбінесе жерге жанасып
жатқандықтан ұлпасының сыртқы қабаттары былғаныш болады, сондықтан өркен
мұртшаларын қолданған жөн. Көптеген авторлардың зерттеулеріне қарағанда,
алынған экспланттардың мөлшері 0,5-3,0 мм ден аспауы керек, себебі одан
үлкен мөлшердегі экспланттарды қолдану in vitro жағдайында алынған
өсімдіктердің вирустық инфекциялардан құтылуына кепілдік бермейді [2,3,4].
Экспланттар көлемі өсімдіктің әртүрлі бөлімінен алынуына байланысты өзгеше
болатынын ескерту керек. Мысалы, қауыз апекстерінің көлемі өркен-
мұртшаларынан алынғанынан екі есе асып түседі. Бір өсімдіктің апекстерінің
ұзындықтары да 0,5-1,0 мм аралығында болуы мүмкін. Ал вирустарға келетін
болсақ, жалпы пікір бойынша, неғұрлым апекс құралатын меристема ұлпаларының
көлемі аз болған сайын олардың көбеюіне мүмкіндік жоқ. Бұны көңілге ала
отырып, эксплант көлемінің қатаң шектелуін нақты деп әрдайым есептеуге
болмайды. Көптеген зерттеулердің нәтижесінде, эксплант көлемі кіші болған
сайын оның өміршеңдігі нашарлайтыны дәлелденді [3,4]. Сондықтан апекс
меристемасын жан-жағында қоршаған екі жаңа дамыған жапырақшаларымен бөліп
алған жөн, мұндай экспланттың көлемі 0,8-1,0 мм болуы мүмкін. In vitro
жағдайда жеміс-жидек өсімдіктерін меристемамен көбейтіп өсіру, патогенді
микрофлорадан арылған генетикалық біркелкі таза өсімдік көшеттерін алуға
мүмкіндік туғызады.
Қоректік ортаның құрамына, оған қосылған фитогормондардың деңгейіне
байланысты өсімдік ұлпаларының әрбір сортқа, түрге тән морфогенетикалық
өзгерістері болатыны белгілі. Жеміс-жидек өсімдіктерін in vitro жағдайда
меристемамен көбейтуде көбінде Мурасиге-Скугтың макро-және микроэлементтері
бойынша модификацияланған орталарын қолданамыз. Қоректік орта құрамы
Мурасиге-Скуг бойынша минералды тұздар, 0,5 мгл В1, В6, РР витаминдері, С-
1,0 мгл, глюкоза- 30 гл, агар- 5,5 гл болады [2,4,5,6,16,27].
Алғашқы экспланттар ретінде термотерапиядан өткен, өсімдік
өскіндерінен бөлініп алынған 0,25-0,5 мм көлемді меристемалық төбешіктер
қолданылды.
Жеміс-жидек өсімдігін in vitro жағдайға енгізу эксплант көлеміне
байланысты. Егер эксплант көлемі 0,3 -0,5 мм болса, оның регенерациялану
қабілеттілігі өте жоғары болады. Ал эксплант көлемі 0,2-0,3 мм аралығында
болса, экспланттың регенерациялану қабілеттілігі өте төмен болады [2,3].
Эксплантты ортаға енгізуде қоректік ортада тіршілік ете алатын
жағдайын жасау, яғни, цитокинин заттарын қосу және олардың өсуін
қадағалау керек.
Өсіру жағдайлары: күн ұзақтығы- 16 сағат, жарықталу-4000-5000 лк,
жарық көзі- ЛДЦ- 40 типтік люминесценттік лампалар, күндізгі температура-22-
26оС, түнгі- 18-21оС болады [17].
Эксплантты тамырландыру кезеңінің алдында ұзақ өсіру фазасын енгізу
қажет. Ол үшін БАП-0,1 мгл бар ортаға отырғызамыз. Мұндай концентрацияда
экспланттардың қалыпты пролиферациясы жүзеге асады. Жекеленген меристемалық
төбешіктер бірінші ай бойы жапырақты түзеді. Ортаны ауыстырған соң
эксплантаттар 3-6 мм ұзындықтағы өскіндер береді. Өскіндер әр 3-4 апта
сайын өткізген 2-3 пассаждан кейін 1-3 см-лік ұзындықта болады. Ортаның
жаңалану эффектісі өте айқын көрініп тұрады. Бұл уақытта жекеленген
өркендердің жапырақтарының қолтықтарында бүйірлік өркендерден шыққан
бүршіктер пайда бола бастайды. Ал кейбір эксплантаттарда жапырағы қоректік
ортаға тура жанасып қалса, жапырақтың ортасында бүршіктердің пайда болуы
байқалады. Бұл бүршіктерді бөліп алып, жаңа қоректік ортаға ауыстырған соң,
олардан өркендердің түзілуі байқалады. Жапырақ бүршіктерінен шыққан
өркендердің бүйірлік бүршіктің өркендерінен еш айырмашылығы болмайды.
Бүршіктердің тікелей жапырақта пайда болуы БАП-тың меристемалық
белсенділігі бар ұлпаларға (камбийлі) морфогенетикалық әсерінің нәтижесінде
болуы мүмкін. Алғашқы екі-үш пассаждан кейін БАП концентрациясын 3 мгл
дейін көбейту қосымша бүршіктердің жаппай өсуіне әкеледі. Бірақ, бұл кезде
негізгі өркендердің өсу жылдамдығы еш азаймайды. Осылайша, өркен саны
геометриялық прогрессиямен өседі. Бұл кезде тек сорттық ерекшеліктер
көрінеді. Олар- қосымша жарып шыққан бүршіктер саны мен өркендер саны
бойынша сорттық ерекшеліктер.
Меристемалық төбешіктерді бөліп алған соң бірден құрамында 1 мгл ден
көп концентрацияда БАП бар ортаға салу олардың ұсқынсыз дамуына әкеледі.
Мұндай ортада жекеленген меристемалық төбешіктер өскін бермейді, олардың
түбі қаптап өсіп кетеді, экспланттар шар тәрізді болып, дамуға қабілетін
жоғалтады. БАП концентрациясын жоғарылату тек қана нақты құрылымы бар
мүшелерге жақсы әсер етуі мүмкін. Сонда да, өсіру барысында
эксплантаттардың бейімделуін, меристемалық төбешіктер мен өркендердің
ортаға енгізілген препаратқа әртүрлі сезімталдығын да жоққа шығаруға
болмайды [18].
Жекеленген меристемалық төбешіктерден қарақат алудың әдісін өңдеудің
келесі кезеңі - алынған өркендердің эффективті өсу жағдайларын өңдеу.
Меристемалық төбешіктерге арналған 0,05-0,1 мгл концентрацияда индолилмай
қышқылын (ИМҚ) қолданудың тиімділігі аз болды. Қарақат өркендерінің
тамырлануы үшін темір хелаты көп, ИМҚ - 2,5 мгл болатын Мурасиге-Скуг
негізіндегі ортаның 2 есе сұйылтылған түрі тура келеді . Мұндай орта
бірнеше рет қайталанса, өркендердің тамырлануын 70-100%-ға көтереді екен.
Қарақаттың тамырланған пробиркалық өсімдігі ары қарай дамуы үшін
залалсызданған субстратқа (31 қатынастағы торф пен құм қоспасы)
отырғызылады. Ол жерде олар вирустық инфекцияның бар-жоқтығын тексеру
мүмкін болатын көлемге дейін өсіріледі [19].
БАП бар ортада дамыған өркендер меристемалық төбешіктерге қарағанда
жұмыста ыңғайлылау құрылымдар болып табылады. Оларды қолданып өсімдік алу
оңайырақ. Бұл туралы 20 мгл концентрациядағы ИМҚ ерітіндісімен өңдеген
соң, қоректік ортадан алынған өркендерді тікелей топырақ субстраттарында
тамырландыру дәлел бола алады [20,5].
Қарақат эксплантының пролиферациясын БАП күшейтеді. БАП-тың 0,5-1мгл
концентрацияда меристемалық төбешіктердің дамуын күшейтеді. БАП-тың
концентрациясын 1,5 мгл көбейткенде қосымша бүршіктер пайда болып,
төбешігі өседі.
2. МАТЕРИАЛДАР МЕН ӘДІСТЕР
2.1 Зерттеу обьектілері
Зерттеуге ҚР АШМ көшеттер бағының коллекциясынан бүлдіргеннің
шаруашылыққа маңызы зор, аса таңдамалы сорттары Адди, Редгонтлит, Чезена,
Сладкий Чарли алынды.
Экспланттар ретінде көбінесе сабақтың базальды бөліміндегі вегетациялық
сабақтың көлемі 1-1,3 см қауыз апекстері және өркен мұртшалары қолданылды
2.2 Зерттеу әдістері
2.2.1. Материалдарды залалсыздандыру
In vitro жағдайына енгізу кезеңінде, әрбір жаңадан отырғызар алдында
экспланттардың неғүрлым көбірек өміршеңдігі сақталуы үшін олар
серпілтететін заттармен: лимон, қытай пияз шырынымен және өсімдік
қалемшелерінің өміршеңдігін жоғарылататын арнайы эпин препаратымен
(0,01%) 5-10минут ұстап шайып алынды.
Өсімдіктерді клондық микрокөбейтуде эксплантты in vitro жағдайға енгізу
маңызды болып табылады. Өйткені, олардың ұзақ уақыт вегетативті көбеюі
өсімдіктердің жаппай патогенді микрофлора және вирустық аурулармен
залалдануына әкеледі. Осыған байланысты, алғашқы экспланттарды саңырауқұлақ
және бактериялық инфекциялардан тазалау үшін әртүрлі залалсыздандырушы
агенттерді қолданудың тиімділігі зерттелді.
Таңқурай ұлпаларын залалсыздандыру үшін әртүрлі химиялық заттар
қолданады. Көбінесе құрамында белсенді хлоры бар заттар (натрий
гипохлориті, хлорлы әк, кальций гипохлориті, хлорамин), екіхлорлы сынапты
(сулема), сутектің асқын тотығы, этил спирті қолданылды.
Сонымен бірге, өсімдік материалын залалсыздандыру үшін басқа
залалсыздандырушы агенттер: эпин препараты, құрамында хлоры бар Domestos,
дихлоризоциан қышқылының натрий тұзы бар Деохлор препараты, калий
перманганаты, сутектің асқын тотығы және сулеманың ерітінділері қолданылды.
Эпин экстра – эпибрассинолидтің 0,025 гл-і. Эпин препараты Россияның
Москва қаласында дайындалған жеміс-жидек және т. б. көкөніс өнімдерін
жоғарылату үшін олардың қалемшелерін отырғызар алдында арнайы өңдейтін
заттар тобына жатады. Бұл препараттың өскіндердің суыққа төзімділігін
арттыратын, әртүрлі стресс жағдайынан қорғайтын және өсімдік ұлпаларының
зақымдалған клеткаларын қалпына келтіріп, қолтықша бүршіктерінің белсенді
дамуына септігін тигізетін қасиеті бар. Сонымен бірге, өсімдік ұлпаларының
әсіресе, алғашқы даму сатысында зақым келтіретін көптеген саңырауқұлақ
ауруларынан қорғайды. Өсімдік ұлпаларындағы жағымсыз нитраттарды, ауыр
металдарды, радионуклидтерді бейтараптандыратын да қабілеті бар екені
нұсқауында көрсетілген. Бұл препарат тұқымдардың тез өсуін, өсімдіктің тез
дамуы мен көбеюін қамтамасыз етеді; тұқым мен тамырдың өсіп дамуын
белсендетеді; өсімдіктерді аяздан және басқа стресс жағдайларынан қорғайды;
фитофтороз, пероноспороза, паргие, бактериоз, фузариозға төзімділікті
қамтамасыз етеді; бүйір өскіндерінің түзілуін қарқындату арқылы әлсіз
өсімдіктерді күшейтіп, ескі өсімдіктерді жасартады; Таңқурайды отырғызу
алдында оны 100 мл суға 4 тамшы препарат қосып өңдейді. Экспланттарды
ерітіндіде 20oC-та 8-10 сағат шаяды.
Domestos – белгілі үй шаруашылығында пайдаланылатын препарат. Құрамында
хлоры болғандықтан, тат басқан жиһазды тазалайды.
Екіхлорлы сынап (сулема) HgCl2 әртүрлі өсімдік обьектілерін
залалсыздандыратын жақсы зат. Қосынды улы болғандықтан, оның концентрациясы
мен өңдеу уақытын дұрыс таңдау керек. Әдетте сулеманың дистильденген судағы
0,1%-дық ерітіндісін қолданады. Сулеманың залалсыздандырушы әсері
ерітіндіге бірнеше тамшы беттік активті зат қосқанда артады. Сулеманың 0,1%-
дық ерітіндісінде орташа залалсыздандыру уақыты тамыртүйнектер үшін 15-20
мин; тұқым үшін 10-20 мин; шөптекті өсімдіктердің жапырақтары, бұтақтары
үшін 4-8 мин. Ұлпаны сынапты препарат ерітіндісінде өңдеген соң, 4-5 рет 10-
15 минуттан дистильденген сумен жуу керек.
Деохлор - өсімдіктерді микробтардан тазартатын препарат. Оны алдымен
суға ерітіп, қажет өсімдігімізді сол ерітіндіге бірнеше минутқа ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
БИОЛОГИЯ ФАКУЛЬТЕТІ
Ботаника және экология кафедрасы
БІТІРУ ЖҰМЫСЫ
БҮЛДІРГЕННІҢ АСА БАҒАЛЫ СОРТТАРЫН IN VITRO ЖАҒДАЙЫНА ЕНГІЗУ МЕН ӨСІРУДІҢ
ЕРЕКШЕЛІКТЕРІ
Орындаған: ___________________________ А. Саттар
Ғылыми жетекшілері:
б.ғ.д., профессор ______________________Н.М. Мұхитдинов
б.ғ.к., а.ғ.қ. ______________________З.Р. Мұхитдинова
Норма бақылаушы К,Т. Абидкулова
Қорғауға жіберілді:
Ботаника және экология
кафедрасының меңгерушісі
б.ғ.д ., профессор С.С. Айдосова
АЛМАТЫ, 2008
Мазмұны
Реферат ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 3
Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .4Әдебиетке
шолу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ...6
1.1 Клондық микрокөбейту және оның
маңызы ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... . 6
1.2 Клондық микрокөбейтудің
әдістері ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..7
1.2.1 Апикальды меристеманы
өсіру ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ...9
1.2.2 Қолтық бүршіктерінің дамуын
қоздыру ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...9
1.2.3 Каллустың бөлініп көбеюі және одан өсімдіктің регенерациясы...10
1.2.4 Клондық микрокөбейтуге әсер ететін
факторлар ... ... ... ... ... ... .. ...11
1.2.5 Жеміс-жидек өсімдіктерін клондық
микрокөбейту ... ... ... ... ... ... ...13
2.Материалдар мен
әдістер ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... 17
2.1 3ерттеу
объекттері ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .,
... ... ... ... 17
2.2 3ерттеу
әдістері ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ...17
2.2.1 Материалдарды залалсыздандыру
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 19
3 Нәтижелер және оларды
талқылау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..20
3.1 Бүлдірген экспланттарын залалсыздандыратын заттарды таңдау ... 20
3.2 Бүлдірген өсімдігінің in vitro жағдайында өсуі мен көбею жиілігі...27
3.3 Бүлдірген бұтақшаларында меристема төбешіктерңнің пайда болуы. 34
Қорытынды ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... 37
Пайдаланған әдебиеттер
тізімі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... 38
-
Реферат
Бітіру жұмысының тақырыбы "Бүлдіргеннің аса бағалы сорттарын in
vitro жағдайына енгізу мен өсірудің ерекшеліктері".
Жұмыс көлемі -41, кесте саны -10, фотосурет саны -6, диаграмма-1.
Пайдаланған әдебиеттер саны -52
Кілтті сөздер - эксплант, асептика, залалсыздандыратын заттар,
фитогормондар, меристема, дифференциация.
Жұмыстың мақсаты - Қазақстанда ұлттық гермоплазма банкін толықтыру
үшін бүлдіргеннің өнімділігі мол, бағалы сорттарын (Адди, Редгонтлит,
Чезена, Сладкий Чарли) in vitro жағдайына енгізіп, жаппай көбейтіп өсірудің
технологиясын жақсарту болды.
Зерттеу әдістері - Қоректік ортаны дайындау үшін Ф.Л. Калинин, В.В.
Сарнацская, В.Е. Полищук әдістерін қолданып дайындадық [8,19]. Асептикалық
жағдайға енгізілген өсімдіктерді ары қарай дамытып өсіруге өсуді реттеуші
гормондардың: бензиламинопуриннің (БАП), индолилмай қышқылының (ИМК),
гиберелл қышқылының (ГК) әртүрлі деңгейдегі концентрациясы қосылған
Мурасиге және Скуг (МС) [49], Ли және де Фоссард [51], Боксус орталары
[52]. қолданылды. Тәжірибелер 5-10 рет қайталанып істелінді. Өсімдіктерді
микроклондау әдісімен көбейтуге арналған пробиркалар 3-5 мың люкс жарықта,
16-сағат фотопериодта, +23-25оС температура сақталатын арнаулы өсіретін
бөлмедегі сөрелерге қойылды. In vitro жағдайына енгізу үшін отырғызылған
өсімдіктер апта сайын мұқиат қаралып, экспланттардың өлгендері, тірілері,
зең басқандары есептелді. Зерттелуге алынған генотиптерді жаңалап
отырғызған сайын өркендердің өсу қалпы және жаңадан пайда болған
бұтақшалардың саны есептелді. Әртүрлі генотиптің отырғызылған сайын орташа
көбею коэффициенті мына формуламен есептелді: P= ab·c: a – қайтадан пайда
болған бұтақшалардың саны, b – көбейту үшін отырғызылған бұтақшалар саны, c
– отырғызу саны.
Нәтижелер:
1.Залалсыздандырушы заттардың әртүрлі схемаларын қолдана отырып
бүлдіргеннің зерттеуге алынған сорттары Адди, Редгонтлет, Чезена және
Сладкий Чарли in vitro жағдайына енгізілді. Бұл жүргізілген зерттеулерден
бұрыннан жиірек қолданылып жүрген құрамында сынап бар сулема және диацид
улы заттарын қолданбай басқа залалсыздандырушы заттарды да пайдалануға
болатындығы дәлелденді.
2. In vitro жағдайына енгізілген бүлдірген сорттары Адди, Редгонтлет,
Чезена және Сладкий Чарли микроклон әдісімен көбейтіліп өсірілді.
Кіріспе
Елімізде аса бағалы жеміс-жидек өсімдіктерінен аурулардан сауыққан
экологиялық таза көшеттер алып өндіріске қажет шикізат қорын кеңейту өзекті
мәселенің бірі болып саналады.
Жеміс-жидек өнімдерінің аса жоғары сұраныстарына байланысты елімізде
ауыл-шарушылық өндірістерінде өсімдіктерді әртүрлі инфекциядан арылту және
тезірек көбейту мәселелері өзекті болып саналады. Өсімдіктерді in vitro
жағдайында ұлпалары арқылы көбейту әдістерін пайдалана отырып, бір жағынан
оларды инфекциялық аурулардан арылтып қана қоймай, екіншіден,
цитокининдердің көмегімен апекс белсенділігін құлшындырып жаңадан бүршіктер
қалыптасу және даму процестерін тездетуге мүмкіндік туады [1,2,4,29].
Асептикалық in vitro жағдайында өсімдік ұлпаларын көбейту әдістері селекция
жұмыстарында, қолданбалы ботаникада және биологиялық алуан түрлерді сақтап
қалу және көбейту мәселелерін шешуге кеңінен қолданылады. Бұл әдіспен
өсімдіктердің түрі мен сорттарына қарай, көбейту коэффициентін тез арада 1
1000 ден 1 600000 ға дейін арттыруға болады. Көбейту нәтижесінде,
регенеранттар әртүрлі зиянкес патогенді микрофлорадан арылып, өзгеріске
ұшырамай өздерінің жоғары генетикалық біргелкі сапалық қасиеттерін сақтап
қалады. Бұндай өсімдіктер патогенді микрофлорадан арылған генетикалық
біркелкі таза болады. Қазір Ресей мен Қазақстан ғалымдары жеміс-жидек
өсімдіктерін in vitro жағдайында көбейтіп өсіру әдісімен айналысуда.
Мақсаты іn vitro жағдайында клондық микрокөбейту арқылы өнімділігі жоғары,
сыртқы факторларға төзімді, патогенді микрофлорадан арылған бастапқы
өсімдік түріне тән барлық белгілері мен қасиеттері сақталған өсімдікті алу.
Біздің ендігі міндетіміз клондық микрокөбейтудің әдістерін жетілдіріу
арқылы клондық микрокөбейтудің тиімділігін пайдалану. биотехнологиялық
өндірісте кеңінен дамыту болып табылады.
Елімізде гермоплазма банкін құру үшін көбейтілген құнды өсімдіктер
түрлері, сорттары мен формаларын асептикалық жағдайда температураны реттеп
ұзақ ұақыт сақтауға болады.
Жеміс-жидек өсімдіктерінің ішінде бүлдірген (Fragaria) жер бетінде
кеңінен таралған. Оны аса жоғары экологиялық бейімділігіне қарай
өнеркәсіпке дайындау үшін әртүрлі топырақ-климат жағдайларында өсіруге
болады.
Қазіргі таңда әлем тарабында сәтті жүргізілген селекциялық жұмыстардың
нәтижесінде тек қана егістікте емес, жабық грунтта тез арада жеміспен
базарды қамтамасыз ететін бүлдіргеннің өнімділігі мол сорттары пайда болды.
Бірқалыпты климат аймақтарында бүлдірген ең негізгі жеміс-жидек түріне
жатады. Оның бір жылдық және екі жылдық сорттары аса жоғары және ұдайы
өнімділігімен, тез арада жеміс беруімен, жемістерінің сапалылығымен керекті
өнім ретінде өндіріс қажеттігін қамтамасыз етеді. Бүлдірген жемісінің
дәмдік сапалылығы, оның емдік қасиеттері тамаққа қолданылатын жеміс ретінде
және одан өңделген өнімдер күннен-күнге өсіп отырған өндіріс қажеттілігіне
жаратылады.
Бүлдіргеннің (Fragaria ananassa) көптеген вирустық және микоплазмалық
ауруларға шалдығатыны белгілі. Аурулардан сауықтыруға бүлдіргеннің аса
бағалы сорттарын in vitro жағдайында меристема арқылы көбейтіп, генетикалық
біркелкі таза өсімдіктер алып Қазақстанның ұлттық гермоплазма банкін
толықтыруға мүмкіндік туады. Жұмыстың мақсаты Қазақстанда ұлттық
гермоплазма банкін толықтыру үшін бүлдіргеннің өнімділігі мол, бағалы
сорттарын (Адди, Редгонтлит, Чезена, Сладкий Чарли) in vitro жағдайына
енгізіп, жаппай көбейтіп өсірудің технологиясын жақсарту болды.
1.ӘДЕБИЕТТЕРГЕ ШОЛУ
1. Клондық микрокөбейту және оның маңызы
Өсімдіктерді микроклон арқылы көбейту деп өсімдіктердің in vitrо
жағдайында жыныссыз жолмен көбеюін айтуға болады. Соның нәтижесінде пайда
болған өсімдіктер бастапқы өсімдікпен және өзара бір-бірімен генетикалық
тұрғыдан айнымастай бірдей болады. Сонымен, клон дегеніміз жыныссыз жолмен,
яғни вегетативтік көбею жолымен түзілетін организм [1,2,16,20,35].
Маманданған ұлпаның тірі клеткалары лайықты қоректік ортада өсіргенде
өздерінің тотипотенттік қасиетін жүзеге асырып, регенерация арқылы бүтін
өсімдікке яғни, бастапқы өсімдік түріне тән барлық белгілері мен қасиеттері
сақталған бүтін өсімдікке айнала алады. Бұны микрокөбейтудің негізіндегі
өсімдік клеткасына тән тотипотенттілігімен түсіндіруге болады. Бұл клондық
көбейту технологиясының негізін қалайды [2,3,28].
Клондық микрокөбейту дегеніміз - ұлпа мен клетка культурасында
өсімдіктердің жаппай жыныссыз көбеюі. Бұл кездегі алынған өсімдіктер
түрлері алғашқысымен генетикалық жағынан бірдей. Микрокөбейтудің негізінде
өсімдік клеткасына тән тотипотенттілігін қолдану жатыр [1,27,49,46].
Бұл әдіс вегетативті көбейту әдістеріне қарағанда бірнеше мыңдаған есе
көп өсімдіктердің біртекті отырғызылатын көшеттерін көп мөлшерде алуға
мүмкіндік береді. Микрокөбейтудің коэффициенті аз уақытта немее жылына 105-
106 өсімдікке жетеді. Мысалы, қарақат, гербера өсімдіктерінің бір түрін
көбейтіп өсіруде жылына бір миллион өсімдік алуға болады [2,9,10].
Клондық микрокөбейту селекция процесін тездетеді. Селекция саласында
жаңа сорттарды 10 жылдың орнына 2-3 жылда алуға болады. Ұлпалардан
өсімдіктерді көбейтуде олардың патогенді микроорганизмдерден және
вирустардан арылуы жүретіні өте маңызды. Микрокөбейту процесінде
өсімдіктерді қайтадан вируспен жұқтыру мүмкіндігі жоқ. Себебі ұлпалардан
алынатын өсімдіктердің біртектілігі әсер етеді. Осылайша микрокөбейту
арқылы өсімдіктің сапасында біраз жақсартуға болады. Ұлпалардан өсімдікті
жыл бойы өсіруге болады. Ал бұл даму циклында тыныштық кезеңі бар
өсімдіктер үшін өте маңызды. Ұзақ ювенильді фазасы бар өсімдіктерді өсірген
кезде, ювенильді фазадан репродуктивті фазаға тез ауыстыруға болады.
Соңында, ұлпалар культурасы әдісімен вегетативті қиын немесе мүлдем
көбеймейтін өсімдіктерді көбейтуге болады [3,2,9,10].
Клондық микрокөбейту мен морфогенезін зерттеуге арналған көптеген
тәжірибелік жұмыстар бар болғанымен, клондық микрокөбейту технологиясы
көптеген ауылшаруашылық өсімдіктері үшін әлі шығарылмаған. Бұның себептері-
нақты, жақсы жұмыс істейтін әдістердің болмауы, олардың күрделілігі,
қоректік ортаның аз кездесетін және қымбат компоненттерді пайдалануы,
өсімдіктердің морфогенетикалық потенциясы туралы білімнің аздығы болып
отыр.
Клондық микрокөбейтудегі алғашқы жұмыстар ХХ ғасырдың 50 жылдарының
соңында жүргізілді. Мысалы, Ветмор және Морель деген ғалымдар шаңжапырақ
өсімдіктерінің апекстерін көбейтіп өсірді. Олар өте қарапайым құрылымды
ортаны қолданды: Кноп қоректік ерітіндісі және сахароза (3%). Алайда,
жоғарыда айтылған өсімдіктердің апикальды меристемасының осы қоректік
ортада көбейіп өсуі нәтижесіз болып шықты [4,46,,47,48].
Морель картоп пен георгинаның апикальды меристемалары қоректік орта
витаминдермен, глутатионмен, цистеинмен, кинетинмен байытылған жағдайда
каллус түзе алатынын анықтады. Гибберелл қышқылын қосқан кезде кішігірім
өскін дамыды. Алайда, оның өсуі әлсіз болып, 2-3 айдан соң ұзындығы 1 см-ге
де жетпей тоқтап қалды. Бұл Кноп қоректік ерітіндісіндегі К+ және NH4+
иондары аз концентрацияда болғандықтан, шықпай қалғандығы соңынан
анықталады. Кейін қоректік ортаға 13,46 мМ және 7,56 мМ концентрацияда KCl
мен (NH4)2SO4 қосқанда сабақтың апикальды меристемасының өсуі жақсарып,
өсімдіктің дамуы да жақсарды. Осы негізінде, кейбір қалампыр, хризантема,
картоп, т.б. шөптесін өсімдіктердің апикальды меристемаларының өсуін
жақсартатын құрамы: NH4NO3- 12,49мМ, KNO3- 9,89мМ, CaCl2- 2,25мМ, MgSO4
7H2O-0,50мМ, KH2PO4- 0,91мМ, сахароза- 58,42мМ, гибберелл қышқылы- 28,8
мкМ болған қоректік орта құрамы шығарылды [44,47,48].
Апикальды меристемадан алынған өсімдіктер вирустық инфекциядан таза
болады, себебі меристемада өткізгіш жүйелері жоқ, ал плазмодесмалар көлемі
өте кішкене. Сөйтіп, алғаш рет картоптың бірнеше бағалы сорттарын
вирустарынан сауықтыру мүмкін болды. Бұл кезде апикальды меристеманы
түйнектен оқшаулап көбейтіп өсірді [8,30,34,35]. .
Клондық микрокөбейту әдістерінің артықшылығы көбірек. Сондықтан жақын
уақытта жидекті, көкөністі, дәрілік және тағы басқа өсімдіктердің жаңа және
шаруашылық үшін бағалы сорттарының отырғызылатын көшеттерін алудың
биотехнологиясын жақсартуға болады [36,37,35].
Микрокөбейту әдісінің дағдылы вегетативтік көбеюмен салыстырғанда
бірталай артықшылықтары бар, атап айтсақ:
← Микрокөбейту арқылы өсімдіктер вирустар мен патогенді
микроорганизмдерден сауықтырылады.
← Сұрыптау процесін жылдамдатып жаңа сорттарды тез көбейтіп, олардың
ауылшаруашылық өндірісіне пайдалану мерзімін едәуір қысқартады.
← Вегетативті жолмен көбейе алмайтын өсімдікті, мысалы, пальманы тек in
vitro жағдайында көбейтуге болады. Осы әдіспен өнеркәсіп деңгейінде
бірқатар өсімдіктерді көбейтеді.
← Арнайы бөлмедегі сөрелерде орналасқан пробиркаларда жыл бойы мыңдаған
өсімдіктерді өсіру арқылы теплицалар алаңы үнемделеді.
← Кәрі бұтақтардан жас өсімдіктер алуға болады.
← Микрокөбейту арқылы әсіресе даму процесінде тыныштық кезеңі болатын
өсімдіктерді көбейтуге тиімді. Өсу процесін жыл бойы үзбеуге болады
← Көбею коэффициенті өте жоғары. Мысалы, гербера, бүлдірген, хризантема,
раушан өсімдіктерінің бір өсімдігінен in vitro жағдайда бір жылдың
ішінде 1 миллионнан астам клон өсімдіктер алуға болады. Алма ағашының
бір бүршігінен 8 айдың ішінде 60 мыңнан астам өркен шығады. Қарақаттың
бір бұтадағы меристемаларын бөліп алып, өсіріп, жылына 50 мыңға дейін
өсімдік алуға болады. Сонымен, микрокөбейтудің коэффициенті басқа
вегетативті көбейту әдістерімен салыстырғанда мыңдаған есе артық
[41,42,43].
Клондық микрокөбейтудің артықшылықтары айқын факт. Өсімдік өсіру мен
селекцияда оның мүмкіншіліктері зор болғандықтан, биотехнологиялық
өндірісте болашақта кеңінен дамиды.
1.2 Клондық микрокөбейту әдістері
Қазіргі кезде клондық микрокөбейту әдісінің бәріне ортақ классификация
жоқ. Алғашқы классификациялардың бірін Мурасиге шығарған. Ұлпалар
культурасындағы экспланттарда болатын морфогенетикалық реакциялар негізінде
мынадай әдістер шығарылды:
1) қолтық бүршіктерінің белсенделуі ;
2) қосалқы өскіндердің түзілуін қоздыру;
3) сомалық эмбриогенез;
Кейінгі жұмыстарында Мурасиге әртүрлі морфогенетикалық реакцияларға
негізделген микрокөбейтудің түрі өзгертілген классификациясын ұсынды:
1) қолтық бүршіктерінің белсенделуі;
2) қосалқы өркендердің экспланттан тікелей пайда болуы;
3) каллуста қосалқы өркендердің пайда болуы;
4) эксплантат клеткаларында сомалық эмбриогенезді қоздыру;
5) каллуста эмбриоидтардың пайда болуы;
6) Іn vitro пайда болған алғашқы сомалық эмбрион ұлпаларында қосалқы
эмбриоидтардың қалыптасуы.
3-6 әдіс қана алынған классификациядан бөлек, морфогенетикалық
процестермен байланысты микрокөбейтудің басқа да бөлінулері бар [49,54,45].
Клондық микрокөбейту процесін түбегейлі 2 түрлі түрге бөлуге болады:
1) өсімдікте бұрыннан бар бүршіктің дамуын белсендету (сабақ апексін,
сабақтың қолтық бүршіктерін);
2) бүршік немесе эмбриоидтардың түзілуін de novo қоздыру. Оның өзін 3
тәсілге бөлуге болады:
a) Эксплантаттың маманданған ұлпаларынан (репродуктивті мүшелер, эпидермис,
субэпидерма қабатының клеткалары) жинақталған құрылымдардың түзілуі;
б) эксплант клеткаларынан каллустың түзілуі;
в) суспензияда өсіп жатқан клеткалар мен ауыстырылып отырғызылатын каллус
ұлпасынан түзілуі.
Бұл классификацияның басқалардан айырмашылығы бүршіктерден пайда
болған өсімдіктер арасындағы түбегейлі айырмашылық. Яғни, олардың ата-
аналық түрлерге генетикалық толық ұқсастығы [5,6]. Яғни, микроклонды
көбейту әдістерін бөлгенде тек олардағы морфогенетикалық процестерге
негізделу керек.
Клондық микрокөбейту әдісі әсемдік (қалампыр, мамыргул), көкеніс
(картоп, томат, сарымсақ), жеміс-жидек (қарақат, алма, жүзім) дақылдарын
көбейту үшін қолданылады. Бұл әдіспен дәнді дақылдар мен астық
тұқымдастарды көбейту қиын.
Сондықтан бұл әдіс тек селекциялық жұмыстарда шағын көлемде қолданылады
[47,18,48,49].
1.2.1 Апикальды меристеманы өсіру
Соңғы кезде вирусы жоқ өсімдіктерді алу үшін апикальды меристеманы
өсіру, термоөңдеу, хемотерапия және вирустарды сарапқа салу қолданылуда.
Әдетте, вирустан құтылу үшін іn vitro жағдайындағы регенерант
өсімдіктерін алады. Олар инфекцияға шалдықпайды. Яғни, вирустар қоздыратын
аурулармен куресудің негізгі жолы, апикальды меристеманы өсіру [8,27,40].
.
Бұл әдістің негізін қалаған француз ғалымдары П. Лимассе мен П.
Корнуе. Олар көрсеткендей, теңбіл кеселді темекінің жапырақтарында
вирустың концентрациясы өсімдік бүршігінің апексіне (ұшына) жақындағанда
төмендеген. Өркен ұштарының, яғни, апикальды меристемалардың ұшындағы
бірнеше қабат клеткаларда вирус тіпті болмаған [8,3153,54].
Вирустардың меристема ұлпасында көбеймеуінің себептері жөнінде
әртүрлі пікірлер бар. Бір зерттеушілер болса, меристемада вирустардың
болмауын олардың бір клетка мен екінші клетка арасында баяу қозғалысымен
түсіндіреді. Себебі, меристемада өткізгіш жүйесі жоқ, ал плазмодесмалар
көлемі өте кішкене. Басқалар болса, бұл фактіні меристемаларға тән ерекше
вирустық нуклеопротеидтердің синтезін тежейтін метаболизммен түсіндіреді
[9,5].
Өсімдіктерді вирус ауруларынан сауықтыру мақсатымен апикальды
меристеманы өсіру әдісін бірінші пайдаланған 1952 жылы Г. Морель мен К.
Мартин болды. Олар бұл әдісті нағыз гүлді теңбіл вирусынан сауықтыру үшін
қолданған [48].
Аурудан таза, сауықтырылған өсімдіктері алыудың тағы бір әдісі жылумен
өңдеу. Жылумен өңдегенде өсіп келе жатқан өркен ұштарында вирустың көбеюі
күшті тежеледі, сондықтан жаңадан пайда болған меристема клеткаларында
вирустың болмауы мүмкін. Жылумен өңдеу нәтижелі болу үшін донорлық
өсімдіктерді жоғары температурада (34-40оС) өсуге жақсы жағдай жасап
ұзағырақ ұстау қажет. Сол кезде жаңадан өсіп шыққан өркендердің ұштары
вирустан алас болады. Бірақ барлық өсімдіктер ұзақ мерзімді жылумен өңдеуге
шыдамайды. Кейде апикальды меристеманы өсіру үшін вирустық тесттер арқылы
сұрыптау тәсілдері де қоса қолданылады.
1.2.2 Қолтық бүршіктерінің дамуын қоздыру
Апикальды басымдылықтың деңгейі тұқым қуалаушы белгі болып табылады және
өсімдіктің әртүрлі мүшелеріндегі гормондық баланспен, фитогормондар
тасымалымен, трофикалық факторлармен байланысты. Қолтық өркенінің өсуін
қоздыру үшін апикальды өсуді тоқтату керек. Яғни, сабақ апексін алып тастау
арқылы немесе өсімдікті гормондық өңдеу арқылы жасауға болады. Апикальдық
өсуі әлсіз болып келген бұтақты және жартылай бұтақты өсімдіктер үшін
бұтақшаны бөлу тәсілдері әдеттегідей болып саналады. Ал, Виксон мен Тиманн
тәжірибелерінде бұршақ өсімдігінде апикальды өсуді, төбелік бүршікті алып
тастау арқылы жойылады. Көптеген жұмыстар арқылы цитокининдер синтезделетін
тамыр, әсіресе, тамыр ұштары. Сондықтан қолтық бүршіктерінің өсуі өсімдік
тамырының бар-жоқтығына тікелей байланысты екендігі анықталды. Қолтық
бүршіктердің өсуінде тамырдың әсерін экзогенді цитокининдермен өңдеу арқылы
алмастыруға болады [2,3,27].
Өсімдікте тек негізгі өркен (сабақ) дамығанда, төбелік бүршікті кесіп
алып тастап, кесілген жерге ауксин қосқанда қалпына келеді. Кинетинмен
өңдегенде қайта жойылады. Р.Г. Бутенко қоректік ортаға енгізілген кинетин
апикальдік өсуді жойып, рудбекия мен перилла бүршіктерін өсіруде көптеген
қолтық бүршіктерінің түзілуін болдыратынын көрсетті 2,3,5,6].
Тиманн мен Виксон теориясына сәйкес, өркен төбешігінің меристемалық
ұлпаларында түзілетін ауксин негізгі сабақ бойымен базипетальді
тасымалданады. Қажетті физиологиялық деңгейден көп мөлшерде жиналып қалса,
ауксин қолтық бүршіктерінің өсуін тежейді. Ауксиннің көп концентрациясының
әсерінен қолтық бүршіктеріндегі цитокининдер синтезі тоқтайды деген болжам
бар [51].
Қолтық бүршіктерінің өсуін қоздырып, қолтық өркендерін қолдану -
өсімдікті вегетативті көбейтудің қалыптасқан әдістерінің бірі.
Цитокининдердің физиологиялық әсері анықталып, оларды қолтық
өркендерін белсендету әдісімен өсімдіктерді микрокөбейту үшін қолдану
туралы көптеген мәліметтер пайда бола бастады. Осылайша, клондық
микрокөбейтуді қолтық өркендерін белсендету арқылы жасалатын әдіс -
апикальдық өсуді немесе негізгі өскінді жою, немесе көптеген қолтық
өркендерін түзуді қоздыратын цитокининдерді қоректік ортаға енгізу, кейде
тіпті екеуін де байланыстыруға негізделген. Барлық жағдайларда да дамыған
өркендерді бір-бірінен ажыратып, қолтық өркендерінің бөлініп көбеюін және
жоғары деңгейдегі өркендердің түзілуін қоздыратын қоректік ортада қайтадан
өсіреді [8,9,10].
БАП-тың 2,18-10,13 мкМ концентрациясы қарақат, жүзім,қара өрік
өркендерінің қолтық бүршіктерінің дамуын қоздырады. Авторлардың пікірі
бойынша, бір залалсыз күйде алынған өркен төбешігінен жылына бірнеше мың
өсімдік алуға болады [12,5,20,29,8].
Өсімдіктерді микрокөбейтуде негізгі мәселе қоректік ортаға
енгізілетін фитогормондар концентрациясы туралы болады. Мурасигенің
жұмыстарында цитокининдердің жоғары концентрациясы туралы мәліметтер бар.
Сонымен бірге, қоректік орта құрамы бойынша және қолтық бүршіктерінің
дамуын қоздыру үшін өсірудің жағдайлары туралы нұсқаулар беріледі.
Қазіргі кезде фитогормондардың жоғары концентрациясы алынатын
өсімдіктердің морфофизиологиялық ерекшеліктеріне және өсімдіктерді ұлпа
культурасында ұзақ уақыт бойы микрокөбейту мүмкіндігіне әсер ететіні туралы
көптеген мәліметтер бар. Қоректі ортада фитогормондардың концентрациясы
жоғары болса, отырғызылған эксплантаттардың көптеп өлуі байқалған.
Өркендерді өсіру процесінде ұлпаларда фитогормондар қажет
физиологиялық деңгейден артығырақ жиналып, олардың токсикалық әсері болады
[49,13].
Цитокининдердің жоғары концентрациясын қолдану көбеюдің жоғары
коэффициентін алу үшін қолдану өсімдіктердің морфологиялық өзгерістердің
пайда болуы, қолтық өркендерінің бөлініп көбеюінің басып төмендеуі,
өркендердің тамырлануға қабілеттілігінің азаюы сияқты клондық микрокөбейту
үшін жағымсыз әсерлер шақырады [18,19].
1.2.3 Каллустың бөлініп көбеюі және одан өсімдіктің регенерациясы
Каллустың бөлініп көбеюден органогенезге ауысуының негізгі шарты -
қоректік ортадағы гормондық факторлардың қатынасы болып табылады.
Цитокининауксин экзогендік гормондардың жоғары қатынасында өркендер
түзіледі. Ал төменгіде - тамырдың түзілуі қоздырылады, ортаңғыда- каллус
бөлініп көбейеді. Бұл заңдылық алғаш Скуг пен Миллермен анықталынды
[13,4,47,40,41].
Жоғарыдағы гипотезаға қарсы келетін мәліметтер бар болып, люцерна
(Medicago sativa) каллусын алдын-ала ауксиннің жоғары концентрациясында
өсіріп, ортадан фитогормондарды алып тастағанда, өркендердің мамандануын
қоздырады. Керісінше, цитокинині көп ортада каллусты өсіргенде, ортадан
фитогормондарды алып тастағанда, тамыр қалыптаса бастайды.
Каллус клеткаларының морфогенезге қабілеттілігі фитогормондар
балансымен анықталатынын дұрыс деп есептеу керек. Бұл фитогормондар балансы
каллус клеткаларымен түзіледі. Және ол эндогенді фитогормондар деңгейіне,
ұлпалардың өсуін қамтамасыз етуші экзогенді реттеушілер деңгейіне,
өсірілетін клеткалардың рецепцияға қабілеттілігіне және әртүрлі гормондық
факторлардың әсеріне байланысты [36,37,38].
Эндогендік және экзогендік фитогормондардың мөлшерлерінің арасындағы
тығыз байланыстың және нақты механизмі әлі белгісіз каллус клеткаларының
морфогенезге қабілеттілігінің бар екенін айта кету керек.
Микрокөбейтудің бұл әдісінің негізінде өсімдіктен оқшауланып, қоректік
ортаға отырғызылған эксплантат клеткаларының дедифференциялану қабілеті
жатыр. Дедифференциялану дегеніміз - клеткалық маманданудың жойылуы
[14,38,40,45].
Вегетациялық фазаның активті периодтарында, яғни, сәуірдің соңынан
шілденің соңына дейінгі аралықта алынған экспланттың регенерациялануы өте
жоғары болады [20,28].
Каллус клеткаларын жаңа қоректік ортаға отырғызып отырып, ұзақ уақыт
бойы in vitro жағдайында өсіруге болады. Бірақ бұл кезде өсірілетін өсімдік
клеткаларында хромосомалар құрылымының өзгеруі, гендік мутациялардың
жинақталуы, өсірілетін клеткалардың морфогенетикалық потенциалының жоғалуы
сияқты микрокөбейту үшін жағымсыз құбылыстар болады. Осының нәтижесінде
каллус клеткаларынан бой қысқа, жапырақтарының дұрыс емес орналасуы, түрі
ұсқынсыз және өміршеңдігінің төмендеуі сияқты морфологиясы өзгерген
өсімдіктердің пайда болуына әкеледі. Каллустан регенерацияланатын
пеларгония өсімдіктері көлемі, жапырақтарының және гүлінің морфологиясы
бойынша бір-бірінен ажыратылады.
Бірақ, белгісіз себептермен, кейбір каллустық клеткаларды ұзақ
өсіргенде, генетикалық тұрақтылығын және морфогенезге қабілеттілігін
сақтайды [15].
2. Клондық микрокөбейтуге әсер ететін факторлар
Клондық микрокөбейтуге әсер ететін факторлардың маңызы зор. Жалпы
алғанда іn vitro жағдайында регенерацияның жылжамдығы: өсімдіктер
генотиптіне өсімдіктер түрінің формасына; сорттары мен будандарына;
эксплант ретінде алынатын өсімдіктің мүшесіне; отырғызылатын қоректік
ортаға; жарықтың әсеріне, сонымен қатар, темпераның әсеріне де байланысты
болады.
- Клондық микрокөбейтуге генотиптің әсері күшті. Мысалы, қосжарнақтылар
шөптекті өсімдіктер және ағаш өсімдіктерге қарағанда регенерацияға қабілеті
едәуір жоғары. Өсімдіктің әр түріне ең тиімді регенерация әдісі іріктеліп
алынады. Эксплант бөлініп алынатын өсімдіктер аурудан сау болу керек.
- Эксплант алынатын өсімдік неғұрлым жас болса, соғұрлым одан шыққан
өскіннің немесе каллустың регенерацияға қабілеті жоғары болады. Ювенильдік
кезеңдегі өсімдіктерден, яғни өскіндерден алынған каллустың морфогендік
потенциалы ең жоғары болады.
Экспланттың физиологиялық жасы каллуста өтетін морфогенез жолына әсер
етеді. Мысалы, Echeveria elegans жас жапырағының экспланттарынан өскен
каллустарда көбінесе тамырлар пайда болған, қартайған жапырақтарынан
өркендер, ал орта жастағы жапырақтан - тамырлар мен өркендер пайда болған
[5,1].
- Микрокөбейту үшін эксплант алынатын мүшенің де маңызы зор. Ең жақсысы,
егер эксплант ретінде меристемалық ұлпалар мен мүшелері, атап айтқанда:
өркеннің ұшы, қолтық бүршігі, меристема пайдаланса, in vitro жағдайында
олар жақсы өседі және тотипотенттігі жақсы болады.
- Экспланттың морфогендік қабілетіне оның көлемі ықпал етеді. Неғұрлым
эксплант кішкене болса, соғұрлым оның органогенезге қабілеті төмендейді.
Ірі экспланттардың генетикалық тұрақтылығы артады. Бірақ бұл кезде олардың
клеткаларында вирустар сақталып қалуы мүмкін. Сондықтан практикада
экспланттың орташа көлемін іріктеп алады.
Жеміс-жидек өсімдіктерін in vitro жағдайына енгізу эксплант көлеміне
байланысты. Егер эксплант көлемі 03,-0,5 мм болса, оның регенерациялану
қабілеттілігі өте жоғары болады. Ал эксплант көлемі 0,2-0,3 мм аралығында
болса, экспланттың регенерациялану қабілеттілігі өте төмен болады
[2,3,8,9].
- Микрокөбейтуде қоректік ортаның орны ерекше. Қоректік ортаның
құрамына, оған қосылған фитогормондардың деңгейіне байланысты өсімдік
ұлпаларының әрбір сортқа, түрге тән морфогенетикалық өзгерістері болатыны
белгілі.
Әрбір өсімдік түрі үшін оның құрамы тәжірибеге сүйеніп іріктеледі. Ең
жиі қолданылатын Мурасиге-Скуг ортасы каллустың пайда болуына және оның
өсуіне лайықты, яғни микрокөбейтудің бірінші кезеңіне ыңғайлы.
Егер де микрокөбейту қолтық бүршіктерін өсіру арқылы өткізілсе,
каллустың пайда болуы ұнамсыз құбылыс. Сондықтан бұл әдіске каллус түзілуін
тежейтін басқа қоректік орталары қолайлы келеді. Микрокөбейтудің бірінші
кезеңінде қоректік ортаға антиоксиданттар жиі қосылады, олар гидролиз
өткізетін ферменттердің белсенділігін тежейді, демек эксплантты сақтап
қалады. Антиоксидант ретінде цистеин, глутатион, меркаптоэтанол, аскорбин
қышқылы қолданылады. Тіпті, эксплантты отырғызу алдында оларды осы
заттардың ерітіндісімен жуады.
Көптеген өсімдіктер айтарлықтай мөлшерде фенолдық заттарды
синтездейді, олардың тотығуы салдарынан ұлпалар қарайып, өсуі тежеледі. Бұл
заттардан құтылу жолдары, ол каллустарды жиі-жиі жаңа ортаға көшіріп
отырғызу немесе қоректік ортаға оларды өздеріне адсорбциялайтын заттарды
қосу, атап айтқанда, активтелген көмір, поливинилпирролидон, т.с.с.
Эксплантты өсіре бастағанда және көбейтуді өткізгенде қоректік ортаның
құрамы күрделі болады, ал тамырландыру үшін қоректік ортадағы заттардың
саны да, мөлшері де азайтылады.
Қоректік орта минералдық негізі немесе сұйылтылған МС ортасы
ауксиндермен толықтырылады. Кей кезде тамырлануды жиілету үшін ауксинді
ортаға қоспай өркендердің өздерін онымен өңдейді. Бұл тәсіл ағаштар мен
бұталарды микрокөбейткенде жақсы нәтиже береді. Бұл жағдайда каллус аз
түзіліп, тамырлар тезірек шығады.
- Физикалық факторлардың ішінде ең маңыздылары жарық. Морфогенез
процестеріне өте жарық жағдайлардың керегі жоқ. 1000-3000 лк 14-16 сағат
фотопериоды жетіп жатады. Өсімдіктерді топыраққа көшіруге дайындағанда
оларға 10000 лк жарық түсіріп баптайды [3,17,18,19].
- Өсімдіктерге ең жақсы температура шамамен 25оС. Бірақ әрбір түрдің
табиғатта температураға талабын еске алу керек. Мысалы, пиязшықты
өсімдіктер үшін табиғатта ең жақсы температура 18оС болса, монстера үшін -
30оС болады.
Жеміс-жидек өсімдіктерін in vitro жағдайында өсіргенде күн ұзақтығы -
16 сағат, жарықталу - 4000-5000 лк, жарық көзі - ЛДЦ- 40 типтік
люминесценттік лампалар, күндізгі температура - 22-26оС, түнгі - 18-21оС
болады [17].
In vitro жағдайында құнды өсімдіктерді алу үшін су алмасудың маңызы
зор. Өсімдіктерде су алмасу бұзылғанда витрификация деген жағымсыз құбылыс
орын алады. Витрификация кезінде өсімдік клеткалары ісінеді, сабақтары
жуандайды, жапырақтары ұзарып, майысып, суланып, әйнек тәрізді болып
кетеді. Бұл морфологиялық өзгерістерге қоса жапырақтардың құрғақ массасы
төмендейді. белок, хлорофилл, целлюлоза, лигнин мөлшері азаяды, ал
кальцийдің мөлшері артады. Жапырақтың су кеңістігі үлкейіп, бос газ
кеңістігі азаяды. Осының әсерінен өсімдік кейін келе жойылады. Бұл
құбылыстар көбінде сұйық ортада өсіргенде байқалады.
Сонымен, клондық микрокөбейту әдісінің тиімділігі әр түрлі
факторлармен шектеледі, бірақ олардың теріс әсерлерін әдісті жетілдіру
арқылы жоюға болады.
2.1.3 Жеміс-жидек өсімдіктерін клондық микрокөбейту
Қазіргі таңда, асептикалық in vitro жағдайында өсімдік ұлпаларын
өсірудің соңғы биотехнологиялық әдістері бүлдірген, таңқурай, қара қарақат,
шие, алма, өрік сияқты көптеген жеміс-жидек өсімдіктерін зиянкес аурулардан
арылту және көбейту үшін кеңінен қолданылуда. Ғалымдардың жан-жақты
зерттеулері нәтижесінде, бүлдірген сорттары да әртүрлі инфекциядан
сауықтандырылып, бір өсімдіктен бірнеше миллион регенеранттар алынып,
жаппай клондау әдісімен өндіріс технологиясы жасалынуда [8,9,10,18]. Бұл
әдіс біраз дамыған елдерде өндіріске қойылуға технологиялық негіздері
жасалынғанмен оның жаңадан шығарылған өнімділігі мол аса бағалы сорттарын
тез арада ысырапсыз көбейту маңызды мәселеге жатады [19,20,29,30].
Бүлдіргеннің көптеген сорттарының in vitro жағдайында біргелкі
дамымайтындығы белгілі, ол тек генотипке ғана емес, көбейту үшін алынған
экспланттарының ерекшеліктеріне де байланысты. Экспланттар ретінде көбінесе
сабақтың базальды бөліміндегі қауыз апекстері және өркен мұртшалары
қолданылады [8,29,30,20]. Қауыз апекстері көбінесе жерге жанасып
жатқандықтан ұлпасының сыртқы қабаттары былғаныш болады, сондықтан өркен
мұртшаларын қолданған жөн. Көптеген авторлардың зерттеулеріне қарағанда,
алынған экспланттардың мөлшері 0,5-3,0 мм ден аспауы керек, себебі одан
үлкен мөлшердегі экспланттарды қолдану in vitro жағдайында алынған
өсімдіктердің вирустық инфекциялардан құтылуына кепілдік бермейді [2,3,4].
Экспланттар көлемі өсімдіктің әртүрлі бөлімінен алынуына байланысты өзгеше
болатынын ескерту керек. Мысалы, қауыз апекстерінің көлемі өркен-
мұртшаларынан алынғанынан екі есе асып түседі. Бір өсімдіктің апекстерінің
ұзындықтары да 0,5-1,0 мм аралығында болуы мүмкін. Ал вирустарға келетін
болсақ, жалпы пікір бойынша, неғұрлым апекс құралатын меристема ұлпаларының
көлемі аз болған сайын олардың көбеюіне мүмкіндік жоқ. Бұны көңілге ала
отырып, эксплант көлемінің қатаң шектелуін нақты деп әрдайым есептеуге
болмайды. Көптеген зерттеулердің нәтижесінде, эксплант көлемі кіші болған
сайын оның өміршеңдігі нашарлайтыны дәлелденді [3,4]. Сондықтан апекс
меристемасын жан-жағында қоршаған екі жаңа дамыған жапырақшаларымен бөліп
алған жөн, мұндай экспланттың көлемі 0,8-1,0 мм болуы мүмкін. In vitro
жағдайда жеміс-жидек өсімдіктерін меристемамен көбейтіп өсіру, патогенді
микрофлорадан арылған генетикалық біркелкі таза өсімдік көшеттерін алуға
мүмкіндік туғызады.
Қоректік ортаның құрамына, оған қосылған фитогормондардың деңгейіне
байланысты өсімдік ұлпаларының әрбір сортқа, түрге тән морфогенетикалық
өзгерістері болатыны белгілі. Жеміс-жидек өсімдіктерін in vitro жағдайда
меристемамен көбейтуде көбінде Мурасиге-Скугтың макро-және микроэлементтері
бойынша модификацияланған орталарын қолданамыз. Қоректік орта құрамы
Мурасиге-Скуг бойынша минералды тұздар, 0,5 мгл В1, В6, РР витаминдері, С-
1,0 мгл, глюкоза- 30 гл, агар- 5,5 гл болады [2,4,5,6,16,27].
Алғашқы экспланттар ретінде термотерапиядан өткен, өсімдік
өскіндерінен бөлініп алынған 0,25-0,5 мм көлемді меристемалық төбешіктер
қолданылды.
Жеміс-жидек өсімдігін in vitro жағдайға енгізу эксплант көлеміне
байланысты. Егер эксплант көлемі 0,3 -0,5 мм болса, оның регенерациялану
қабілеттілігі өте жоғары болады. Ал эксплант көлемі 0,2-0,3 мм аралығында
болса, экспланттың регенерациялану қабілеттілігі өте төмен болады [2,3].
Эксплантты ортаға енгізуде қоректік ортада тіршілік ете алатын
жағдайын жасау, яғни, цитокинин заттарын қосу және олардың өсуін
қадағалау керек.
Өсіру жағдайлары: күн ұзақтығы- 16 сағат, жарықталу-4000-5000 лк,
жарық көзі- ЛДЦ- 40 типтік люминесценттік лампалар, күндізгі температура-22-
26оС, түнгі- 18-21оС болады [17].
Эксплантты тамырландыру кезеңінің алдында ұзақ өсіру фазасын енгізу
қажет. Ол үшін БАП-0,1 мгл бар ортаға отырғызамыз. Мұндай концентрацияда
экспланттардың қалыпты пролиферациясы жүзеге асады. Жекеленген меристемалық
төбешіктер бірінші ай бойы жапырақты түзеді. Ортаны ауыстырған соң
эксплантаттар 3-6 мм ұзындықтағы өскіндер береді. Өскіндер әр 3-4 апта
сайын өткізген 2-3 пассаждан кейін 1-3 см-лік ұзындықта болады. Ортаның
жаңалану эффектісі өте айқын көрініп тұрады. Бұл уақытта жекеленген
өркендердің жапырақтарының қолтықтарында бүйірлік өркендерден шыққан
бүршіктер пайда бола бастайды. Ал кейбір эксплантаттарда жапырағы қоректік
ортаға тура жанасып қалса, жапырақтың ортасында бүршіктердің пайда болуы
байқалады. Бұл бүршіктерді бөліп алып, жаңа қоректік ортаға ауыстырған соң,
олардан өркендердің түзілуі байқалады. Жапырақ бүршіктерінен шыққан
өркендердің бүйірлік бүршіктің өркендерінен еш айырмашылығы болмайды.
Бүршіктердің тікелей жапырақта пайда болуы БАП-тың меристемалық
белсенділігі бар ұлпаларға (камбийлі) морфогенетикалық әсерінің нәтижесінде
болуы мүмкін. Алғашқы екі-үш пассаждан кейін БАП концентрациясын 3 мгл
дейін көбейту қосымша бүршіктердің жаппай өсуіне әкеледі. Бірақ, бұл кезде
негізгі өркендердің өсу жылдамдығы еш азаймайды. Осылайша, өркен саны
геометриялық прогрессиямен өседі. Бұл кезде тек сорттық ерекшеліктер
көрінеді. Олар- қосымша жарып шыққан бүршіктер саны мен өркендер саны
бойынша сорттық ерекшеліктер.
Меристемалық төбешіктерді бөліп алған соң бірден құрамында 1 мгл ден
көп концентрацияда БАП бар ортаға салу олардың ұсқынсыз дамуына әкеледі.
Мұндай ортада жекеленген меристемалық төбешіктер өскін бермейді, олардың
түбі қаптап өсіп кетеді, экспланттар шар тәрізді болып, дамуға қабілетін
жоғалтады. БАП концентрациясын жоғарылату тек қана нақты құрылымы бар
мүшелерге жақсы әсер етуі мүмкін. Сонда да, өсіру барысында
эксплантаттардың бейімделуін, меристемалық төбешіктер мен өркендердің
ортаға енгізілген препаратқа әртүрлі сезімталдығын да жоққа шығаруға
болмайды [18].
Жекеленген меристемалық төбешіктерден қарақат алудың әдісін өңдеудің
келесі кезеңі - алынған өркендердің эффективті өсу жағдайларын өңдеу.
Меристемалық төбешіктерге арналған 0,05-0,1 мгл концентрацияда индолилмай
қышқылын (ИМҚ) қолданудың тиімділігі аз болды. Қарақат өркендерінің
тамырлануы үшін темір хелаты көп, ИМҚ - 2,5 мгл болатын Мурасиге-Скуг
негізіндегі ортаның 2 есе сұйылтылған түрі тура келеді . Мұндай орта
бірнеше рет қайталанса, өркендердің тамырлануын 70-100%-ға көтереді екен.
Қарақаттың тамырланған пробиркалық өсімдігі ары қарай дамуы үшін
залалсызданған субстратқа (31 қатынастағы торф пен құм қоспасы)
отырғызылады. Ол жерде олар вирустық инфекцияның бар-жоқтығын тексеру
мүмкін болатын көлемге дейін өсіріледі [19].
БАП бар ортада дамыған өркендер меристемалық төбешіктерге қарағанда
жұмыста ыңғайлылау құрылымдар болып табылады. Оларды қолданып өсімдік алу
оңайырақ. Бұл туралы 20 мгл концентрациядағы ИМҚ ерітіндісімен өңдеген
соң, қоректік ортадан алынған өркендерді тікелей топырақ субстраттарында
тамырландыру дәлел бола алады [20,5].
Қарақат эксплантының пролиферациясын БАП күшейтеді. БАП-тың 0,5-1мгл
концентрацияда меристемалық төбешіктердің дамуын күшейтеді. БАП-тың
концентрациясын 1,5 мгл көбейткенде қосымша бүршіктер пайда болып,
төбешігі өседі.
2. МАТЕРИАЛДАР МЕН ӘДІСТЕР
2.1 Зерттеу обьектілері
Зерттеуге ҚР АШМ көшеттер бағының коллекциясынан бүлдіргеннің
шаруашылыққа маңызы зор, аса таңдамалы сорттары Адди, Редгонтлит, Чезена,
Сладкий Чарли алынды.
Экспланттар ретінде көбінесе сабақтың базальды бөліміндегі вегетациялық
сабақтың көлемі 1-1,3 см қауыз апекстері және өркен мұртшалары қолданылды
2.2 Зерттеу әдістері
2.2.1. Материалдарды залалсыздандыру
In vitro жағдайына енгізу кезеңінде, әрбір жаңадан отырғызар алдында
экспланттардың неғүрлым көбірек өміршеңдігі сақталуы үшін олар
серпілтететін заттармен: лимон, қытай пияз шырынымен және өсімдік
қалемшелерінің өміршеңдігін жоғарылататын арнайы эпин препаратымен
(0,01%) 5-10минут ұстап шайып алынды.
Өсімдіктерді клондық микрокөбейтуде эксплантты in vitro жағдайға енгізу
маңызды болып табылады. Өйткені, олардың ұзақ уақыт вегетативті көбеюі
өсімдіктердің жаппай патогенді микрофлора және вирустық аурулармен
залалдануына әкеледі. Осыған байланысты, алғашқы экспланттарды саңырауқұлақ
және бактериялық инфекциялардан тазалау үшін әртүрлі залалсыздандырушы
агенттерді қолданудың тиімділігі зерттелді.
Таңқурай ұлпаларын залалсыздандыру үшін әртүрлі химиялық заттар
қолданады. Көбінесе құрамында белсенді хлоры бар заттар (натрий
гипохлориті, хлорлы әк, кальций гипохлориті, хлорамин), екіхлорлы сынапты
(сулема), сутектің асқын тотығы, этил спирті қолданылды.
Сонымен бірге, өсімдік материалын залалсыздандыру үшін басқа
залалсыздандырушы агенттер: эпин препараты, құрамында хлоры бар Domestos,
дихлоризоциан қышқылының натрий тұзы бар Деохлор препараты, калий
перманганаты, сутектің асқын тотығы және сулеманың ерітінділері қолданылды.
Эпин экстра – эпибрассинолидтің 0,025 гл-і. Эпин препараты Россияның
Москва қаласында дайындалған жеміс-жидек және т. б. көкөніс өнімдерін
жоғарылату үшін олардың қалемшелерін отырғызар алдында арнайы өңдейтін
заттар тобына жатады. Бұл препараттың өскіндердің суыққа төзімділігін
арттыратын, әртүрлі стресс жағдайынан қорғайтын және өсімдік ұлпаларының
зақымдалған клеткаларын қалпына келтіріп, қолтықша бүршіктерінің белсенді
дамуына септігін тигізетін қасиеті бар. Сонымен бірге, өсімдік ұлпаларының
әсіресе, алғашқы даму сатысында зақым келтіретін көптеген саңырауқұлақ
ауруларынан қорғайды. Өсімдік ұлпаларындағы жағымсыз нитраттарды, ауыр
металдарды, радионуклидтерді бейтараптандыратын да қабілеті бар екені
нұсқауында көрсетілген. Бұл препарат тұқымдардың тез өсуін, өсімдіктің тез
дамуы мен көбеюін қамтамасыз етеді; тұқым мен тамырдың өсіп дамуын
белсендетеді; өсімдіктерді аяздан және басқа стресс жағдайларынан қорғайды;
фитофтороз, пероноспороза, паргие, бактериоз, фузариозға төзімділікті
қамтамасыз етеді; бүйір өскіндерінің түзілуін қарқындату арқылы әлсіз
өсімдіктерді күшейтіп, ескі өсімдіктерді жасартады; Таңқурайды отырғызу
алдында оны 100 мл суға 4 тамшы препарат қосып өңдейді. Экспланттарды
ерітіндіде 20oC-та 8-10 сағат шаяды.
Domestos – белгілі үй шаруашылығында пайдаланылатын препарат. Құрамында
хлоры болғандықтан, тат басқан жиһазды тазалайды.
Екіхлорлы сынап (сулема) HgCl2 әртүрлі өсімдік обьектілерін
залалсыздандыратын жақсы зат. Қосынды улы болғандықтан, оның концентрациясы
мен өңдеу уақытын дұрыс таңдау керек. Әдетте сулеманың дистильденген судағы
0,1%-дық ерітіндісін қолданады. Сулеманың залалсыздандырушы әсері
ерітіндіге бірнеше тамшы беттік активті зат қосқанда артады. Сулеманың 0,1%-
дық ерітіндісінде орташа залалсыздандыру уақыты тамыртүйнектер үшін 15-20
мин; тұқым үшін 10-20 мин; шөптекті өсімдіктердің жапырақтары, бұтақтары
үшін 4-8 мин. Ұлпаны сынапты препарат ерітіндісінде өңдеген соң, 4-5 рет 10-
15 минуттан дистильденген сумен жуу керек.
Деохлор - өсімдіктерді микробтардан тазартатын препарат. Оны алдымен
суға ерітіп, қажет өсімдігімізді сол ерітіндіге бірнеше минутқа ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Ұқсас жұмыстар
Пәндер
- Іс жүргізу
- Автоматтандыру, Техника
- Алғашқы әскери дайындық
- Астрономия
- Ауыл шаруашылығы
- Банк ісі
- Бизнесті бағалау
- Биология
- Бухгалтерлік іс
- Валеология
- Ветеринария
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Дін
- Ет, сүт, шарап өнімдері
- Жалпы тарих
- Жер кадастрі, Жылжымайтын мүлік
- Журналистика
- Информатика
- Кеден ісі
- Маркетинг
- Математика, Геометрия
- Медицина
- Мемлекеттік басқару
- Менеджмент
- Мұнай, Газ
- Мұрағат ісі
- Мәдениеттану
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности)
- Педагогика
- Полиграфия
- Психология
- Салық
- Саясаттану
- Сақтандыру
- Сертификаттау, стандарттау
- Социология, Демография
- Спорт
- Статистика
- Тілтану, Филология
- Тарихи тұлғалар
- Тау-кен ісі
- Транспорт
- Туризм
- Физика
- Философия
- Халықаралық қатынастар
- Химия
- Экология, Қоршаған ортаны қорғау
- Экономика
- Экономикалық география
- Электротехника
- Қазақстан тарихы
- Қаржы
- Құрылыс
- Құқық, Криминалистика
- Әдебиет
- Өнер, музыка
- Өнеркәсіп, Өндіріс
Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.
Ақпарат
Қосымша
Email: info@stud.kz