Жиі пайдаланылатын әдістер

Жұмыс түрі: Курстық жұмыс
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 38 бет
Таңдаулыға:

әл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті

Биология факультеті

Биотехнология, биохимия, өсімдіктер физиологиясы кафедрасы

БІТІРУ ЖҰМЫСЫ

КӨК - ЖАСЫЛ БАЛДЫРЛАР ДАҚЫЛДАРЫН ҰЗАҚ МЕРЗІМГЕ САҚТАУ

Орындаған: Ә. М. Қалбаева

(қолы, күні)

Ғылыми жетекшілер:

б. ғ. к., доцент С. А. Джокебаева

(қолы, күні)

Нормобақылаушы: С. Б. Оразова

(қолы, күні)

Кафедра меңгерушісі

б. ғ. д., профессор Т. А. Карпенюк

(қолы, күні)

Алматы, 2010

МАЗМҰНЫ

Бет

: КРІСПЕ.

Бет: 3

: 1

Бет: ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ . . .

: 1. 1

Бет: Криосақтау жөнінде жалпы түсінік . . .

: 1. 2

Бет: Криопротекторлардың түрлері . . .

: 1. 3

Бет: Әртүрлі организмдерді мұздатып сақтау . . .

: 1. 4

Бет: Жиі пайдаланылатын әдістер . . .

: 1. 5

Бет: Криосақтау әдісі - витрификация кезіндегі криозақым . . .

: 1. 6

Бет: Көк -жасыл балдырларға сипаттама . . .

: 2

Бет: МАТЕРИАЛ ЖӘНЕ ЗЕРТТЕУ ӘДІСТЕРІ . . .

: 3

Бет: ЗЕРТТЕУ НӘТИЖЕЛЕРІ ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛДАУ . . .

: ҚОРЫТЫНДЫ . . .

Бет: 37

: ҚОЛДАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ . . .

Бет: 38

КІРІСПЕ

Микробалдырлар және цианобактериялар бағалы қоспалардың продуценттері болумен қатар, биотехнологиялық өндірістер үшін ыңғайлы обьект болып табылады. Оларды биологиялық белсенді қоспаларды, экономикалық тұрғыдан маңызды қосылыстарды және биожанармай жасауда қолданады. Сонымен қатар антропогендік фактор нәтижесінде ластанған қоршаған ортаның мониторингін жүргізу үшін, ағынды суларды биотазалауда да қолданысқа ие. Осыған байланысты биотехнологияда балдырларды қолдану бүкіл әлемде етек ала бастады. Алайда өндірістік биотехнологияда фотоавтотрофты синтезді қолдану үшін коллекционды штаммдардың бүтіндігіне кепіл болу керек.

Энергетикалық, азық-түлік мәселесі өткір проблемалардың бірі. Бұл проблемалардың шешімі - адамзаттың тұтынатын өнімдерінен басқа шикізат табу. Осындай шикізаттың бірі - микробалдырлар. Олар өздерінің таптырмайтын қасиеттерімен, атап айтсақ, көптігімен, пайдалы құрамымен және де тез көбейетіндігімен ерекшеленеді. Дәл осы қасиеттерін пайдалданып, оларды азықтық белок ретінде, энергия алудың альтернативті жолы ретінде, биологиялық активті қосылыстардың таптырмайтын, құнды көзі ретінде қолдану қажет. Онымен қоса, микробалдырлар адам тағамының бәсекелесі емес.

Микробалдылдарды сақтаудың біраз қиыншылықтары: микробалдырларды субкультуралауды, т контаминациядан сақтауды, микробалдырлардың көбеюі тез болғандықтан, бүкіл коллекцияны түрде бір уақытта себуді, культуралардың қайта отырғызылуын, олардың физиологиялық жағдайын үнемі тексеріп тұруды қажет етеді.

Бірқатар авторлардың ұсынған микробалдырлардың өміршеңдігіен сақтау әдістері: лиофилизация, сусыздандыру, альгинатта инкапсулданған күйде сақтау және -20ºС градуста қатқан күйінде вазелин майының астында сақтау және т. б. - әдістері өздерінің белгілі бір балдырларға қолайлығын көрсетті. Осылайша, өңдеу әдістерін вариациялау арқылы микробалдырларды криосақтаудың барынша оптимальді режимдерін табуға болады.

Алайда мемлекеттік масштабта микробалдырлардың коллекциясы жинақтау маңызды болғандықтан, микробалдырлардың коллекциясын сақтау әдістерін табу керек. Бұл жұмыстың өзектілігі де сонда.

Көптеген мемлекеттер микробалдырлардың ең тиімді сақтау әдісі -криосақтау деп таныды. Криосақтау жолымен микробалдырлардың коллекциясын сақтау көптеген мақсаттарға қол жеткізуге себепкер болып отыр. Осыған байланысты биотехнологиялық обьект ретінде микробалдырлардың сақталуы маңызды саты болып табылады.

Бұл жұмыстың мақсаты әртүрлі криоқорғағыштар мен осмотиктердің комбинациясының көк-жасыл балдырларға әсерін анықтау және белгілі бір балдырға өзіне тән криопротектор мен осмотиктің үйлесімін табу болып табылады. Осы арқылы балдырларды криосақтауға арналған протокол құру.

Осының арқасында мемлекеттік масштабта криобанк негізін салу керек. Мұндай генетикалық криобанктарды жасау - болашақта Жер шарының алуантүрлілігін сақтауға немесе жаңартуға, демек Табиғат тепе-теңдігін сақтауға мүмкіндік береді.

Криобанк міндеті - әртүрлі, әсіресе жоғалып бара жатырған және сирек кездесетін өсімдік және жануарлардың генетикалық ақпаратын сақтап тұрған биологиялық материалдарды жинау, және ұзақ уақытқа сақтау.

Криосақтау - биологиялық обьектілерді тірі күйінде терең қатыру әдістерін табудың жолын қарастыратын криобиологияның саласы. Бұл тірі организмдердегі зат және энергия алмасуы тоқтауы арқылы организмнің көп уақыт сақталуымен түсіндіріледі.

ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ

1. 1 Криосақтау жөнінде жалпы түсінік

Клеткалық суспензияның төмен температурада қатуын мынадай сатылармен сипаттауға болады:

клетканы әдетте қоршап тұратын ортаны криопротектордың (әдетте гипертоникалық) ығыстырып шығаруы, және белгілі бір уақыт бойы (бір секундтан бірнеше сағатқа дейін), тұрақты температурада клеткалардың ондағы экспозициясы;
белгілі бір клетка мөлшерін криоқорғағыш ерітіндіде терең мұздату (әдетте - 80 -196ºС-ге дейін) .
Биологиялық обьектіні ұзақ уақыт бойы тұрақты температурада сақтау (тоңазытқышта, сұйық азот буында немесе сұйық азоттың өзінде)
Обьектті белгілі режиммен 0ºС- ден жоғары температураға дейін жылыту.
Криопротекторлық сұйықтықты физиологиялық индифферентті ортамен ығыстыру.

Қазіргі кезде биологиялық суспензияларды төменгі температурада сақтау туралы ақпараттарға сүйенсек, биообьекттерді төмен температурада сақтау клеткалар мен мембраналарды қатырып, еріткеннен кейін айтарлықтай зиян тегізбейтінін түсінеміз. Сондықтан егер биообьекттерді тез арада төмен температурада (мысалы, -196º С-та) қатыруды және дәл солай қажетті температураға дейін жылытуды үйренсек, биологиялық обьекттерді тірі күйінде сақтау мәселесін шешілдіге санауға болар еді.

Қазіргі кезде биологиялық обьектілерді төмен температурада мұздатуда қоладынылатын әдіс - тәсілдерді қолдану кезінде, оларда үлкен өзгерістер болып жатады, соның ішінде бүкіл клеткаішілік құрылымның айқын қайта құрылу құбылысы, оның агрегаттық күйінің, құрамының және т. б. физика-химиялық қасиеттерінің өзгерісі өтеді. Мұздату процесі кезіндегі зақымданулардың басым бөлігі тура және жанама түрде клетка ішінде мұздың пайда болуымен байланысты.

1. 2 Криопротекторлардың түрлері

Биологиялық обьектілердегі мұздату, жылыту кезінде зақымданудың алдын алатын заттарды криопротектор деп атаймыз. Эффективті криопротекторларға әртүрлі классқа жататын химиялық қосылыстар жатады. Бұл - спирттер (этиленгликоль, α-пропиленгликоль, глицерин), амидтер (диметилацетамид), оксидтер (диметилсульфоксид), жасанды полимерлер (поливинилпирролидон, оксиэтилденген крахмал, полиэтиленгликоль) . Алайда жоғарыда аталған химиялық қосылыстар тізім толық емес екенін ескеру керек.

Криопротекторлар криоқорғаушы орталардың компоненті, одан басқа ортаға органикалық және бейорганикалық қосылыстар да кіруі мүмкін. Осы орталарды клетка суспензиясына енгізген кезде (оларда ұлпалық препараттарды ұстау немесе органдарды олармен перфузиялау) клеткаішілік және клеткасырты орталардың құрамы өзгеріп, мұздатқан кезде клетка және клеткадағы құрылымдардың зақымдануының ықтималдығы төмендейтіндей дәрежеге жетеді.

Криопротектордың қасиеті қандай болуы тиіс деген сұраққа әлі де толық жауап беру мүмкін болмай отыр, дегенмен кейбір криопротектор қасиеттері белгілі. Криопротектордың улылығы болмауы тиіс, суда жақсы еруі керек, әртүрлі температурада клетка ішіндегі қататын судың мөлшерін азайтуы және криопротектор мен судан тұратын ерітіндідегі судың қатуын болдырмайтын және клетка аморфты күйге жеткенше белоктар мен тұздарды еріген күйде сақтай алуы тиіс. Криопротектордың пайдалы, міндетті емес қасиеттерінің бірі - клеткалық мембрана арқылы оңай өтуі.

Криосақтағыш ортадағы су фракциясының криопротектор арқылы қатуы кең температуралық аймақта жүреді, және қатпаған су мөлшері 20-30%-ға жеткенде аяқталады. Криопротектордың (қатыруға дейінгі) концентрациясының көбеюі клеткаішілік және клетка сыртындағы тұздардың концентрациясының төмендеуіне әкеледі. Криопротекторлар әсерінен тұздар не зиянды әсер болатындай концентрацияланбайды немесе зақымдану баяу жүретін температурада зиянды концентрацияға жетеді.

Криосақтаушы ортаның құрамындағы суды қатыру кезінде криопротектордың гипертоникалық (бірақ зақымдаушы концентрациясына жетпеген) концентрациясы клеткалардың сусыздануын шақырады, ал ол өз кезегінде клеткаішілік коллоидтардың концетрациясын жоғарлатады. Соңғылары жоғары концентрацияда криосақтаушы қасиетке ие болады: клеткаішілік ортаның шектен қатып кетуінен қорғайды, және оның шыны тәрізді күйге енуіне көмектеседі, ал бұл құбылыс клетканы жарып кете алатын мұз кристаллдарының пайда болуын тежейді.

Криопротектордың клетка ішіне жедел кіруі оны гипертоникалық криосақтаушы ортада зақымданудан сақтайды және клетканы сусыздандыру кезінде клетканы қатыру мембрананы клеткаішілік және сыртылық зақымдаушы ерітінділердің концентрация градиентінен зақымдануынан сақтайды. Клеткаға енетін криопротекторларды клеткаға енбейтін криопротекторларға қарағанда клетканың суын қатырған кезде клетканы жақсырақ сақтайтындығына қарамастан, оларды қолдану клетканы изотоникалық ортаға қайтаруға байланысты проблемаларға тап боламыз. Айта кету керек, криопротектордың клетка мембранасына жақсы енетіндігі, органеллалар мембранасына жақсы енетіндігіне кепіл болмайды, өйткені клеткада криопротектор концентрациясын жоғарлатқан кезде олар зақымдануы мүмкін.

Кейбір кең танымал криопротекторларға сипаттама беріп өтейік, оларға мынадай заттар жатады: глицерин, ДМСО (диметилсульфоксид), диметилацетамид, этиленгликоль, поливинилпирролидон (ПВП), α- Пропиленгликоль.

Глицерин - молекулалық массасы 92, 10 болатын көп атомды спирт. Құрамында ОН тобы болғандықтан, ол сумен кез келген қатынаста байланыса алады. Оған қоса, глицериннің тұздарды, сілтілерді, мочевинаны, сахарозаны және газдарды еріту қасиеті бар. Глицериннің 50% - дық ерітіндісінің тұтқырлығы бөлме температурасында судың тұтқырлығынан 5, 41 есе көп. Глицерин ерітінділерінің осмотикалық қысымдары шамамен мынадай : 1%- 4, 56 · 10 ⁵ Па; 5%-12, 6·10 ⁵ Па; 10% -28, 56·10 ⁵ Па; 15% - 47, 4·10 ⁵ Па; Глицериннің суда еруі жылу бөлінумен және көлемінің кішіреюімен қатар өтеді.

Глицерин биологиялық (жануарлардан алынған) обьекттер үшін бөтен зат емес, ол тағам құрамында майлармен бірге жүреді, бауырдың зат алмасуының нәтижесінде түзіледі, май қышқылдарының және глицерин эфирі клетка мембранасының құрамына кіреді. Медициналық практикада глицерин осмотикалық әсер препараты ретінде қолдланылады. Қазіргі кезде глицеринді ауылшаруашылық жануарлардың спермасын, қан клеткаларын, адамның және жануарлардың кейбір ұлпасын ( тері, көздің қарашығы) төменгі температурада сақтау үшін кеңінен қолданылады.

Глицериннің биологиялық обьекттермен әсерлесуінің нәтижесінде, оның жағымсыз әсерлері де табылған. Ұлпа культурасындағы сүйек кемігінің клеткаларының өсуін тежеген, кейбір микроорганизмдердің өсуін мүлдем тоқтатқан, ал бұқа спермиінің ісінуіне әкеліп соққан. 15%-дық глицерині бар ортада сүйек кемігінің клеткаларын инкубациялаған кезде, +4ºС-та гранулоциттерде ультрақұрылымдық өзгерістер байқалғанмен, эритроидты және лоимфоидты клеткаларда еш өзгерістер анықталмаған.

Диметилсульфоксид - оксидтер классына жатады. Молекулалық массасы 78. Құрамында оттегі болғандықтан HClO ₄ , фосфат және күкірттің тұздары мен оксидтермен реакцияға оңай түседі, сондай-ақ глицеринмен, сахарозамен, морчевинамен, стеарин қышқылымен және т. б. байланыстар құра алады. Перманганат және сутегі асқын тотығы әсерінен тотығады. Сумен судың екі молекуласының арасындағы байланыстан гөрі қаттырақ байланыстар түзеді.

Диметилсульфоксид ортопедия мен травматологияда қолданылады. Тәжиребелер көрсеткендей диметилсульфоксид глицеринге қарағанда биологиялық обьектіге жақсы сіңеді. ДМСО-ның осы қасиеті, оның көптеген клеткалар мен ұлпаларды криосақтауда қолданылуына негіз болып отыр. ДМСО ұлпа культураларын, балық спермасын, кейбір микроорганизмдерді төменгі температурада криосақтауда кеңінен қолданылады.

Кей кезде криопротектор ретінде диметилацетамид, этиленгликоль, пропиленгликоль қолданылады [1] .

Диметилацетамид - лейкоцит және тромбоциттерді қатыруда қолданылады, кейбір әдебиеттерге сүйенсек диметилацетамидтің глицеринге қарағанда гранулоциттерді зақымдамайтындығын көреміз. Этиленгликоль клеткаға жылдам сіңеді, ал жоғары концентрацияда 0ºС-та оларды зақымдамайды. Бірақ диметилацетамидті қолдануды оның улылығы шектейді.

αПропиленгликоль - фармокопейлік мақсатта гидрофобты мазь немесе дәрілерді ерітуші зат ретінде қолданады. Төмен температурада мұздатып сақтау практикасында адам эритроциттерін, адам бүйрегінің клеткаларның культурасын, құс және бұқа спермаларын сақтауда қолданады. Адам эритроцитіне глицеринге қарағанда жақсырақ сіңеді.

Поливинилпирролидон (ПВП) - жасанды полимерлер классына жатады. Медицинада плазмаалмастырғыш препарат ретінде молекулалық массасы 12 000-14 000 болатын молекулалар қоладанылады. Бұдан молекулалық массасы үлкенірек молекулалар әртүрлі (мысалы, альдегидтермен) қоспалармен ластанған болып келеді. Мұндай қоспалар клеткада тотығу реакцияларын шақырып, каталазалардың активтенуіне әкеп соғуы мүмкін. Одан басқа ПВП - ның ірі молекулалары организмен нашар шығарылады, өз кезегінде төменгі молекулалы ПВП молекулалары клеткадан нашар утилизденеді. ПВП құрамында гидрофобты және гидрофильді аймақтары бар сулы ерітінділерде спиральді конфигурацияға енеді.

ПВП -ның тұну жылдамдығын жоғарлатудан басқа, клетка мембранасына әсер ете отырып, адам эритроцитін агглютинацияға әкеледі. Концентрациясы 7-20% болатын (көбінесе 10-15%) ПВП көмегімен әртүрлі клеткаларды: адам эритроцитін, қояндардың, адамның, тышқанның миелокариоциті, адам лимфоциті мен лейкоцитін, қытай атжалманының фибробласт клеткаларының культурасын, әртүрлі микроорганизмдерді, сегіз бластомер және ерте бластоциста кезеңіндегі тышқан эмбрионын сақтауда қанағаттанарлық нәтижелер алынды.

Декстран және оксиэтилкрахмал. ПВП сияқты полидисперсті полимерлер қатарына жатады. Криоконсервацияда қолданылғанға дейін плазмаалмастырғыш ретінде белгілі болған. Медициналық практикада орташа молекулалық массасы 40 000 - 80 000 болатын декстран мен молекулалық массасы 60 000-тан аспайтын оксиэтилкрахмалдың молекуласын қолданады.

Криобиологияда, оған қоса, криопртектор ретінде полиэтиленоксидтерді қолданады. Ол өндірістің түрлі салаларында кең қолданысқа ие. Молекулалық массасы 300-6000 болатын ПЭО фаркопеяда синтетикалық дәрілерді қосқыш ретінде қолданылады. ПЭО препараттары жоғары дисперстілігімен ерекшеленеді. Төменгі температурада мұздатуда сүйек кемігі мен қанның ядросы бар клеткаларын, тері клеткаларын, көздің мөлдір қабығы клеткаларын және т. б. клеткаларын (М. М. 400) ПЭО қоданылады. Адам эритроциттерін мұздатып сақтау тәжірибесін (М. М. 1500) ПЭО сәтті өтті. 1500, 4000, 6000 - ға тең молекулалық массасы бар ПЭО сомалық клеткаларды гибридизациялау үшін қоданылады. (М. М. 2000-4000) ПЭО белоктардың денатурацияға ұшырамай, тұнбаға ұшырататыны мәлім. Сондай-ақ ПЭО ДНК-ның компактизациясын шақыра алады. ПЭО-ның клеткаға енуі туралы мағлұмат аз[1] .

1. 3 Әртүрлі организмдерді мұздатып сақтау

Өсімдік клеткалары . генетикалық сипаттамасы қай мерзімде болса да тұрақты сақталуына кепіл болады. Бұл әдіспен әртүрлі материалды сақтауға болады - протопласттардан ұрық пен тұқымға дейін. Қазіргі уақытта клеткалар мен ұлпаларды, мүшелерді қатты мұздатып сақтау медицина мен мал шаруашылығында кеңінен пайдаланылады. Ал өсімдіктермен жағдай басқаша. Басты қиындығы - ол өсімдік клеткаларына тән ерекшеліктері және мұздың оларға әсері[2, 20] . Өсімдік клеткалары көлемі үлкен, вакуолі зор, суы көп болғандықтан мұздату және еріту кезеңдерінде олар қатты зақымданады. Ол мұздың клетка ішінде де, сыртында да қатуына байланысты. Әдетте, мұз алдымен клетканы қоршаған сыртқы ерітіндіде пайда болады. Цитоплазманың қату температурасы 1ºС, бірақ клеткалар -10 ºС -15 ºС дейін қатпай тұрады, себебі плазмалемма оған дейін мұздың кристаллдарының клетка ішіне кіруін бөгейді. Мұз кристаллдары клеткаішінде өсе бастаса, мембраналарды қиратады. Температура баяу төмендесе, клетканың бос суы жарым-жартылай сыртқа шығып үлгереді де, ерітіндіде мұзға айналады. Ал мұздату өте жедел өтсе, клетканың дегидратациясы жүріп үлгермейді де, мұз цитоплазма ішінде түзіле бастайды. Бәсең мұздатқанда, клетка ішінде мұз кристаллдары пайда болуы мүмкін, бірақ мұнда клетканың едәуір сорығуы мен протоплазманың сығылысуы болмай қалмайды. Протоплазманың сорығуы, мұз түзілу салдарынан сыртқы ерітіндінің концентрациясы өсуі себебінен болады.

Шектен тыс плазмолиз және соның нәтижесінде пайда болатын осмостық стресс (әсіресе кейін өтетін деплазмолизде) клетканы зақымдайды.

Өсімдік клеткалары үшін оптимальді криопротектор ДМСО болып табылады. Клеткаларды мұздатуға дайындағанда ДМСО қосып өсіреді [2] .

Жануарлар клеткалары. Қазіргі кезде жануарлар клеткаларын криоконсервациялау етек алды. Соның ішінде эритроциттер, эмбриондар, сперма, гепатоциттер және т. б. Адам денесінің клеткаларын криосақтау тәжірибелері де қарастырылып жатыр[20] . Мысалы адам эритроциттеріне көптеген криопротекторлар қолданылған және протекторлардың көбісі сәтті өткен. Ал глицерин адам эритроциттері үшін глицерин ең қолайлы протектор болып қала береді. Адам эритроциттері үшін біріншіден, эритроциттерге терең ене алатын төменгі молекулалы протектор және эритроциттерге енбей - ақ, оларды сақтай алатын жоғарғы молекулалы протекторлар ізделініп жатыр[17] . Мұнда бір қиындық бар: эритроциттерге протектор енген кезде, клетка мембранасы жарылып кетуі мүмкін, сондықтан шаю үшін қолданылатын ерітінділердің осмостық қысым клеткалардың ісінуін болдырмауы керек.

Тышқан эмбрионымен жасалған тәжірибелердің нәтижесінде, ғалымдар тышқан эмбрионын морула түрінде криосақтаған дұрыс деп шешті. Криопротектор ретіне диметилсульфоксид қолданылады.

Бұқа спермасына байланысты тәжірибелердің негізі қаланып, қолданысқа ие болды. Криоконсервация арқылы ірі қара малының асыл тұқымдарын алу өте қолайлы, және мал шаруашылығында кеңінен қолданылу үстінде.

Микроорганизмдер. Криоконсервация микроорганизмдердің генетикалық қасиеттерін еш жоғалтпауды қамтамасыз етеді. Микроорганизмдердің әр түрлі штаммдары мен түрлері криосақтауға әртүрлі төзімділікті көрсетеді[13] . Споратүзуші бактериялар азотқа толтырылған контейнерге бірден салуға болса, спора түзбейтін бактериялар өздеріне сай қатыру - еріту әдістерін іздеуді талап етеді. Клеткалардың криосақтаудан кейінгі бүтіндігіне әртүрлі факторлар әсер етеді: клетка жасы, өсіру жағдайы, суспензиядағы клеткалар тығыздығы және т. б[10] .

1. 4 Жиі пайдаланатын әдістер

Басқарылмайтын екі сатылы мұздату. Құрамында евгленасы бар шыны ыдыстар (10% метанол) криопротектантпен 10 минут бойы өңделіп, - 60 ºС - қа алдын ала қойылған (Planer, UK) басқарылатын мұздатқышқа салынады. Одан соң үлгі 15 минуттан -1сағатқа дейін осы мұздатқышта тұрады. Одан соң сұйық азотқа -196 ºС -қа салынады. Әрі қарай ССАР криосақтауышта сақталады.

Басқарылатын екі сатылы мұздату. Басқарылатын мұздатқышқа салудың алдында алдын ала (10% метанол) криопротектантпен евглена клеткасын 10 минут өңдейді. Одан соң басқарылатын мұздатқыш температурасын -10ºС мин ^-1 , -5 ºС мин ^-1 , -1 ºС мин ^-1 , 0. 5 ºС мин ^-1 , 0. 3 ºС мин ^-1 жылдамдықпен - 60 ºС-қа дейін түсіріп, сұйық азотқа салудың алдында 15 минут ұмұздатқышта ұсталады. Одан соң -196 ºС-та ССАР криосақтағышта сақтаймыз.

Витрификация протоколы. Клеткалар сахароза негізінде жасалған PVS2 (Yamada et al., 1991 ) және EG:JM негізінде жасалған PVS3 (Nishizawa et al., 1993) витрификациялық ерітінділер арқылы витрификацияланды. Қолданылмастан бұрын витрификациялық ерітінділер 0ºС- қа дейін мұздатылып, алдын ала ресуспензияланған клеткалар суспензиясына енгізілді. Клеткаларға витрификациялық ерітінділермен 0ºС- та 5 минут ұсталды, одан соң сұйық азотқа салынды[3] .

Инкапсуляция және дегидратация протоколы. Культуралар центрифугаланып, инкапсулдеуден бұрын супернатант алынып тасталды. Концентрленген клеткалар 20мл альгинатқа салынады және қапталған клеткалар қолданылатын әдіске байланысты 100мМ CaCl ₂ -ке салынады ( Hirata et. al., 1995) . Инкапсуляцияланған клеткалар CaCl ₂ ерітіндісіне 15 минутқа салады да, залалсыздандырылған сүзгімен фильтрлеп алады. Инкапсуляцияланған дәндерді «жеңіл» кептіріп, фильтр қағазына қоямыз, одан соң EG:JM ортасына ауыстырамыз. Инкапсуляцияланған клеткаларды 24 сағат 0, 5 М сахарозамен және 24 сағат 0, 75М сахарозамен толықтырылған EG:JM ортасында өсіреді. Инкапсуляцияланған клеткалары бар альгинат дәндерді алдын ала өсірген ортадан фильтр қағазы арқылы сүзіп алады, одан соң фильтр қағазымен «жеңіл» кептіреді де, ламинар боксқа ауыстырады да Петри табақшасына егеді. Инкапсулденген клеткалар ламинардың ауа ағынымен 1-4 сағат бойы кептіріледі. Дегидратталған дәндерді сұйық азотқа салады[3] .

1. 5 Криосақтау әдісі - витрификация кезіндегі криозақым және басқа да процестер

Балдырларды төмен температурада мұздатып сақтау (сұйық азотта -196 °С -та) біртіндеп қолданысқа ие болып келе жатыр. Сұйық азотта сақтау культураларды қайта отырғызуды қажет етпейтіндіктен, біраз артықшылыққа ие. Оған қоса, осы әдіс балдырлардың генетикалық ақпараттың толық сақталуына, шығынның аз болуына және де залалсыз болуына кепілдік бере алады. Қазіргі кезде, қолданылып жүрген криосақтау протоколдары тек балдырлардың және цианобактериялардың шектеулі түрлерін ғана сақтай алатындығымен осал. Криогенді өңдеуге балдырлардың төзе алатын әдіс табылғанша, әдіс - тәсілдерді жақсарту қазіргі міндетіміз. Осындай әдістердің бірі - витрификация әдісі. Бұл әдіс клеткадағы су күйін басқарып, криогенді температура әсеріне түскен клеткадағы мұздың пайда болуын тежеуге қол жеткізеді. Нәтижесінде судың тұтқыр, аморфты, яғни кристаллды емес, шыны тәрізді күйге ұшырайды. Оған қоса, витрификация әдісі әдетте қолданылып жүрген басқарылмалы - мұздату әдісіне қосымша ретінде де қолданылады.

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.