ТАЕ буфері

Жұмыс түрі: Реферат
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 13 бет
Таңдаулыға:

ҚАЗАҚ ҰЛТТЫҚ АГРАРЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ
АКУШЕРЛІК, ХИРУРГИЯЛЫҚ ЖӘНЕ ӨСІП - ӨНУ БИОТЕХНОЛОГИЯ ФАКУЛЬТЕТІ

2 СӨЖ
ТАҚЫРЫБЫ: ТАЕ,ТБЕ буфері, молярлық,милимолярлық концентрация, ПТР өнімінің рестрикциясы, гель құжаттау жүйесі

Орындаған:

Алматы - 2020ж

Жоспары

I. Кіріспе
1.1 ТАЕ,ТБЕ,ТЕ буфері, молярлық,милимолярлық концентрация, ПТР өнімінің рестрикциясы, гель құжаттау жүйесі
II. Негізгі бөлім
2.1 ТАЕ буферін дайындау
2.2 ТВЕ буферін дайындау
2.3. Молярлық,милимолярлық концентрация
III. Қорытынды
IV. Пайдаланылған әдебиеттер

Кіріспе
1.1 Молекулярлық генетика - молекулалық биология және генетика түйіндерінде биология саласы. Шындығында бұл молекулалық биология секцияларының бірі. Генетика саласында молекулярлық биология тұқым қуалайтын заттың химиялық табиғатын анықтады, жасушадағы ақпаратты сақтаудың физикалық-химиялық алғышарттарын көрсетті және бірнеше ұрпаққа берілу үшін дәл көшірді.
Генетика бөлімі және молекулалық биология оның мақсаты қуалаудың материалдық-техникалық базасын білу және өзгермелілігі жасушаішілік жатқан зерттеулер, молекулалық деңгейде, трансфер процестерді, жүзеге асыру арқылы живому және генетикалық ақпаратты өзгерту, сондай-ақ оны сақтау.
40-жылдары М. қала тәуелсіз бағытта тұрды. 20 дюйм (. Рентген құрылымдық талдау, хроматография, электрофорез, жоғары жылдамдықтағы центрифугалау, электрондық микроскопия, радиоактивті изотоптарды пайдалану, және тағы басқалар. D) жаңа физикалық және химиялық әдістерін биология енгізуге байланысты, бұрын-соңды қарағанда әлдеқайда тереңірек және дәлірек мүмкіндік берді, құрылымы мен нақты функцияларды зерттеуге ұяшықтың компоненттері және бүкіл ұяшықтың бірыңғай жүйе. биология жаңа әдістерімен физика және химия, математика және кибернетика жаңа идеялар келді. классикалық генетика негізгі объектілері, төменгі (прокариоттар) бойынша - - бактериялар мен басқа да көптеген организмдер, сондай-ақ вирустар М. қарқынды дамуында үлкен рөл жоғары организмдер бар генетикалық зерттеулер ауырлық орталығының жылжуы атқарды. генетикалық мәселелерді шешу үшін өмір қарапайым нысандарын пайдалана отырып, артықшылықтары осы нысандарда жылдам ұрпақтар ауысуы болып табылады, және сол уақытта жеке тұлғалардың үлкен санын оқуға мүмкіндігі; бұл генетикалық талдаудың қарқындылығын арттырады және оның дәлдігін арттырады.

Негізгі бөлім
ТАЕ, ТБЕ буферін дайындау
2.1 TAE (Tris-acetate-EDTA) аралық буфер және агарозды гель ретінде де қолданылады. Сондай-ақ, кең ауқымды мутацияны талдау үшін градиент гелдік электрофорез әдістерін қолданумен сипатталды. TAE әр түрлі концентрацияларда ДНҚ натрий хлориді бар және онсыз ерітіндідегі мобильдікті зерттеу үшін қолданылған. ДНК үлгісіндегі натрий хлоридінің (және басқа да көптеген тұздардың) жоғары концентрациясы оның қозғалғыштығын жоғарылатады. Бұл нәтижесінде алынған ДНҚ жолағын үлестірудің дұрыс емес түсіндірулеріне әкелуі мүмкін.
TBE буферімен салыстырғанда, TAE буфері ДНҚ үлгісі үшін келесі ферменттік қосымшаларда артықшылықтарды ұсынады. Мысалы, егер ДНҚ үлгісі клондау экспериментінде қолданылса, агарозды гелге қарай ілесу қадамы клондау векторына (ковалентті байланыстыруға) негізделген (ең алдымен плазмид). Осы мақсат үшін ДНҚ үлгісі TAE буферінен жарамды, ал TBE буферінен ДНҚ жоқ. TBE буферіндегі Борат көптеген ферменттер үшін күшті ингибитор болып табылады. Бұл ферментті ингибирлейтін қасиет TBE буферін екі жағынан өз аумағында өте танымал етіп жасады. Біріншіден, TBE буферінде жұмыс істейтін ДНҚ үлгісі өзінің тұтастығын сақтауы мүмкін. Басқа басты себебі, көптеген агарозды гель электрофорларының мақсаты ДНҚ молекулаларының мөлшерін талдау болып табылады.
TBE немесе Tris Borate EDTA - Tris негізі, бор қышқылы және EDTA қоспасы бар буферлік ерітінді.
Молекулярлық биологияда TBE және TAE аралықтары көбінесе электрофорез болып табылатын нуклеин қышқылдары бар процедураларда қолданылады. Трис-қышқыл ерітінділері ДНҚ-ны сақтап, суда еритін сәл негізгі шарттар үшін тиімді буфер болып табылады. EDTA - двухвалентный катиондарды, әсіресе магний (Mg2 +) шифері. Бұл иондар көптеген ферменттер, соның ішінде ластаушы нуклеаздар үшін қажетті факторлар болғандықтан, EDTA рөлі нуклеин қышқылдарының ферментативті деградациядан қорғау болып табылады. Дегенмен, Mg2 + ферменттері мен ДНК полимераздары сияқты көптеген пайдалы ДНҚ-модифицирующие ферменттерінің коэффициенті болып табылады, оның TBE немесе TAE буферінде концентрациясы әдетте төмен (әдетте шамамен 1 мМ) болады.
Таяу уақыттарда табылған ТБЕ және ТЭА буферлері үшін электрофорезге арналған ауыстырғыштар табылды
54 г Трис базасы (CAS №77-86-1)
27,5 г бор қышқылы (CAS №10043-35-3)
20 мл 0,5 М EDTA (CAS №60-00-4) (рН 8,0)
HCl бойынша pH 8,3-ге теңшеңіз.
TBE электрофорезге дейін 1X дейін сұйылтуға болады, 0,5x де қолайлы. Жоғары шоғырлану шамадан тыс жылудың пайда болуына байланысты нашар нәтижеге әкеледі

1-сурет. 50 х ТАЕ буфері
Сипаттама
Thermo Scientific 50X TAE буфері (Tris-acetate-EDTA) агароздық және полиакриламидті гельдердегі нуклеин қышқылдарының электрофорезі үшін қолданылады. Бұл буферді геномдық және үлкен суперкубирленген ДНҚ үшін қолдануға болады, сонымен қатар, оны жүгіру және гель препаратының буфері ретінде қолдануға болады.
Өтініштер
Агароз және полиакриламид гелінде нуклеин қышқылдарының электрофорезі
:: Қолданыстағы буфер ретінде де, гельді дайындау буферінде де қолданылады
:: 0,22 мкм мембрана арқылы сүзгіленген
:: РНК мен ДНҚ фрагменттерін 1500 б.п.-тан жоғары, геномдық ДНҚ және үлкен суперкірленген ДНҚ үшін шешу үшін ұсынылады
50Х TAE электрофорез буферін дайындау
1X Tae буферін дайындау үшін 20 мл концентрацияланған 50x TAE буферін 1 л-ге дейін тазартылған су қосып, жақсылап араластырыңыз.
1X Tae буфері бөлме температурасында сақталады.
Нуклеин қышқылдарын визуализациялау үшін Элек - тродты 1X Tae буферге 0.3 мкгмл концен - трацияға дейін бром этидиясын қосу ұсынылады.
Пайдаланудағы шектеу:
Тек ғылыми-зерттеу мақсаттары үшін.TAE - ДНК-ның агарозды гельді талдау үшін қолданылатын өте таралған электрофорез буферлерінің бірі.
Онда Трис, сірке қышқылы және EDTA бар.
Трис-ацетат электр өткізгіштігін қамтамасыз етеді және рН-ды ұстайды.
EDTA металдан тәуелді нуклеаздарды двухвалентті катионды (Ca2 +, Mg2 +) шелаттар арқылы тежейді, осылайша ДНҚ-ны нуклеаздардан қорғайды.
ТБэ буферінде TBE-қа қарағанда буферлік әлеуеті төмен, сондықтан оны кеңейтілген және қайталанатын электрофорезге жол бермеу керек.
TAE буфері ДНК фрагменттерін ДНК-модифицирующие ферменттері арқылы өзгертуге тура келетін гелді қолдану үшін қолайлы. Осындай жағдайларда TBE буферінің борасы көп ферменттерді (мысалы, ДНК лигасы) тежейді, себебі TBE буферін пайдаланудан аулақ болу керек. Буфердің ТАЕ - трис-негізі , сірке қышқылы мен ЭДТ қоспасы бар буферлік ерітінді. Молекулалық биологияда ол АГАРОЗДЫ электрофорезде , әдетте , ДНК және РНК сияқты нуклеин қышқылдарын бөлу үшін қолданылады . Ол әдетте рН 8,3 және екі валентті катиондарды оқшаулайтын ЭДТА Трис-ацетатынан тұрады. TAE КЭ қарағанда төмен буферлік сыйымдылыққа ие және оңай сарқылуы мүмкін , бірақ желілік, екі тізбекті ДНК та-да жылдам жұмыс істейді.
Соңғы уақытта Brody & Kern гельді жүйелердегі тиімді және арзан өткізуші орта үшін КЭ мен ТАЕ буферін ауыстыру арқылы жеңілдетілген электрофоретикалық буферлер.
Буфердің ТАЕ әдетте зертханалық қолдану үшін 50x аналық ерітінді түрінде алынады. 50X бастапқы ерітіндісі суда 242g Tris негізін еріту жолымен, 57.1 mL мұз сірке қышқылын және 100 мл 500 мМ ЭДТ (рН 8,0), ерітіндіні қосу кезінде және нәтижесінде 1 л-ге дейінгі соңғы көлемді алуға болады.

Агарозды гелдегі ДНҚ электрофорезі
ДНҚ фрагменттерін ұзындығы бойынша бөлу үшін қолданылатын аналитикалық әдіс. Сыртқы электр өрісінің әсерімен гельде қозғалыс кезінде әртүрлі ұзындықтағы фрагменттердің қозғалыс жылдамдығына негізделген.
Әдісті қолданудың бірі-плазмидті ДНҚ-ны зерттеу. Ол әдетте сақиналы және екінші құрылымдарды құрайды, мысалы, суперспиральға бұрылады. Осылайша, плазмида мөлшерін анықтау үшін қайталама құрылым элементтерін бұзу қажет. Ол үшін гельді жағу алдында плазмидке "линеаризуют" (сызықтық жасайды), яғни рестриктаздың бірін (эндонуклеаз) өңдейді. Рестриктазаны плазмидты тек бір жерде кесетіндей таңдайды.
Ұзындығы әртүрлі ДНҚ фрагменттерін бөлу үшін агароза концентрациясы әртүрлі гель қолданылады. ДНҚ бөлінетін фрагменттерінің ұзындығы аз болса, агарозаның концентрациясы көп болуы керек:
Электрофорез жүргізу кезінде ДНҚ фрагменттері электр өрісі күштерінің әсерінен гельде қоныс аударады. ДНҚ молекулаларының сахарофосфатты остері теріс зарядталған, сондықтан ДНҚ тізбектері теріс зарядталған катодтан оң анодқа қарай қозғалады. Ұзақ молекулалар баяу, өйткені гельде кідіріп, қысқа молекулалар жылдам қозғалады.
Электрофорез басталмас бұрын үлгілерге электрофорез барысын визуализациялау және үлгілерді глицеринмен (үлгідегі 20% глицеринге дейін) ауырлату үшін PH қышқыл мәні бар екі түрлі бояғыш қосу қабылданды (осы мақсаттар үшін жиі ксиленді көк және бромфенолды көк қолданылады). Бояғыш процесті тоқтатқанда анықтау үшін қажет.
Электрофорез буферлік ерітіндімен толтырылған камерада жүргізіледі. Жиі құрамында ЭДТА, трис, сондай-ақ бор немесе сірке қышқылы бар буферлер қолданылады. Тиісінше, буфер бар, бор қышқылы қышқылы деп аталады TBE (tris-borate-EDTA), ал буфер бар, сірке қышқылы, -- TAE (tris-acetate-EDTA). TBE және TAE аналық ерітінділерінің концентрациясы, егер олардың жұмыс концентрациясымен салыстырсақ, тиісінше 6x және 50x құрайды. Буфер қосылған электр өрісінің әсерінен ДНҚ молекулаларының бөлінуі болатын ерітіндінің иондық күшін арттыру үшін қажет.

2-сурет. ДНҚ электрофорезінен кейінгі агарозды гельдің суреті. Сол жақ жол-белгілі ұзындықтағы ДНК фрагменттері

3-сурет.ПТР өнімдерін электрофоретикалық бөлу нәтижесі. Агарозды гель ультрафиолет әсерінен флуоресцирлейтін бромды этидимен боялған (мұнда толқын ұзындығы 312 нм)
Бөлінгеннен кейін (кейде бояғыш балқытылған агарозға енгізіледі) ұзындығы әртүрлі ДНҚ фрагменттері ДНҚ-мен ерекше өзара әрекеттесетін флюоресцентті бояғыштардың көмегімен визуализацияланады, мысалы, агарозды Гелдер әдетте бромды этидимен бояады, ол дуплекстің азотты негіздемелері арасында интеркалирлейді және УК-сәулелерінде флюоресцирлейді.
Өлшемдерді анықтау тексерілетін үлгілерде белгілі ұзындықтағы ДНҚ ("DNA ladder", "сызғыш", "ДНК маркерлері") және ДНҚ коммерциялық фрагменттерінің жиынтықтарын салыстыру жолымен жүргізіледі. Әдетте коммерциялық маркерлерде жолақтардың қарқындылығын салыстыра отырып, тексерілетін үлгілерде ДНҚ концентрациясын ... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.