Жиі пайдаланылатын әдістер

Жұмыс түрі: Курстық жұмыс
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 38 бет
Таңдаулыға:

әл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті

Биология факультеті

Биотехнология, биохимия, өсімдіктер физиологиясы кафедрасы

БІТІРУ ЖҰМЫСЫ

КӨК - ЖАСЫЛ БАЛДЫРЛАР ДАҚЫЛДАРЫН ҰЗАҚ МЕРЗІМГЕ САҚТАУ

Орындаған: _______________________ Ә.М.
Қалбаева
(қолы, күні)
Ғылыми жетекшілер:
б.ғ.к., доцент ________________________ С.А.
Джокебаева
(қолы, күні)

Нормобақылаушы: ________________________ С.Б. Оразова
(қолы, күні)

Кафедра меңгерушісі
б.ғ.д., профессор ________________________ Т.А. Карпенюк
(қолы, күні)

Алматы, 2010
МАЗМҰНЫ
Бет
КРІСПЕ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 3
1 ӘДЕБИЕТКЕ 5
ШОЛУ ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... .
... ... ... ... ..
1.1 Криосақтау жөнінде жалпы 5
түсінік ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
1.2 Криопротекторлардың 5
түрлері ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
... .
1.3 Әртүрлі организмдерді мұздатып 9
сақтау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
1.4 Жиі пайдаланылатын 10
әдістер ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
... ...
1.5 Криосақтау әдісі – витрификация кезіндегі 11
криозақым ... ... ... ... ...
1.6 Көк –жасыл балдырларға 14
сипаттама ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ..
2 МАТЕРИАЛ ЖӘНЕ ЗЕРТТЕУ 18
ӘДІСТЕРІ ... ... ... ... ... ... .. ... ... ...
3 ЗЕРТТЕУ НӘТИЖЕЛЕРІ ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛДАУ ... ... ... ... . 22
ҚОРЫТЫНДЫ ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ... .. 37
... ... ... ... ... ... ... ... .. ...
ҚОЛДАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР 38
ТІЗІМІ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
КІРІСПЕ

Микробалдырлар және цианобактериялар бағалы қоспалардың продуценттері
болумен қатар, биотехнологиялық өндірістер үшін ыңғайлы обьект болып
табылады. Оларды биологиялық белсенді қоспаларды, экономикалық тұрғыдан
маңызды қосылыстарды және биожанармай жасауда қолданады. Сонымен қатар
антропогендік фактор нәтижесінде ластанған қоршаған ортаның мониторингін
жүргізу үшін, ағынды суларды биотазалауда да қолданысқа ие. Осыған
байланысты биотехнологияда балдырларды қолдану бүкіл әлемде етек ала
бастады. Алайда өндірістік биотехнологияда фотоавтотрофты синтезді қолдану
үшін коллекционды штаммдардың бүтіндігіне кепіл болу керек.
Энергетикалық, азық-түлік мәселесі өткір проблемалардың бірі. Бұл
проблемалардың шешімі - адамзаттың тұтынатын өнімдерінен басқа шикізат
табу. Осындай шикізаттың бірі – микробалдырлар. Олар өздерінің таптырмайтын
қасиеттерімен, атап айтсақ, көптігімен, пайдалы құрамымен және де тез
көбейетіндігімен ерекшеленеді. Дәл осы қасиеттерін пайдалданып, оларды
азықтық белок ретінде, энергия алудың альтернативті жолы ретінде,
биологиялық активті қосылыстардың таптырмайтын, құнды көзі ретінде қолдану
қажет. Онымен қоса, микробалдырлар адам тағамының бәсекелесі емес.
Микробалдылдарды сақтаудың біраз қиыншылықтары: микробалдырларды
субкультуралауды,т контаминациядан сақтауды, микробалдырлардың көбеюі тез
болғандықтан, бүкіл коллекцияны түрде бір уақытта себуді, культуралардың
қайта отырғызылуын, олардың физиологиялық жағдайын үнемі тексеріп тұруды
қажет етеді.
Бірқатар авторлардың ұсынған микробалдырлардың өміршеңдігіен сақтау
әдістері: лиофилизация, сусыздандыру, альгинатта инкапсулданған күйде
сақтау және -20ºС градуста қатқан күйінде вазелин майының астында сақтау
және т.б. – әдістері өздерінің белгілі бір балдырларға қолайлығын
көрсетті. Осылайша, өңдеу әдістерін вариациялау арқылы микробалдырларды
криосақтаудың барынша оптимальді режимдерін табуға болады.
Алайда мемлекеттік масштабта микробалдырлардың коллекциясы жинақтау
маңызды болғандықтан, микробалдырлардың коллекциясын сақтау әдістерін табу
керек. Бұл жұмыстың өзектілігі де сонда.
Көптеген мемлекеттер микробалдырлардың ең тиімді сақтау әдісі
–криосақтау деп таныды. Криосақтау жолымен микробалдырлардың коллекциясын
сақтау көптеген мақсаттарға қол жеткізуге себепкер болып отыр. Осыған
байланысты биотехнологиялық обьект ретінде микробалдырлардың сақталуы
маңызды саты болып табылады.
Бұл жұмыстың мақсаты әртүрлі криоқорғағыштар мен осмотиктердің
комбинациясының көк-жасыл балдырларға әсерін анықтау және белгілі бір
балдырға өзіне тән криопротектор мен осмотиктің үйлесімін табу болып
табылады. Осы арқылы балдырларды криосақтауға арналған протокол құру.
Осының арқасында мемлекеттік масштабта криобанк негізін салу керек.
Мұндай генетикалық криобанктарды жасау – болашақта Жер шарының
алуантүрлілігін сақтауға немесе жаңартуға, демек Табиғат тепе-теңдігін
сақтауға мүмкіндік береді.
Криобанк міндеті - әртүрлі, әсіресе жоғалып бара жатырған және сирек
кездесетін өсімдік және жануарлардың генетикалық ақпаратын сақтап тұрған
биологиялық материалдарды жинау, және ұзақ уақытқа сақтау.
Криосақтау – биологиялық обьектілерді тірі күйінде терең қатыру
әдістерін табудың жолын қарастыратын криобиологияның саласы. Бұл тірі
организмдердегі зат және энергия алмасуы тоқтауы арқылы организмнің көп
уақыт сақталуымен түсіндіріледі.

1. ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ

1.1 Криосақтау жөнінде жалпы түсінік
Клеткалық суспензияның төмен температурада қатуын мынадай сатылармен
сипаттауға болады:
1) клетканы әдетте қоршап тұратын ортаны криопротектордың (әдетте
гипертоникалық) ығыстырып шығаруы, және белгілі бір уақыт бойы (бір
секундтан бірнеше сағатқа дейін), тұрақты температурада клеткалардың
ондағы экспозициясы;
2) белгілі бір клетка мөлшерін криоқорғағыш ерітіндіде терең мұздату
(әдетте - 80 -196ºС-ге дейін).
3) Биологиялық обьектіні ұзақ уақыт бойы тұрақты температурада сақтау
(тоңазытқышта, сұйық азот буында немесе сұйық азоттың өзінде)
4) Обьектті белгілі режиммен 0ºС- ден жоғары температураға дейін жылыту.
5) Криопротекторлық сұйықтықты физиологиялық индифферентті ортамен
ығыстыру.
Қазіргі кезде биологиялық суспензияларды төменгі температурада сақтау
туралы ақпараттарға сүйенсек, биообьекттерді төмен температурада сақтау
клеткалар мен мембраналарды қатырып, еріткеннен кейін айтарлықтай зиян
тегізбейтінін түсінеміз.Сондықтан егер биообьекттерді тез арада төмен
температурада (мысалы, -196º С-та) қатыруды және дәл солай қажетті
температураға дейін жылытуды үйренсек, биологиялық обьекттерді тірі күйінде
сақтау мәселесін шешілдіге санауға болар еді.
Қазіргі кезде биологиялық обьектілерді төмен температурада мұздатуда
қоладынылатын әдіс - тәсілдерді қолдану кезінде, оларда үлкен өзгерістер
болып жатады, соның ішінде бүкіл клеткаішілік құрылымның айқын қайта құрылу
құбылысы, оның агрегаттық күйінің, құрамының және т.б. физика-химиялық
қасиеттерінің өзгерісі өтеді. Мұздату процесі кезіндегі зақымданулардың
басым бөлігі тура және жанама түрде клетка ішінде мұздың пайда болуымен
байланысты.

1.2 Криопротекторлардың түрлері
Биологиялық обьектілердегі мұздату, жылыту кезінде зақымданудың алдын
алатын заттарды криопротектор деп атаймыз. Эффективті криопротекторларға
әртүрлі классқа жататын химиялық қосылыстар жатады. Бұл – спирттер
(этиленгликоль, α-пропиленгликоль, глицерин), амидтер (диметилацетамид),
оксидтер (диметилсульфоксид), жасанды полимерлер (поливинилпирролидон,
оксиэтилденген крахмал, полиэтиленгликоль). Алайда жоғарыда аталған
химиялық қосылыстар тізім толық емес екенін ескеру керек.
Криопротекторлар криоқорғаушы орталардың компоненті, одан басқа
ортаға органикалық және бейорганикалық қосылыстар да кіруі мүмкін. Осы
орталарды клетка суспензиясына енгізген кезде (оларда ұлпалық препараттарды
ұстау немесе органдарды олармен перфузиялау) клеткаішілік және клеткасырты
орталардың құрамы өзгеріп, мұздатқан кезде клетка және клеткадағы
құрылымдардың зақымдануының ықтималдығы төмендейтіндей дәрежеге жетеді.
Криопротектордың қасиеті қандай болуы тиіс деген сұраққа әлі де толық
жауап беру мүмкін болмай отыр, дегенмен кейбір криопротектор қасиеттері
белгілі. Криопротектордың улылығы болмауы тиіс, суда жақсы еруі керек,
әртүрлі температурада клетка ішіндегі қататын судың мөлшерін азайтуы және
криопротектор мен судан тұратын ерітіндідегі судың қатуын болдырмайтын және
клетка аморфты күйге жеткенше белоктар мен тұздарды еріген күйде сақтай
алуы тиіс. Криопротектордың пайдалы, міндетті емес қасиеттерінің бірі –
клеткалық мембрана арқылы оңай өтуі.
Криосақтағыш ортадағы су фракциясының криопротектор арқылы қатуы кең
температуралық аймақта жүреді, және қатпаған су мөлшері 20-30%-ға жеткенде
аяқталады. Криопротектордың (қатыруға дейінгі) концентрациясының көбеюі
клеткаішілік және клетка сыртындағы тұздардың концентрациясының
төмендеуіне әкеледі. Криопротекторлар әсерінен тұздар не зиянды әсер
болатындай концентрацияланбайды немесе зақымдану баяу жүретін
температурада зиянды концентрацияға жетеді.
Криосақтаушы ортаның құрамындағы суды қатыру кезінде криопротектордың
гипертоникалық (бірақ зақымдаушы концентрациясына жетпеген) концентрациясы
клеткалардың сусыздануын шақырады, ал ол өз кезегінде клеткаішілік
коллоидтардың концетрациясын жоғарлатады. Соңғылары жоғары концентрацияда
криосақтаушы қасиетке ие болады: клеткаішілік ортаның шектен қатып
кетуінен қорғайды, және оның шыны тәрізді күйге енуіне көмектеседі, ал бұл
құбылыс клетканы жарып кете алатын мұз кристаллдарының пайда болуын
тежейді.
Криопротектордың клетка ішіне жедел кіруі оны гипертоникалық
криосақтаушы ортада зақымданудан сақтайды және клетканы сусыздандыру
кезінде клетканы қатыру мембрананы клеткаішілік және сыртылық зақымдаушы
ерітінділердің концентрация градиентінен зақымдануынан сақтайды. Клеткаға
енетін криопротекторларды клеткаға енбейтін криопротекторларға қарағанда
клетканың суын қатырған кезде клетканы жақсырақ сақтайтындығына қарамастан,
оларды қолдану клетканы изотоникалық ортаға қайтаруға байланысты
проблемаларға тап боламыз. Айта кету керек, криопротектордың клетка
мембранасына жақсы енетіндігі, органеллалар мембранасына жақсы енетіндігіне
кепіл болмайды, өйткені клеткада криопротектор концентрациясын жоғарлатқан
кезде олар зақымдануы мүмкін.
Кейбір кең танымал криопротекторларға сипаттама беріп өтейік, оларға
мынадай заттар жатады: глицерин, ДМСО (диметилсульфоксид), диметилацетамид,
этиленгликоль, поливинилпирролидон (ПВП), α- Пропиленгликоль.
Глицерин – молекулалық массасы 92,10 болатын көп атомды спирт.
Құрамында ОН тобы болғандықтан , ол сумен кез келген қатынаста байланыса
алады. Оған қоса, глицериннің тұздарды, сілтілерді, мочевинаны, сахарозаны
және газдарды еріту қасиеті бар. Глицериннің 50% - дық ерітіндісінің
тұтқырлығы бөлме температурасында судың тұтқырлығынан 5,41 есе көп.
Глицерин ерітінділерінің осмотикалық қысымдары шамамен мынадай : 1%- 4,56
· 105Па; 5%-12,6·105 Па; 10% -28,56·105 Па; 15% - 47,4·105 Па; Глицериннің
суда еруі жылу бөлінумен және көлемінің кішіреюімен қатар өтеді.
Глицерин биологиялық (жануарлардан алынған) обьекттер үшін бөтен зат
емес, ол тағам құрамында майлармен бірге жүреді,бауырдың зат алмасуының
нәтижесінде түзіледі, май қышқылдарының және глицерин эфирі клетка
мембранасының құрамына кіреді. Медициналық практикада глицерин осмотикалық
әсер препараты ретінде қолдланылады. Қазіргі кезде глицеринді
ауылшаруашылық жануарлардың спермасын, қан клеткаларын, адамның және
жануарлардың кейбір ұлпасын ( тері, көздің қарашығы) төменгі температурада
сақтау үшін кеңінен қолданылады.
Глицериннің биологиялық обьекттермен әсерлесуінің нәтижесінде, оның
жағымсыз әсерлері де табылған. Ұлпа культурасындағы сүйек кемігінің
клеткаларының өсуін тежеген, кейбір микроорганизмдердің өсуін мүлдем
тоқтатқан, ал бұқа спермиінің ісінуіне әкеліп соққан. 15%-дық глицерині бар
ортада сүйек кемігінің клеткаларын инкубациялаған кезде, +4ºС-та
гранулоциттерде ультрақұрылымдық өзгерістер байқалғанмен, эритроидты және
лоимфоидты клеткаларда еш өзгерістер анықталмаған.
Диметилсульфоксид – оксидтер классына жатады. Молекулалық массасы 78.
Құрамында оттегі болғандықтан HClO4, фосфат және күкірттің тұздары мен
оксидтермен реакцияға оңай түседі, сондай-ақ глицеринмен, сахарозамен,
морчевинамен, стеарин қышқылымен және т.б. байланыстар құра алады.
Перманганат және сутегі асқын тотығы әсерінен тотығады. Сумен судың екі
молекуласының арасындағы байланыстан гөрі қаттырақ байланыстар түзеді.
Диметилсульфоксид ортопедия мен травматологияда қолданылады. Тәжиребелер
көрсеткендей диметилсульфоксид глицеринге қарағанда биологиялық обьектіге
жақсы сіңеді. ДМСО-ның осы қасиеті, оның көптеген клеткалар мен ұлпаларды
криосақтауда қолданылуына негіз болып отыр. ДМСО ұлпа культураларын, балық
спермасын, кейбір микроорганизмдерді төменгі температурада криосақтауда
кеңінен қолданылады.
Кей кезде криопротектор ретінде диметилацетамид, этиленгликоль,
пропиленгликоль қолданылады [1].
Диметилацетамид - лейкоцит және тромбоциттерді қатыруда қолданылады,
кейбір әдебиеттерге сүйенсек диметилацетамидтің глицеринге қарағанда
гранулоциттерді зақымдамайтындығын көреміз. Этиленгликоль клеткаға жылдам
сіңеді, ал жоғары концентрацияда 0ºС-та оларды зақымдамайды. Бірақ
диметилацетамидті қолдануды оның улылығы шектейді.
αПропиленгликоль - фармокопейлік мақсатта гидрофобты мазь немесе
дәрілерді ерітуші зат ретінде қолданады. Төмен температурада мұздатып
сақтау практикасында адам эритроциттерін, адам бүйрегінің клеткаларның
культурасын, құс және бұқа спермаларын сақтауда қолданады. Адам
эритроцитіне глицеринге қарағанда жақсырақ сіңеді.
Поливинилпирролидон (ПВП) - жасанды полимерлер классына жатады.
Медицинада плазмаалмастырғыш препарат ретінде молекулалық массасы 12 000-
14 000 болатын молекулалар қоладанылады. Бұдан молекулалық массасы
үлкенірек молекулалар әртүрлі (мысалы, альдегидтермен) қоспалармен
ластанған болып келеді. Мұндай қоспалар клеткада тотығу реакцияларын
шақырып, каталазалардың активтенуіне әкеп соғуы мүмкін. Одан басқа ПВП –
ның ірі молекулалары организмен нашар шығарылады, өз кезегінде төменгі
молекулалы ПВП молекулалары клеткадан нашар утилизденеді. ПВП құрамында
гидрофобты және гидрофильді аймақтары бар сулы ерітінділерде спиральді
конфигурацияға енеді.
ПВП –ның тұну жылдамдығын жоғарлатудан басқа, клетка мембранасына
әсер ете отырып, адам эритроцитін агглютинацияға әкеледі. Концентрациясы 7-
20% болатын (көбінесе 10-15%) ПВП көмегімен әртүрлі клеткаларды: адам
эритроцитін, қояндардың, адамның, тышқанның миелокариоциті, адам лимфоциті
мен лейкоцитін, қытай атжалманының фибробласт клеткаларының культурасын,
әртүрлі микроорганизмдерді, сегіз бластомер және ерте бластоциста
кезеңіндегі тышқан эмбрионын сақтауда қанағаттанарлық нәтижелер алынды.
Декстран және оксиэтилкрахмал. ПВП сияқты полидисперсті полимерлер
қатарына жатады. Криоконсервацияда қолданылғанға дейін плазмаалмастырғыш
ретінде белгілі болған. Медициналық практикада орташа молекулалық массасы
40 000 – 80 000 болатын декстран мен молекулалық массасы 60 000-тан
аспайтын оксиэтилкрахмалдың молекуласын қолданады.
Криобиологияда, оған қоса, криопртектор ретінде полиэтиленоксидтерді
қолданады. Ол өндірістің түрлі салаларында кең қолданысқа ие. Молекулалық
массасы 300-6000 болатын ПЭО фаркопеяда синтетикалық дәрілерді қосқыш
ретінде қолданылады. ПЭО препараттары жоғары дисперстілігімен ерекшеленеді.
Төменгі температурада мұздатуда сүйек кемігі мен қанның ядросы бар
клеткаларын, тері клеткаларын, көздің мөлдір қабығы клеткаларын және т.б.
клеткаларын (М.М. 400) ПЭО қоданылады. Адам эритроциттерін мұздатып
сақтау тәжірибесін (М.М. 1500) ПЭО сәтті өтті. 1500, 4000, 6000 – ға
тең молекулалық массасы бар ПЭО сомалық клеткаларды гибридизациялау үшін
қоданылады. (М.М.2000-4000) ПЭО белоктардың денатурацияға ұшырамай, тұнбаға
ұшырататыны мәлім. Сондай-ақ ПЭО ДНК-ның компактизациясын шақыра алады. ПЭО-
ның клеткаға енуі туралы мағлұмат аз[1].

1.3 Әртүрлі организмдерді мұздатып сақтау
Өсімдік клеткалары. Криосақтау-клеткалардың генетикалық сипаттамасы қай
мерзімде болса да тұрақты сақталуына кепіл болады. Бұл әдіспен әртүрлі
материалды сақтауға болады – протопласттардан ұрық пен тұқымға дейін.
Қазіргі уақытта клеткалар мен ұлпаларды, мүшелерді қатты мұздатып сақтау
медицина мен мал шаруашылығында кеңінен пайдаланылады. Ал өсімдіктермен
жағдай басқаша. Басты қиындығы – ол өсімдік клеткаларына тән ерекшеліктері
және мұздың оларға әсері[2,20]. Өсімдік клеткалары көлемі үлкен, вакуолі
зор, суы көп болғандықтан мұздату және еріту кезеңдерінде олар қатты
зақымданады. Ол мұздың клетка ішінде де, сыртында да қатуына байланысты.
Әдетте, мұз алдымен клетканы қоршаған сыртқы ерітіндіде пайда болады.
Цитоплазманың қату температурасы 1ºС, бірақ клеткалар -10 ºС - -15 ºС
дейін қатпай тұрады, себебі плазмалемма оған дейін мұздың кристаллдарының
клетка ішіне кіруін бөгейді. Мұз кристаллдары клеткаішінде өсе бастаса,
мембраналарды қиратады. Температура баяу төмендесе, клетканың бос суы жарым-
жартылай сыртқа шығып үлгереді де, ерітіндіде мұзға айналады. Ал мұздату
өте жедел өтсе, клетканың дегидратациясы жүріп үлгермейді де, мұз
цитоплазма ішінде түзіле бастайды. Бәсең мұздатқанда, клетка ішінде мұз
кристаллдары пайда болуы мүмкін, бірақ мұнда клетканың едәуір сорығуы мен
протоплазманың сығылысуы болмай қалмайды. Протоплазманың сорығуы, мұз
түзілу салдарынан сыртқы ерітіндінің концентрациясы өсуі себебінен болады.
Шектен тыс плазмолиз және соның нәтижесінде пайда болатын осмостық
стресс (әсіресе кейін өтетін деплазмолизде) клетканы зақымдайды.
Өсімдік клеткалары үшін оптимальді криопротектор ДМСО болып табылады.
Клеткаларды мұздатуға дайындағанда ДМСО қосып өсіреді [2].
Жануарлар клеткалары. Қазіргі кезде жануарлар клеткаларын
криоконсервациялау етек алды. Соның ішінде эритроциттер, эмбриондар,
сперма, гепатоциттер және т.б. Адам денесінің клеткаларын криосақтау
тәжірибелері де қарастырылып жатыр[20]. Мысалы адам эритроциттеріне
көптеген криопротекторлар қолданылған және протекторлардың көбісі сәтті
өткен. Ал глицерин адам эритроциттері үшін глицерин ең қолайлы протектор
болып қала береді. Адам эритроциттері үшін біріншіден, эритроциттерге терең
ене алатын төменгі молекулалы протектор және эритроциттерге енбей – ақ,
оларды сақтай алатын жоғарғы молекулалы протекторлар ізделініп жатыр[17].
Мұнда бір қиындық бар: эритроциттерге протектор енген кезде, клетка
мембранасы жарылып кетуі мүмкін, сондықтан шаю үшін қолданылатын
ерітінділердің осмостық қысым клеткалардың ісінуін болдырмауы керек.
Тышқан эмбрионымен жасалған тәжірибелердің нәтижесінде, ғалымдар тышқан
эмбрионын морула түрінде криосақтаған дұрыс деп шешті. Криопротектор ретіне
диметилсульфоксид қолданылады.
Бұқа спермасына байланысты тәжірибелердің негізі қаланып, қолданысқа ие
болды. Криоконсервация арқылы ірі қара малының асыл тұқымдарын алу өте
қолайлы, және мал шаруашылығында кеңінен қолданылу үстінде.
Микроорганизмдер. Криоконсервация микроорганизмдердің генетикалық
қасиеттерін еш жоғалтпауды қамтамасыз етеді. Микроорганизмдердің әр түрлі
штаммдары мен түрлері криосақтауға әртүрлі төзімділікті көрсетеді[13].
Споратүзуші бактериялар азотқа толтырылған контейнерге бірден салуға болса,
спора түзбейтін бактериялар өздеріне сай қатыру – еріту әдістерін іздеуді
талап етеді. Клеткалардың криосақтаудан кейінгі бүтіндігіне әртүрлі
факторлар әсер етеді: клетка жасы, өсіру жағдайы, суспензиядағы клеткалар
тығыздығы және т.б[10].

1.4 Жиі пайдаланатын әдістер
Басқарылмайтын екі сатылы мұздату. Құрамында евгленасы бар шыны ыдыстар
(10% метанол) криопротектантпен 10 минут бойы өңделіп, - 60 ºС - қа алдын
ала қойылған (Planer, UK) басқарылатын мұздатқышқа салынады.Одан соң үлгі
15 минуттан -1сағатқа дейін осы мұздатқышта тұрады. Одан соң сұйық азотқа
-196 ºС -қа салынады. Әрі қарай ССАР криосақтауышта сақталады.
Басқарылатын екі сатылы мұздату. Басқарылатын мұздатқышқа салудың
алдында алдын ала (10% метанол) криопротектантпен евглена клеткасын 10
минут өңдейді.Одан соң басқарылатын мұздатқыш температурасын -10ºС мин-1 ,
-5 ºС мин-1, -1 ºС мин-1 ,0.5 ºС мин-1 ,0.3 ºС мин-1 жылдамдықпен - 60 ºС-
қа дейін түсіріп, сұйық азотқа салудың алдында 15 минут ұмұздатқышта
ұсталады. Одан соң -196 ºС-та ССАР криосақтағышта сақтаймыз.
Витрификация протоколы. Клеткалар сахароза негізінде жасалған PVS2
(Yamada et al.,1991 ) және EG:JM негізінде жасалған PVS3 (Nishizawa et
al.,1993) витрификациялық ерітінділер арқылы витрификацияланды.
Қолданылмастан бұрын витрификациялық ерітінділер 0ºС- қа дейін мұздатылып,
алдын ала ресуспензияланған клеткалар суспензиясына енгізілді. Клеткаларға
витрификациялық ерітінділермен 0ºС- та 5 минут ұсталды, одан соң сұйық
азотқа салынды[3].
Инкапсуляция және дегидратация протоколы. Культуралар центрифугаланып,
инкапсулдеуден бұрын супернатант алынып тасталды. Концентрленген клеткалар
20мл альгинатқа салынады және қапталған клеткалар қолданылатын әдіске
байланысты 100мМ CaCl2-ке салынады ( Hirata et.al.,1995).
Инкапсуляцияланған клеткалар CaCl2 ерітіндісіне 15 минутқа салады да,
залалсыздандырылған сүзгімен фильтрлеп алады. Инкапсуляцияланған дәндерді
жеңіл кептіріп, фильтр қағазына қоямыз, одан соң EG:JM ортасына
ауыстырамыз. Инкапсуляцияланған клеткаларды 24 сағат 0,5 М сахарозамен және
24 сағат 0,75М сахарозамен толықтырылған EG:JM ортасында өсіреді.
Инкапсуляцияланған клеткалары бар альгинат дәндерді алдын ала өсірген
ортадан фильтр қағазы арқылы сүзіп алады, одан соң фильтр қағазымен жеңіл
кептіреді де, ламинар боксқа ауыстырады да Петри табақшасына егеді.
Инкапсулденген клеткалар ламинардың ауа ағынымен 1-4 сағат бойы
кептіріледі. Дегидратталған дәндерді сұйық азотқа салады[3].

1.5 Криосақтау әдісі – витрификация кезіндегі криозақым және басқа да
процестер
Балдырларды төмен температурада мұздатып сақтау (сұйық азотта -196 °С
–та) біртіндеп қолданысқа ие болып келе жатыр. Сұйық азотта сақтау
культураларды қайта отырғызуды қажет етпейтіндіктен, біраз артықшылыққа ие.
Оған қоса, осы әдіс балдырлардың генетикалық ақпараттың толық сақталуына,
шығынның аз болуына және де залалсыз болуына кепілдік бере алады. Қазіргі
кезде, қолданылып жүрген криосақтау протоколдары тек балдырлардың және
цианобактериялардың шектеулі түрлерін ғана сақтай алатындығымен осал.
Криогенді өңдеуге балдырлардың төзе алатын әдіс табылғанша, әдіс –
тәсілдерді жақсарту қазіргі міндетіміз. Осындай әдістердің бірі -
витрификация әдісі. Бұл әдіс клеткадағы су күйін басқарып, криогенді
температура әсеріне түскен клеткадағы мұздың пайда болуын тежеуге қол
жеткізеді. Нәтижесінде судың тұтқыр, аморфты, яғни кристаллды емес , шыны
тәрізді күйге ұшырайды. Оған қоса, витрификация әдісі әдетте қолданылып
жүрген басқарылмалы - мұздату әдісіне қосымша ретінде де қолданылады.
Криосақтау протоколдарының дамуы көбінесе эмпирикалық түрде болып
келді. Қазіргі кезге дейін криосақталған балдырлардың басым бөлігіне
кәдімгі химиялық криопротектанттар мен өңдеуді (диметилсульфоксид, глицерол
немесе метанол) және сұйық азотқа салудың алдында 0°С-тан төмен
температурада (-30°С - -60°С) ұстау арқылы екі сатылы мұздатуды қажет
ететін протоколдардың комбинациясын қолданылды. Криосақтаудың нәтижесіне
әсер ететін, өміршеңдік пен организмнің толық қалпына келуіне кепілдік
беруге шек қойып отырған бірқатар факторлар бар және ол факторлар
организмге байланысты өзгеріп тұрады. Пре- және посткриосақтау ( криогенді
емес) параметрлер ( культура жасы, тығыздығы, температура, қоректік орта
күйі, өсуерітіп алу ортасы, осмостық потенциалы мен құрамы) криогенді
параметрлері сияқты (криопротектант, мұздату және еріту режимі)
өміршеңдікке әсер ете алады. Сондықтан криосақтаудың шыңдалған және нақты
протоколдары нақты бағалануы керек.
Криосақтау кезінде балдырлар клеткасы не біртіндеп немесе жылдамдығы
басқарылмалы түрде мөлшерленген төмен температураға салынады, немесе тез
арада тура сұйық азотқа салынады [5]. Криозақымға Мазур құрамына (1) мұздың
зияны және (2) ерітіндінің зиянды әсері (клеткалардың дегидратациясы)
кіретін мұздату зақымының екі-факторлы гипотезасы деп анықтама берген.
Мазур клеткаларды мұздатуға арналған температура ауыстыру жылдамдығы өте
маңызды және белгілі бір жылдамдықта су клетканың компартменттерінде
жылжып, клеткадағы ерітінділерге әсер ететінін анықтаған. Әсіресе
балдырларға байланысты осы мәселе туындап отыр. Осылайша, төмен
температура әсерінен индукцияланған судың жылжуы кезінде жүретін
динамикалық өзгерістер мұздату кезіндегі судың күйі (қаттысұйық)
қаншалықты маңызды болса, криогенді сақтаудан кейінгі клеткалардың
өміршеңдігі үшін соншалықты маңызды шешуші фактор болып табылады. Су баяу
мұздату кезінде клетка ішінен клетка сыртындағы компартменттерге қарай
жылжиды және ол клетка ішінде біртіндеп концентрациясы өсіп келе жатырған
ерітіндінің тұтқырланған күйге енуіне байланысты болады.
Евглена тәрізді организмге мынадай тәжірибелер жасалған:
А) криопротектормен өңделмеген балдыр клеткасын өте жылдам (жүздеген
100°С мин-1., бірден сұйық азотқа) мұздатқышқа салған кезде, клеткаішілік
және клеткасырты компартменттер де қатып қалады. Клеткаішілік мұздың қатуы
кез келген организмге зиян. Криосақтаудың зақымы ретінде жылжу мүшелерінің
жоғалуы мен пигменттердің ағаруы байқалады.
В) Ал криопротектормен( диметилсульфоксид, глицерол, метанол) өңделген
балдыр жылдамдығы басқарылмалы(-5°С тен -0,5°С мин-1 аралығында) клеткасын
баяу мұздатуға салғанда, (А) жолындағыдай әртүрлі зақымға душар болатыны
анықталады.
С) Басқарылмалы мұздату кезінде мұз бірінші клетка сыртында пайда
болады. Мұны кристаллизация деп атайды және ол әдетте клеткадан тыс жүреді,
бірақ мұзды аз мөлшерде түзетін клетка ішілік құрылымдар. Нуклеаторлар
клетка бетіне (шаң бөлшектеріне, тез қататын белоктарға, бактерияларға
жабысып,) жайғасады да, де мұздың түзілуне қалып ретінде көмектеседі.
Клетка сыртында мұз түзіліп жатырғанда клетка ішінде су буының дефициті
пайда болып, су клетка сыртына жылжып, сонда қатады. Бұл құбылысты крио -
дегидратациядеп қарастыруға болады, өйткені су клетка сыртына шығып, клетка
езіліп қалғандай болады. Клеткаішілік ерітінді өседі, сөйтіп, клетканың
қату нүктесінің төмендеу процесін супермұздату немесе клеткада мұздату
депрессиясының нүктесі деп аталады[19]. Клетка сыртында мұз түзіліп
жатырған кезде мұздату жылдамдығы мен температураны бақылау криобиологиялық
маңызды параметр болып табылады. Мұның өзі судың клетка мембранасы бойы
жылжуын бақылайды, мұздың жинақталуын, жайылуын және кристалл мөлшерін
бақылауға мүмкіндік береді. Криоконсервация сәтті өтуі үшін криогенді
температура әсерінен клетка ішіндегі аз мөлшердегі су мұз түзе алатындай
қабілетке ие бола алатындай етіп, крио - дегидратацияға қол жеткізетіндей
мұздату жылдамдығын табу керек. Баяу мұздату процесі ерітінділердің
концентрациясы жоғарлайтындықтан клеткалар үшін зиян және (рН және ион
балансын өзгерту арқылы) клетканың қалыпты метаболизмін төмендетеді. Одан
басқа, осмостық эффект клеткаларды өлімге әкелуі мүмкін, өйткені клетка
өлшемі өзгеріп, мембрана жыртылып кетуі мүмкін. Әдетте таза су мұз түзуші
агенттер бар ортада 0°С –та қатады, бірақ ол in vivo жағдайда тек өтеді.
Криоконсервация өңдеуіне (криопротекция мен баяу мұздату) түскен
клеткалардың суы -40°С-та суперқатады, бұл температура гомогенді мұздың
түзілу нүктесі.
D) Ерітінділердің зиянды әсері клеткаға енетін криопротектанттарды
қолданғанда төмендеуі мүмкін. Мұндай криопротектанттарды байланыстырушы
деп атайды, себебі олар клетка ерітінді концентрациясының зиянына қарсы
қорғайды (С жолындағыдай). Байланысушы криопротектанттар клетка құрамына
еніп, біршама төмен температурада ерітіндіде қалуы керек. Алайда
криопротектанттар тек белгілі бір мөлшерге дейін байланысу мен төмен
температурасының стрессіне шыдай алатындай нүктеге дейін мұздау
депрессиясының нүктесі бола алады. Осылайша, крио-дегидратация кезінде
клетка суы сыртқа шығып жатыран кезде, криопротектанттар клеткаішілік
ерітінділермен байланысып, олардың орнын басады. Бұл өз кезегінде зиянды
ерітіндінің концентрациясын төмендетеді, клетканың қатпаған фракциясын
көбейтеді және қатыру немесе еріту кезінде жүретін потенциалды осмотикалық
зақымның нәтижесінде болатын клетканың жарылуынан шектейді.
Е) Криоконсервацияда клеткалар соңғы шыдам температурасына дейін
басқарылмалы мұздатуға ұшырайды. Соңғы шыдам температурасы әдетте
гомогенді мұз түзуші температураға, яғни -40°С-қа тең. Балдырларға келетін
болсақ, олардың температуралары гомогенді мұз түзілетін температурадан
төмен. Соңғы шыдам температурасына жеткен соң клеткалар мен
киопротектанттар сұйық азотқа салынады. Ескерте кету керек, дәл осы сатыда,
яғни клетка сыртында мұз түзілгенше (C-D), клеткалардың өміршеңдігі
клеткаішілік қалған сұйықтықтардан мұз тұзілуіне байланысты болады. Әрі
қарай оқиға екі жолмен дами алады: (1) немесе су мөлшері үлкен мұз
кристаллдарын түзуге жеткіліксіз болып (байланысушы криопротектанттар мен
криодегидратация нтижесінде), ал түзілген кішкене мұз кристаллдары клеткаға
зақым тигізбейді ненемесе (2) криодегидратация процесі кезіндегі ерітінді
концентрациясы әсері клетка тұтқырлығын жоғарлатқаны сонша, клеткадағы
қалдық су төмен температура әсерінен витрификацияланды.Сондықтан әдеттегі
криосақтау әдістерінің сәттілігі мұздың түзілуін криодегидратацияны іске
асыру үшін басқаруға тікелей байланысты. [6,7] Клетканың криогенді
температураға шыдай алуының басты себебі – клетка сыртында мұз түзіліп
болса да, клетка ішіндегі витрификацияның іске асуы.Осыны негізге алып
криосақтау процесіндегі судың басты үш күйін ажыратуға болады:
1-ші күй. ЖАЛПЫ МҰЗДЫҢ ТҮЗІЛУІ: Мұз экстрацеллюларлы және
интрацеллюларлы компартменттерде түзілді. Ол летальді болып келеді.
2-ші күй. ЖАРТЫЛАЙ ВИТРИФИКАЦИЯ: Мұз экстрацеллюларлы түзілді, бірақ
криогенді температура әсерінен клетка ішіндегі су витрификацияланды.
Клеткасыртылық мұз пайда болуы рұқмат етіледі және ол барлық жағдайда
летальді емес. Басқарылмалы мұздату, мұздың түзілуі, криодегидратация және
байланысушы криопротектанттар, -осының барлығы криосақтау протоколдарына
жатады.
3-ші күй. ТОЛЫҚ ВИТРИФИКАЦИЯ: Мұздың түзілуі клетка сыртында және ішінде
тежелді.
Витрификация дегеніміз – сұйықтардың қатуы, бұл күйдегі сұйықтықтардың
құрамы әлі де ретсіз орналасқан молекулалардан тұрады, бірақ оның
физикалық және механикалық қасиеті қатты заттыкіндей болады. Алайда физика-
химиялық тұрғыда шыны метастабильді деп қарастырылады,өйткені ол
девитрификациядан кейін не сұйық күйге, не қатты күйге өтуі мүмкін.

1.6 Көк-жасыл балдырларға сипаттама
Көк - жасыл балдырлар немесе цианеялар - прокариоттарға жататын,
морфологиялық жағынан бактерияларға ұқсас организмдер. Цианеялар жоғары
сатылы өсімдіктерге және бактерияларға ұқсайтындықтан олар екі
номенклатураға бағынады: ботаникалық және микробиологиялық. Сондықтан
оларды кейде көк- жасыл балдырлар деп атаса, кей кезде цианобактериялар деп
атайтыны сондықтан[12]. Басқа балдырлардан айырмашылығы – оларда
хроматофорларының және тұрақты ядроларының болмайтындығында. Физиологиялық
тұрғыдан цианеялардың төменгі сатылы өсімдіктерге қарағанда хлорофиллдері
бар, осы себептен олар көмірқышқыл газын ассимиляциялауға қабілетті, яғни
фотоавтотрофты қоректене алады. Цианеяларға көк- жасыл түс тән, алайда
олардың түстері ашық қызылдан қошқыл қараға дейін ауытқи алады. Бұл
хлорофил а, фикобилиндердің, яғни ашық көк – фикоцианиннің, және қызыл
пигмент – фикоэритриннің болуымен түсіндіріледі. Көк-жасыл балдырлардың
арасында бірклеткалылар, колониальділер, және көп клеткалылар (жіпшелілер)
кездеседі. Кейбіреулері сырғанау арқылы қозғала алады[11].
Көк-жасыл балдырлардың протопластары сыртқы қабат – хроматоплазмадан,
ішкі қабат – центроплазмадан тұрады. Протопласттың сыртқы бетінде
пептидогликан қабатына қосымша липополисахаридті қабаты бар[14]. Көптеген
формалар экзополисахаридтер бөліп, олар не клетка сыртында шырыш, не клетка
сыртында капсула, ал трихомалар сыртында қапшық (чехол) түзеді.
Хроматоплазмада фотосинтез процесін іске асыра алатын ламеллалар
орналасады. Цитоплазмалары қозғалмайды, - тұтқырлығы жоғары гель түрінде
болады[15]. Ал центроплазмада ядро заттары, қор заттары, және т.б.
орналасады. Олардың хлоропласттары және митохондриялары жоқ. Планктонды
цианеялардың газды вакуольдері болады. [8]
Жоғарыда айтылғандай цианеяларға бір клеткалы да, көп клеткалы да
балдырлар жатады, осыған байланысты оларды бес топқа бөлуге болады:
1. Хроококкты – бірклеткалы таяқшалар мен кокктар. Клеткалары бір-бірден
немесе агрегат күйінде тіршілік етеді. Өзара капсуламен немесе шырышпен
бірігеді. Бинарлы бөліну және бүршіктену арқылы көбейеді. Бұл топқа
Synechococcus,Gleothece және Glepbacter violaceus жатады.
2. Плеврокапсалылар – бұлар да бір клеткалылар , бірақ көптік бөліну
арқылы көбейе алады. Бұл кезде бөлініп жатырған клетканың ішінде
көптеген ұсақ клеткалар, беоциттер, пайда болады. Өкілдері Pleurocpsa,
Dermocapsa, Myxosarcina .
Келесі үш топ – клеткаларының жіпше тәрізді жалғасатындығымен
ерекшеленеді. Өсу - интеркалярлы бөліну арқылы жүзеге асады. Трихома түзе
алады, яғни тізбек жасай орналасады, осы трихомдары арқылы қозғала алады.
Кей жағдайда трихома сынып, орнына гормогониялар пайда болу арқылы көбеюі
мүмкін.
3. Гетероцистасыз жіпшелілер – трихомалары тек вегетативті клеткалардан
тұрады. Өкілдері -Oscillatoria, Spiruliuna, Lyngbya, Phormidium,
Plectonema.
4. Гетероцисталы жіпшелілерде – трихомаларда азот болмаған кезде клеткалар
гетероцисталар түзе отырып дифференциацияланады. Бұл топқа Аnabaena,
Nostoc,Calothrix жатады.
Көк-жасыл балдырлар кембрий дәуірінің қазбаларында табылған ежелгі
микробалдырлар.Өте кең таралғандығы сонша,басқа өсімдіктер өмір сүре
алмайтын аймақтарда пайда болуы мүмкін, мысалы аралдарда. Көк-жасыл
балдырлардың басым бөлігі ащы суда, ал аз бөлігі теіздерде кездеседі.Бұлақ,
өзендерде анабена, глеотрихия, микроцистис сияқты түрлері судың
гүлденуіне әкеп соғады.
Адамзат өмірінде көк-жасыл балдырлардың маңызыдылығы мен қатар (жеуге
жарамдылығы мен азотфиксациялайтындығы) зияны да бар (улылығы, гүлденудің
себепшілері өлгеннен кейінгі судың ластануы.
Зертеу зерзаты ретінде көк-жасыл балдырларға жататын бірнеше өкілдер
алынды. Олар – Nostocales тұқымдасына жататын Anabaena, Nostoc, Calothrix
туысының балдырлары.
Anabaena туысы – жеке немесе ретсіз жинақталған жіпшелерден тұрады.
Жіпшелерсимметриялы, жуандығы ұзына бойы бірдей, домаланған немесе бөшке
тәрізді вегетативті клеткалардан және аралық (интеркалярлы)
гетероцисталардан тұрады. Жіпшелер тік немесе майысқан. Анабена түрлері
бентоста (су түбінде) қалай кездессе, планктонда (су бетінде) да соншалықты
кездеседі. Планктонда өмір сүретін клеткаларда газды вакуольдері болады.
Әдетте вегетативті клеткалардың интерцеллюларлы бөлінуі нәтижесінде пайда
болатын, гормогония деп аталатын қозғалғыш жіпшелер арқылы көбейеді.
Демек, анабеналардың белсенді қозғалып жүрген гормогонияларында ата-
анасының трихомының гетероцистасы болуы мүмкін. Гормогоиялар
клеткалардың көлденеңінен бөлінуі арқылы көбейеді. Көптеген түрлер
вегетативті кеткалардан пішіні мен мөлшері бойынша айырмашылығы бар
спораларға ие. Олардың да өсуі клеткалардың көлденеңінен бөлінуі нәтижеінде
пайда болады. Өскінде пайда болатын ең алғаш гетероцисталар жиі термальді
болып келеді. Бірқатар түрлер үшін ( A.cylindrica, A.oryzae, A.variabilis
және т.б.) атмосфералық азотты сіңіретіндігі дәлелденген.
Nostoc туысы – әртүрлі пішінді және мөлшерлі : өте ұсақтан қара өрікпен
бірдей ірі; сфера тәріздестен эллипстәріздеске дейін; ретсіз жайылғаннан
жіпшетәріздке дейін алуан түрлі, сілемейлі немесе шырышты колонияларымен
ерекшеленеді. Әртүрлі консистенциядағы шырыш құрамында алуантүрлі
ширатылған немесе ретсіз ұйысқан, тіпті колония центрінен біркелкі
радиалды шашыраған жіпшелерден (трихомдардан) тұрады. Трихомдары анабенаның
трихомдарына ұқсайды, алайда вегетативті клеткалар мен қатар интеркалярлы
гетероцисталары да бар. Көбеюі – гормогониялар арқылы. Соңғылары
вегетативті клеткалардан гетероцисталар үзіліп қалғанда пайда болады,
осылайша гормогониялар гомоцитті болып шығады. Гормогонийлердің пайда болуы
клеткада қайта құрылыстың басталуына себепші болады, бұл өзгеріс сырттан
клеткалардың пішіні мен мөлшерінің өзгеретінімен байқалады. Бентостық
формалардавегетативті жағдайда газды вакуольдері болмаса, гормогоний
клеткаларынада олар пайда болады. Гормогониялар қозғалып бастайды да,
ыдырай бастаған аналық шырыштан шығады. Егер аналық шырыш перидерммен
қапталса, онда бұл қабат ыдырап кетеді. Әдетте гормогониялар өзінің
сырғығыштығының және газды вакуолінің болуына байланысты түрдің көбеюіне
көмектеседі. Белгілі бір сырғу периоды өткен соң бентосты балдырлар газды
вакуольдерін жоғалтады да, спиральданған жіпшелерге айналады. Сол кезде
гормогоний клеткалары қиғашынан немесе тігінен бөлінеді. Тігінен бөлінген
кезде ең бірінші екі қатарлы жіпше пайда болады. Одан соң белгілі бір
клеткалар ажырап кетеді де, ностоктарға тән зигзаг тәрізді жіпше ... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.