Выделение чистых культур почвенных азотфиксирующих цианобактерий, перспективных для агробиотехнологии
Министерство образования и науки Республики Казахстан Казахский Национальный Университет имени аль-Фараби
Джалолов Д.
Выделение чистых культур почвенных азотфиксирующих цианобактерий, перспективных для агробиотехнологии
ДИПЛОМНАЯ РАБОТА
Специальность 5B070100 - Биотехнология
Aлмaты 2020
Министерство образования и науки Республики Казахстан Казахский Национальный Университет имени аль-Фараби
Кафедра биотехнологии
Допущено к защите:
Заведующий кафедрой биотехнологии, к.б.н., доцент Киcтаубаева А.C.
ДИПЛОМНАЯ РАБОТА
Тема: ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР ПОЧВЕННЫХ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ, ПЕРСПЕКТИВНЫХ ДЛЯ АГРОБИОТЕХНОЛОГИИ
Выполнил: студент 4 курса
Джалолов Д.
Научный руководитель:
к.б.н., доцент
Садвакасова А.К.
Норма контролер: преподователь
Бектилеуова Н.К.
Aлмaты 2020
РЕЗЮМЕ
Дипломная работа cоcтоит из 61 cтраниц, 15 риcунков, 6 таблиц, 69 иcпользованных иcточников литературы.
Цель исследования: Выделение и изуч ение активных штаммов азотфиксирующих цианобактерий, перспективных в агробиотехнологии.
Задачи исследования:
1.Выделить альгологически и бактери ологически чистые культуры азотфиксирующих цианобактерий из почв и альгобактериальных матов; 2.Определить продуктивность и способность к азотфиксации у выделенных штаммов цианобактерий;
Определить ростстимулирующий эффект выделенных штаммов цианобактерий на сельскохозяйственные растения.
Объект исследования: Nostoc sp Т-2; Anabaena sp Рп-1; Oscillatoria TI-3
Методы исследований: стандартные микробиологические и альгологические методы исследования; Методические указания Сиренко Л.А., Гайсина Л.А., Заядан Б.К.
Полученные результаты:
Изучен видовой состав альгофлоры горячих источников Уйгурского района и почвы рисовых полей Алматинской области и выделены 4 альгологически чистых культур микроводорослей и цианобактерий относящихся к классу Oscillatoriophycideae и к классу Synechococcophycideae отдела сине - зеленых водорослей и к классу Chlorophyceae отдела зеленых микроводорослей. Все исследованные изоляты были введены в состав коллекции лаборатории. Получены бактериологически чистыми и идентифицированы по культурально- морфологическим и физиологическим признакам 3 культуры выделенных штаммов микроводорослей: Anabaena sp Рп-1, Nostoc sp Т-2, Oscillatoria sp T-1.
Определена продуктивность и азотфиксирующая способность выделенных чистых культур цианобактерий. Установлено, что из выделенных штаммов наиболее высокой продуктивностью прироста биомассы на безазотистой среде обладал штамм Anabaena sp Рп-1, коэффициент скорости роста которого был равен 0,24, с выходом сухой биомассы - 3,83гл.
Изучен ростстимулирующий эффект выделенных азотфиксирующих цианобактерий Anabaena sp Рп-1 и Nostoc sp Т-2 на сельскохозяйственные культуры. Установлено, что использование культуры цианобактерии Anabaena sp Рп-1 оказывает положительное действие на качество роста культуры риса и пшеницы (всхожесть, высота побега и длина корневой системы).
Научная новизна исследования: Выделен новый штамм цианобактерий представитель рода Anabaena, перспективный в качестве биоудобрения для сельскохозяйственных растений.
Практическая значимость цианобактерий в агробиотехнологии: Выделенные штаммы цианобактерий могут быть использованы в качестве биоудобрений для сельскохозяйственных растений.
Практическая база: лаборатория биотехнологии НИИ Проблем биологии и биотехнологии КазНУ им.аль-Фараби.
Оценка полноты решения поставленных задач: Все поставленные в научной работе задачи выполнены.
Рекомендации: Использование азотфиксирующей цианобактерии Anabaena sp Рп-1, выделенного из рисовых полей с. Бакбакты Алматинской области при культивировании сельскохозяйственных культур может быть весьма эффективным.
ТҰЖЫРЫМ
Дипломдық жұмыс 61 беттен, 15 cуреттен, 6 кеcтеден, 69 әдебиет көздерінен тұрады.
Зерттеу мақсаты: Агробиотехнологияд а перспективті, азотты түзетін цианобактериялардың белсенді штамдарын оқшаулау және зерттеу.
Зерттеу міндеттері:
Азотты бекітетін цианобактерияларды ң алгологиялық және бактериологиялық таза дақылдарын топырақтан және судан бөліп алу;
Цианобактериялардың оқшауланған штамдарының өнімділігін анықтау;
Ауылшаруашылық өсімдіктеріне цианобактериялар штамдарының өсуін ынталандырушы әсерін анықтау.
Зерттеу объектілері: Nostoc sp T-2; Anabaena sp RP-1; Oscillatoria TI-3
Зерттеу әдістері: микробиологиялық және алгологиялық зерттеудің стандартты әдістері; Әдістемелік нұсқаулықтар: Сиренко Л.А., Гайсина Л.А., Заядан Б.К.
Алынған нәтижелер:
Ұйғыр аймағының ыстық бұлақтарының альгофлорасының және Алматы облысының күріш алқаптарының топырақтарының құрамы зерттеліп, Oscillatoriophycideae класына және көк-жасыл балдырлар тобына жататын Synechococcophycideae класына жататын микробалдырлар мен цианобактериялардың 4 алгологиялық таза дақылдары зерттелді. Барлық зерттелген изоляттар зертханалық жинаққа енгізілді. Оқшауланған микробалдыр штамдарының 3 культурасы бактериологиялық таза түрінде алынды, және морфологиялық және физиологиялық сипаттамалары бойынша Anabaena sp Рп-1, Nostoc sp Т-2, Oscillatoria sp T-1 болып анықталды:
Цианобактериялардың оқшауланған таза дақылдарының өнімділігі мен азотты бекіту қабілеті анықталды. Оқшауланған штамдардан азотсыз ортада биомасса өсуінің ең жоғары өнімділігіне Anabaena sp Рп-1 штаммы ие болды, өсу жылдамдығы 0,24 құрады, құрғақ биомасса өнімділігі 3,83 г л.
Азотты түзетін Anabaena sp Pn-1 және Nostoc sp T-2 цианобактерияларының өсімдіктердің өсуіне ықпал ететін әсері зерттелді. Anabaena sp Pn-1 цианобактерия дақылының қолдануы күріш пен бидай дақылдарының өсу сапасына (өну, өсу биіктігі мен тамырдың ұзындығы) оң әсер ететіні анықталды.
Зерттеудің ғылыми жаңалығы: ауылшаруашылық өсімдіктері үшін биотыңайтқыш ретінде перспективті Anabaena тұқымдасынан цианобактериялардың жаңа штаммы бөлініп алынды.
Агробиотехнологиядағы цианобактериялардың практикалық маңыздылығы: Цианобактериялардың оқшауланған штаммдары ауылшаруашылық өсімдіктері үшін биотыңайтқыш ретінде қолданыла алады.
Практикалық база: әл-Фараби атындағы ҚазҰУ Биология және биотехнология мәселелері ғылыми-зерттеу институтының биотехнология зертханасы.
Міндеттерді шешудің толықтығын бағалау: ғылыми жұмыста қойылған барлық тапсырмалар орындалды.
Ұсыныстар: Күріш егістерінен бөлініп алынған азотты бекітетін Anabaena sp Pn-1 цианобактерия штаммы қолдану дақылдарды өсіруде өте тиімді.
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
9
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
10
1
Обзор литературы
10
1.1
Цианобактерии - как объекты агробиотехнологии
10
1.1.1
Систематическое положение цианобактерий, их морфологическая
характеристика и особенности клеточного строения
10
1.1.2
Распространение, экология и значение цианобактерий
16
1.1.3
Азотфиксирующая активность цианобактерий
18
1.1.4
Биопрепараты на основе цианобактерий
20
1.2
Выделение чистых культур цианобактерий из природных субстратов
23
2
Материалы и методы исследования
29
2.1
Объекты исследования
29
2.2
Методы исследований
29
2.2.1
Определение видового состава микроводорослей
29
2.2.2
Отбор фототрофных микроорганизмов из природных источников и получение альгологически чистых культур
29
2.2.3
Методика получения бактериологическ и чистых культур
микроводорослей
30
2.2.4
Методика культивирования микроводор ослей в лабораторных
условиях
30
2.2.5
Метод определения продуктивности прироста биомассы
33
2.2.6
Методика определения способности к азотфиксации цианобактерий
33
2.2.7
Методика определения ростстимулирую щего эффекта
цианобактерий в отношении злаковых культур
33
2.2.8
Статистические методы
34
3
Результаты исследования и их обсуждение
36
3.1
Выделение продуктивных штаммов микроводорослей, из природных субстратов перспективных для агробиотехнологии
36
3.2
Определение видового состава микров одорослей горячих источников Уйгурского района и выделение альгологически чистых
культур микроводорослей
37
3.3
Получение бактериологически чистых культур выделенных штаммов
микроводорослей
43
3.4
Определение продуктивности и способ ности к азотфиксации
выделенных культур цианобактерий
46
3.5
Изучение ростстимулирующего эффекта азотфиксирующих
цианобактерий на сельскохозяйственные растения
47
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
52
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
53
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. Одной из основных задач земледелия является разработка аспектов к сохранению и увеличению плодородия почвы. Избыточное содержание различных гербицидов и тяжелых металлов в почве приводит к токсическому эффекту и уничтожению существенной части флоры. Для решения этой проблемы перспективными являются группа фотосинтезирующих микроорганизмов - цианобактерии. На данный момент становится ясным положительная экологическая роль цианобактерий в почве в качестве азотфиксаторов и накопителей органического вещества [1].
С точки зрения прикладного использования, цианобактерии технологичны, культивируются на дешевых питательных средах (не требуют органических соединений и источников минерального азота) характеризуются быстрым накоплением биомассы даже в экстенсивных культурах, не требующих дорогого оборудования. Вместе с тем, на общем фоне исследований цианобактерии не достаточно изучены в агробиотехнологии. Поэтому внимание к этой группе микроорганизмов в практическом аспекте сосредоточено на изучении их действия на растения и возможности составления на их основе активных препаратов. В связи с этим поиск и выделение активных штаммов азотфиксирующих цианобактерий представляется актуальным.
Научная новизна исследования: Выделен новый штамм цианобактерий представитель рода Anabaena, перспективный в качестве биоудобрения для сельскохозяйственных растений.
Практическая значимость цианобактерий в агробиотехнологии: Выделенные штаммы цианобактерий могут быть использованы в качестве биоудобрений для сельскохозяйственных растений.
Цель исследования: Выделение и изучение активных штаммов азотфиксирующих цианобактерий, перспективных в агробиотехнологии.
Задачи исследования:
Выделить альгологически и бактериол огически чистые культуры азотфиксирующих цианобактерий из почв и альгобактериальных матов; 2.Определить продуктивность выделенных штаммов цианобактерий; 3.Определить ростстимулирующий эффект выделенных штаммов цианобактерий на сельскохозяйственные растения.
Объект исследования: Nostoc sp Т-2; Anabaena sp Рп-1; Oscillatoria TI-3
Теоретическая и методологическая основа: стандартные микробиологические и альгологические методы исследования; Методические указания Сиренко Л.А., Гайсина Л.А., Заядан Б.К.
Практическая база: лаборатория биотехнологии НИИ Проблем биологии и биотехнологии КазНУ им.аль-Фараби.
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
Обзор литературы
Цианобактерии - как объекты агробиотехнологии
Систематическое положение цианобактерий, их морфологическая характеристика и особенности клеточного строения
Цианобактерии (Cyanoprokaryota) - древняя группа фотосинтезирующих прокариотических организмов, населяющая и наземные экосистемы. Благодаря долгой эволюционной истории, они смогли накопить запас адаптационных свойств, позволивших им освоить практически все типы местообитания, существующие на нашей планете и стать важным компонентом автотрофного блока биосферы [2].
К цианобактериям относится большая группа микроорганизмов, сочетающих прокариотное строение клетки со способностью осуществлять фотосинтез, сопровождающийся выделением O2, что свойственно разным группам водорослей и высших растений. Объединение черт, присущих организмам, относящимся к разным царствам или даже надцарствам живой природы, сделало цианобактерии объектом борьбы за принадлежность к низшим растениям (водорослям) или бактериям (прокариотам) [3].
Систематика цианобактерий была рассмотрена и изучена достаточно много раз. Вопрос о положении цианобактерий (сине-зеленых водорослей) в системе живого мира имеет долгую и противоречивую историю. В течение длительного времени они рассматривались как одна из групп низших растений, поэтому и систематика осуществлялась в соответствии с правилами Международного кодекса ботанической номенклатуры. И только в 60-х гг. XX в., когда было установлено четкое различие между прокариотным и эукариотным типами клеточной организации и на основании этого К. Ван Нилем и Р. Стейниером сформулировано определение бактерий как организмов, имеющих прокариотное строение клетки, встал вопрос о пересмотре положения цианобактерий в системе живых организмов. Эта систематика вызвала негативную реакцию у многих научных деятелей, для которых было важным фундаментальные различия в систематике бактерий и растений, так как бактерии основывались на свойствах культуральных штаммов, а растения являлись материалом, взятым непосредственно из природы [4].
Наиболее разработанными и изученными системами цианобактерий, основанными на морфолого - онтогенетическом уровне были системы Л. Гейтлера и А.А. Еленкина [5].
В конце 80-х годов И. Комарёк и К. Анагностидис предложили свой вариант систематики цианобактерий, в котором совместно с морфологическими признаками использовали физиолого - биохимиче ские, цитологические и молекулярно - биологические аспекты. Исследователи предложили назвать отдел Cyanoprokaryota Komarek et Anagnos tidis и разделили его на 4 порядк а: Chroococcales (все одноклеточные формы), Oscillatoriales (нитчатые формы),
Nostocales (одноядерные гетероцитные формы) и Stigonematales (многорядные гетероцитные формы) (Рисунок 1) [6].
1 - общий вид; 2 - вид при малом увеличении микроскопа; 3 - отдельная нить при большом увеличении; 4 - гетероцисты анабены.
выход данной картины (Кондратьева Н.В. 1995)
Рисунок 1. Цианобактерии (Суаnophyta): А - Осциллатория (Oscillatoria); Б - Носток (Nostoc); В - Анабена (Аnabaena); Г - Лингбия (Lyngbуа); Д - Ривулярия (Rivularia); Е - глеокапса (Gleосарsа); Ж - хроококк (Chroococcus)
На данное время цианобактерии рассматриваются как самостоятельный отдел, и подразделяется на 5 групп: в 1-ю и 2-ю группу входят одноклеточные формы, клетки одиночные или образуют колонии, которые удерживаются за счет дополнительных слоев клеточной оболочки, а представители 3-5-й групп характеризуются как нитчатые формы. Предложенная система учитывает морфологические, культуральные, физиолого - биохимические и молекулярно- биологические [7].
Цианобактерии -- морфологически разнообразная группа грамотрицательных эубактерий, включающая одноклеточные, колониальные и многоклеточные формы. У последних единицей структуры служит нить (трихом). Нити бывают простые или ветвящиеся. Простые нити состоят из одного ряда клеток (однорядные трихомы),
имеющих одинаковые размеры, форму и строение, или клеток, различающихся по этим параметрам [8].
Ветвящиеся трихомы возникают в результате разных причин, в связи с чем различают ложное и истинное ветвление. К истинному ветвлению приводит способность клеток трихома делиться в разных плоскостях, в результате чего возникают многорядные трихомы или однорядные нити с однорядными же боковыми ветвями. Ложное ветвление трихомов не связано с особенностями деления клеток внутри нити, а есть результат прикрепления или соединения разных нитей под углом друг к другу [9].
Поскольку цианобактерии являются прокариотическими организмами, они не имеют клеточного ядра, хроматофоров, митохондрий, элементов эндоплазматической сети и вакуолей с клеточным соком. Клетку цианобактерий окружает четырехслойная клеточная стенка, включающая в себя мембрану. Стенка в основном состоит из пектиновых веществ и слизистых полисахаридов, целлюлоза в небольшом количестве. У многих цианобактерий поверх клеточных стенок находятся еще и слизистые слои, причем единая слизистая оболочка часто покрывает несколько клеток.
Клетки этих организмов могут быть окрашены различно в зависимости от соотношения пигментов: хлорофилла а и d (зеленые), каротиноидов (желтые, оранжевые), фикоцианина (синие) , фикоэритрина (красные) . В их цитоплазме находятся включения запасных питательных веществ, а также газовые вакуоли, или псевдовакуоли, - полости, заполненные газом в форме сот у планктонных форм. В периферической цитоплазме расположены одиночные тилакоиды, несущие пигменты. У нитчатых форм образуются специфические клетки - гетероцисты. Эти клетки крупнее остальных и имеют двойную оболочку. Они содержат фермент нитрогеназу, который играет важную роль в фиксации атмосферного азота [10]. В таблице 1 приведена характеристика некоторых видов цианобактерий.
Комплекс фотосинтетических пигментов представлен хлорофиллом а, каротиноидами и фикобилипротеидами, хлорофилл б отсутствует. Хлоропластов не имеют, крахмал не образуется. Продукт ассимиляции - гликогеноподобный полисахарид. В их клетках снаружи располагается четырехслойная клеточная стенка, в составе которой имеется муреин, который состоит из аминосахаров и аминокислот.
У большинства цианобактерий поверх клеточных стенок находятся слизистые слои, которые могут быть плотными и толстыми и образуют чехлы или капсулы, или же слизь представлена в виде тонкого жидкого слоя. Она предохраняет клетки от высыхания, участвует в движении. Размножаются цианобактерии вегетативным и бесполым способами путем деления клеток пополам. Половое размножение не установлено [10].
Таблица 1.
Характеристика представителей отдела Cyanophyta
Таксономия
Краткая характеристика
Микрофотография
(Увеличение х100)
Отдел Cyanophyta Класс
Hormogoniophyceae
Порядок Nostocales Род Nostocaceae Вид
Nostoc calsicola S- 2
Клетки дифференцированы по форме и функциям. Исключительно колониальные организмы, с хорошо развитой слизью, влияющей на форму колоний. Трихомы гетероцитные, однорядные, неразветвленные, с влагалищами или без них.
Отдел
Трихомы мягкие,
Cyanophyta
слизистые, прямые лил
Класс
слегка изогнуые, иногда
Hormogoniophyceae
одиночные, 3,5-4 мкм
Порядок
ширина, без влагалищ.
Nostocales
Клетки почти квадратные.
Род
Гетероцисты округло -
Anabaenaceae
эллипсоидные до
Вид
цилиндрических. С гладкой
Anabaena sp T- 1
бесцветной оболочкой,
располагаются рядом.
Отдел
Трихомы прямые
Cyanophyta
палочковидные, с
Класс
закругленными концами,
Hormogoniophyceae
окружены слизистым
Порядок
чехлом, клетки
Chroococcales
низкоцилиндрические
Род
плотно примыкают друг
Spirulinaceae
другу.
Вид
Spirulina
labyrinthiformus L- 2
Продолжение таблицы 1
1
2
3
Отдел
Дерновинки темно-сине-
Cyanophyta
зеленые. Трихомы прямые,
Класс
3,5- 5,6 мкм ширина, сине-
Hormogoniophyceae
зеленые к концам суженные
Порядок
и крючкообразно изогнутее,
Oscillatorales
с хорошо выраженными
Род
грануляциями, которые
Oscillatoraceae
могут отсутствовать.
Вид
Oscillatoria tenuis T- 1
Отдел
Округлые клетки с толстой
Cyanophyta
слоистой оболочкой. В
Класс
результате ряда делений
Chroococcophyceae
возникает сложная система
Род
вставленных друг в друга
Gleocapsa
слизистых оболочек или
Вид
слизистых пузырей,
Gleocapsa turgida
заключающих клетки.
Отдел
Близка к осциллатории, но
Cyanophyta
имеет плотное трубчатое
Класс
влагалище или чехол, в
Hormogoniophyceae
который заключена нить. Не
Порядок
имеет гормогонии. Широко
Oscillatoriales
распространена в водоемах
Род
различного типа.
Lyngbya
У некоторых представителей цианобактерий образуются специализированные клетки - гетероцисты и споры (акинеты). Они имеют утолщенную оболочку с сетчатой внутренней структурой без газовых вакуолей. Гетероцисты обычно неспособны к росту и делению и со временем отмирают, их единственная функция
- фиксация атмосферного азота. Гетероцисты могут располагаться на концах трихомов, у их основания, между вегетативными клетками и иногда сбоку.
Акинеты - покоящиеся споры с утолщенной оболочкой и большим количеством запасных питательных веществ (Рисунок 2). Обычно это более крупные, чем вегетативные клетки. Их образуют многие нитчатые цианобактерии. Споры могут выдерживать высыхание и затем прорастают каждая в новую особь, освобождающуюся через разрыв стенки.
а) б)
а - общий вид, б - фрагмент нити
вход данной картины (Кондратьева Н.В. 1995) Рисунок 2. Anabaena: 1) акинета 2) гетероциста
В условиях умеренного климата некоторые планктонные цианобактерии при похолодании образуют акинеты, которые опускаются на дно водоемов, где перезимовывают, а весной прорастают, и молодые, снабженные газовыми везикулами клетки, всплывают к поверхности водоема, к свету. Таким образом, акинеты - не только средство перезимовки, они предназначены для сохранения организма в различных неблагоприятных условиях [11-15].
Клетки цианобактерий мелкие, цилиндрические, округлые. В клетках окруженная оболочкой цитоплазма лишена вакуолей с клеточным соком, окрашена в периферических частях (хромотоплазма) и бесцветная в центре (центроплазма). В хромотоплазме содержатся пигменты. Различное соотношение пигментов обуславливает окраску цианобактерий. В центроплазме располагается ДНК, в отличие от эукариот она не ограничена ядерной оболочкой. Запасные вещества представлены цианофициновым крахмалом, цианофициновыми гранулами, полиэдральными тельцами, гликогеном, валютином. Клетки содержат псевдовакуоли - газовые вакуоли, мембрана которых состоит только из белка, они наполнены газом. Снаружи от цитоплазматической мембраны находится клеточная стенка, которая состоит из четырех четко разграниченных слоев. Один из слоев состоит из муреина - вещество, определяющее прочность стенки. У многих цианобактерий поверх клеточных стенок находятся слизистые слои, образуют капсулы или чехлы, предохраняют клетки от высыхания [16].
Распространение, экология и значение цианобактерий
Цианобактерии - уникальная группа древнейших микроорганизмов. Древность происхождения цианобактерий, их приспособленность к экстремальным условиям среды и способность вступать в симбиотические отношения с другими организмами дала им возможность создавать сообщества, способные выполнять функции многоклеточных организмов.
Живут цианобактерии главным образом в пресных водоемах, являясь пищей для водных животных. Входят в состав планктона, бентоса, живут на поверхности почвы. Они основные и постоянные обитатели скал, пещер, пустынь, арктических грунтов. Цианобактерии являются первыми поселенцами на вулканических и антропогенных субстратах [17].
Большинство азотфиксирующих цианобактерий встречается во всех почвенно - климатических зонах - от тундры до пустыни [18].
Способность цианобактерий входить в симбиотические отношения с различными видами флоры и фауны зависят биологическая активность и физиологическое состояние цианобактерий, проявляющиеся в темпах роста и интенсивности накопления азота и органического вещества [19].
К цианобактериям относят около 2000 видов, распространенных во влажной почве, в поверхностных слоях морских и пресных водоемов. Они могут жить на голых скалах и в пустынях, в горячих источниках при температуре 85 º С и в замерзших озерах подо льдом толщиной 5 м. Они первыми поселяются на: пожарищах, вулканических островах т.д. Цианобактерии часто образуют скопления в виде кустиков, корки или плотной массы, площадь которой может достигать нескольких сотен квадратных метров и до 1 м толщиной. Колонии и нити образуются после того, как клетки цианобактерий поделились, но не разошлись,
поскольку оболочка покрыта слизью. Цианобактерии часто вступают во взаимовыгодное сосуществование с водорослями, мхами, папоротниками, грибами и животными. Распространению многих цианобактерий способствует на то, что они способны образовывать устойчивые к высыханию споры. Итак, основными условиями, обеспечивающими распространение цианобактерий является наличие в среде обитания света и воды для фотосинтеза, кислорода для дыхания и молекулярного азота для азотфиксации [20].
Цианобактерии - древнейшие организмы среди способных выделять кислород. Именно они способствовали повышению в первоначальной атмосфере содержания кислорода, что сделало возможным существование на планете грибов, растений и животных. Отмирая, они участвуют в создании горных пород и почв. Однако цианобактерии могут наносить природе и человеку большие убытки. Так, массовое скопление цианобактерий вместе с микроскопическими водорослями у поверхности воды приводит к цветение. При этом вода окрашивается в сине- зеленый или коричневый цвет и приобретает болотного запаха, вызванного процессами гниения. В воде появляются ядовитые вещества, уменьшается количество кислорода, вследствие чего гибнет рыба и другие водные обитатели.
Цветение воды сейчас является настоящей экологической проблемой, поскольку в водоемы попадает все больше стоков, вредных веществ с полей и т.п. Меры известны: нельзя строить неподалеку от рек и озер склады минеральных удобрений и ядохимикатов, мыть в водоемах машины, скашивать тростник и т.п. Некоторые цианобактерии человек употребляет в пищу. Например, носток потребляют в Китае и Японии, а спирулину - местное население в районе озера Чад Африке. Из спирулины получают пищевой белок (спирулина), который используют как дополнение к еде. На плантациях риса цианобактерии используют как удобрение благодаря способности их к азотфиксации (например анабена в сосуществовании с папоротником азолов). Итак, в природе и в жизни человека цианобактерии имеют как положительное, так и отрицательное значение.
В природе азотфиксирующие бактерии и водоросли по-разному приспособились защищать свой главный фермент от кислорода. У анаэробных бактерий этой проблемы не существует. Обитая в глубоких слоях почвы, они могут жить только в бескислородных условиях [21-24].
Цианобактерии имеют специализированные толстые клетки, которые содержат особое вещество, препятствующее проникновению кислорода. Сходная защита возникла у аэробных (живущих в кислородных условиях) бактерий, у которых кислород при поступлении в клетку восстанавливается до воды.
Бобовые растения вместе с симбиотическими бактериями также выработали интересную защитную систему от кислорода, улавливаемого прежде, чем он достигнет клетки. Его "подстерегает" особый белок - гемоглобин, синтезируемый в корневых клубеньках. Подобно гемоглобину животных, этот белок способен связывать кислород и отдавать его при необходимости. Возможно, такая высокая
чувствительность нитрогеназы к кислороду, а также потребность в большом количестве энергии для ее работы является причиной того, что в природе не так уж много организмов, способных осуществлять биологическую фиксацию азота [25].
Значение цианобактерий:
Являются первичными продуцентами органического вещества в воде и почве.
Насыщают воду и атмосферу кислородом.
Участвуют в почвообразовании, в фиксации атмосферного азота.
Используются в качестве экологически чистого удобрения на рисовых полях (анабена).
Образуют много белка и биологически активных веществ (витаминов), поэтому используются для изготовления лекарственных препаратов (спирулина).
Вызывают цветение водоемов, продуцируют сильные нейротоксические яды, в результате чего вода становится непригодной для питья.
Азотфиксирующая активность цианобактерий
Азот - это элемент, который без преувеличения играет главнейшую роль в жизни на нашей планете. В молекулярной форме он занимает 78% объема земной атмосферы. В различных объектах биосферы содержится более 151 млрд. т азота, в том числе в органических соединениях почвенного покрова 150 млрд. т, в биомассе растений - 1.1 млрд. т, в биомассе животных - 61 млн.т.
Азот необходим всем живым организмам для синтеза азотсодержащих строительных блоков - аминокислот, из которых образуются белки и нуклеиновые кислоты. Поэтому его часто называют органогеном. Содержание азота в организме взрослого человека составляет около 3% от массы тела. Среди соединений азота немало токсичных для организма: окись азота, нитраты, нитриты, нитрозамины, аммиак и другие соединения.
Весь азот, входящий в состав живых организмов планеты практически является результатом биологической азотфиксации. Азотфиксация связана с активностью ферментного комплекса нитрогеназы. При этом происходит восстановление азота до аммиака, затем образуются азотсодержащие органические молекулы. Это восстановительный процесс в присутствии молекулярного кислорода нитрогеназа инактивируется. Цианобактерии живут в присутствии молекулярного кислорода, более того, они его образуют.
Азот в почвах - единственный из биофильных элементов, который исходно отсутствует в материнских горных породах и появляется только в результате деятельности бактерийдиазотрофов. Высокая подвижность всех природных соединений азота и большая скорость метаболизма являются основными причинами отсутствия заметных скоплений азота в природе (в виде минералов и руд).
Азот в почву поступает с атмосферными осадками, остатками животных и растений, минеральными и органическими удобрениями. Важным источником
пополнения азотного фонда почвы является азотфиксация свободноживущими микроорганизмами и клубеньковыми бактериями [26-31].
Цианобактерии являются уникальными организмами, так как они наряду с микроводорослями первичные продуценты органического вещества в почве. Количество его зависит от численности клеток, биомассы и скорости репродукции. Проблема биологической фиксации азота как одна из важных и интересных проблем современной биологии имеет значение в двух аспектах. С одной стороны, азотфиксация составляет один из резервов повышения почвенного плодородия; с другой стороны расшифровка механизма азотфиксации у микроорганизмов откроет
возможность искусственного воспроизведения этого процесса [32].
Несколько работ были посвящены изучению азотфиксации у цианобактерий. Было доказано, что бактериологический чистые культуры цианобактерии способны использовать молекулярный азот.
Исследования чистых культур цианобактерий позволило не только расширить список азотфиксаторов, но и выяснить основные условия азотфиксации у цианобактерий, интенсивность этого процесса и его связь с другими физиологическими функциями [33].
Фиксация молекулярного азота -- один из процессов, определяющих биологическую продуктивность на нашей планете, в связи с чем его изучение отнесено к числу первостепенных задач современной биологии. Круговорот азота в природе является одним из ключевых звеньев биогеохимических циклов Земли, атмосфера которой почти на 80% (по объему) состоит из этого химического элемента и служит его основным источником. Азот входит в состав протеинов, а также других молекул, составляющих основу структурной организации всех уровней живого. Человеку и животным он необходим в виде протеинов животного и растительного происхождения, растениям -- солей азотной кислоты и ионов аммония [34].
Разделение азотфиксаторов на ассоциативные и свободно живущие условно, поскольку способность к свободному обитанию в почве характерна для всех азотфиксирующих бактерий, при этом только симбиотические азотфиксаторы способны ассимилировать молекулярный азот исключительно в тесном взаимодействии с растениями. Связи цианобактерий с другими организмами достаточно разнообразны: они являются фикобионтами в лишайниках, живут в воздушных камерах мхов, в листьях водных папоротников и т. д. Следует отметить, что потенциальные возможности симбиотических азотфиксаторов значительно выше, чем свободноживущих. Симбиотические и ассоциативные системы растений и диазотрофов могут служить примером эволюционно сложившегося специфического взаимодействия живых организмов, изучение которых приобретает особую актуальность в связи с внедрением высокопродуктивного и экологически чистого земледелия. Фиксация молекулярного азота воздуха биологическим путем -- процесс связывания и усваивания азота
микроорганизмами. Он имеет большое практическое значение, поскольку промышленное производство химических азотных удобрений требует значительных затрат энергоресурсов, а сами по себе они могут быть вредны с точки зрения экологии. Всестороннее изучение этой проблемы обусловлено также необходимостью разработки новых эффективных биологических препаратов [35- 37].
Цианобактерии, фиксируя атмосферный азот, играют большую роль в повышении плодородия почвы. Перспективность применения азотфиксирующих цианобактерий в земледелии связана с их участием в круговороте азота, который существенно влияет на урожайность высших растений [38].
Цианобактерии участвуют в накоплении азота косвенно - через стимуляцию азотфиксирующих и олигонитрофильных бактерий и как фиксаторы элементарного азота [38].
Увеличение азота в почве наблюдается в основном за счет деятельности гетероцистных форм цианобактерий, развивающихся на поверхности почвы. Цианобактерии секретируются до 40% продуктов азотфиксации и до 30% от фиксированного углерода. Следовательно, накопление азота в почве происходит в результате деятельности азотфиксирующего комплекса, в котором ведущую роль играют цианобактерии [39].
Другие аспекты влияния цианобактерий на агроэкологическое благополучие почв не менее значимы. Среди них защита поверхностного слоя почвы от ветровой эрозии; удерживание влаги в почве, улучшающее водный режим почв в засушливое время; восстановление нарушенных почв.
Биопрепараты на основе цианобактерий
В агробиотехнологическом плане интересна азотфиксирующая способность цианобактерий. Наличие доступных форм органического вещества в почве никогда не лимитирует азотфиксацию у цианобактерий, обладающих собственным механизмом фотосинтеза [41].
Цианобактерии обладают агрономически значимой азотфиксацией и являются первичными продуцентами органического вещества.
Известно, что цианобактерии являются продуцентами большинства физиологически активных веществ (ФАВ), действующих на растения как положительно, так и в некоторых случаях отрицательно [42].
Применение цианобактерий в агробиотехнологии (АБТ) успешно реализуется на рисовых полях, обогащение почвы азотом для эффективного роста растений, площади листьев и урожайности сельскохозяйственных растений [43].
Однако, имеется ряд работ, в которых показано, что азотфиксирующие цианобактерии могут решить проблемы структуризации плодородия почв и соответственно, увеличить урожайность сельскохозяйственных растений. Таким образом, инокуляция пшеницы культурами цианобактерий усиливает адаптацию
растений к засолению, обеспечивая растение естественным азотом и фитогормонами [44].
Еще один вариант использования биомассы водных цианобактерий - крупномасштабное производство возобновляемых источников энергии в виде биогаза и важных биопродуктов [45].
Помимо всего этого цианобактерии являются выгодными в энергетическом отрасли, так как они автономны (из- за наличия фотосинтеза и азотфиксации) и не зависят от присутствия органического вещества в почве. Также обладают повышенной симбиотической активностью. И особо внимание привлекает их чрезвычайная устойчивость к факторам окружающей сред, следствием которой может явиться возможность использования биопрепаратов на основе цианобактерий во всех почвенно - климатических зонах [46].
Много отрицательных последствий имеет и такой процесс как химизация защиты растений. Накопление пестицидов в окружающей среде - сильный фактор риска для благополучия человечества. Поэтому нужны альтернативные, экологически безопасные средства повышения плодородия почвы и защиты растений от инфекций и вредителей. В этом плане большой интерес представляют биопрепараты на основе бактерий - азотфиксаторов и микробов - антагонистов [47].
Производство микробных препаратов может являться мощным прогрессом в промышленности и в сельском хозяйстве, а применение их - неотъемлемой частью высокоразвитого и экономичного земледелия.
В мировой практике применяются биопрепараты на основе цианобактерий. Например, в США применяется биопрепарат Майкроп, использование которого повышает урожай кукурузы; при применении препарата Плантере сойл инокулант (свободноживущие азотфиксаторы и цианобактерии) сбор пшеницы увеличился на 0,05- 0,51 тга.
Создание искусственных микробных ассоциаций, обладающих экологической поливалентностью, является одним из перспективных направлений в разработке эффективных биопрепаратов. Интерес к изучению микробных ассоциаций обусловлен тем, что одновидовые системы, как и монокультуры в сельском хозяйстве, неустойчивы по своей природе, поскольку в условиях стрессов уязвимы для возбудителей болезней и других факторов, оказывающих влияние на их функционирование в агроценозах.
Из цианобактерий были получены и внедрены в медицинскую практику новые цитостатики - апратоксин, ауридил, гектохлорин и лингбиябеллин. Цианобактерии разных видов продуцируют широкий набор эффективных антибиотиков, так называемых цианобактеринов. Носткарболин, выделенный из цианобактерий, сопоставим с эффективностью галантамина при лечении болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний.
При разработке новых препаратов необходимо уделять внимание не только селекции или подбору штаммов микроорганизмов, но и усовершенствованию технологий их изготовления, применения и хранения [48-50].
Создание и применение биопрепаратов на основе азотфиксирующих микроорганизмов -- наиболее эффективный прием повышения продуктивности растений и качества их урожая, позволяющий сохранять естественное плодородие почв и экологическое равновесие окружающей среды. Их использование дает возможность регулировать численность и активность полезной микрофлоры в ризосфере возделываемых культур, а также обеспечивать растения азотом, фиксированным из атмосферы [51].
Перечень биотехнологических продуктов -- микробных препаратов для растениеводства за последние десятилетия значительно расширился и включает препараты, созданные на основе свободноживущих, ассоциативных, симбиотрофных азотфиксирующих и фосфатмобилизирующих бактерий, а также препаратов бинарного действия, получаемых в результате сочетания различных микроорганизмов.
Одним из перспективных объектов биотехнологии являются цианобактерии благодаря их способности к фотосинтезу, азотфиксации, синтезу комплекса биологически активных и рост активирующих веществ, положительно влияющих на плодородие почв и активность почвенной биоты [52].
Основные преимущества цианобактерий как объектов агробиотехнологии:
Цианобактерии - интересный объект для агробиотехнологии благодаря способности усваивать молекулярный азот и углекислый газ, что удешевляет производство в накоплении их биомассы.
Цианобактерии - неотъемлемая часть микробного населения почвы. Поэтому их введение в агробиоценоз не представляют экологической опасности.
Цианобактерии отличаются адаптационными свойствами в микробоценозе и в экстремальных условиях. Значит, они способны защитить организмы, находящиеся с ними в консортивной связи.
Положительное действие цианобактерии на плодородие почвы и на растение: азотфиксация, фотосинтез, санитарный эффект.
Цианобактерии могут легко входить во взаимоотношение с различной микрофлорой.
Также создание консорциумов на основе цианобактерий могут быть использованы не только в агробиотехнологии, но и к примеру для ремедиации почвы после загрязнения (нефть, полютанты, добыча полезных ископаемых).
Таким образом, азотфиксирующие цианобактерии и создание консорциумов на их основе - перспективное направление в развитии биотехнологии.
Выделение чистых культур цианобактерий из природных субстратов Выделение микроводорослей в культуру с помощью традиционных методов является хорошо изученной процедурой. Выбор подходящей среды является важным условием для успешного культивирования водорослей. Часто первым шагом на пути к успешной изоляции водорослей из их природной среды являются комплексные данные об их среде обитания. Для успешного культивирования необходимы и знания таксономии. Для выращивания диатомовых водорослей необходим кремний, эвгленовых - аммоний, некоторые виды нуждаются в селене. Миксотрофные виды нуждаются в добавление источников питания для бактерий,
бесцветные фаготрофы могут требовать эукариотических источников питания.
При культивировании нужно учитывать уничтожение загрязнителей, особенно тех, которые могут конкурировать с нужным видом. Среди методов выделения водорослей наиболее распространенными являются изоляция с помощью разведения, изоляция отдельных клеток с помощью микропипеток, изоляция при помощи агара и др. Иногда желаемый вид растет на начальных стадиях изоляции, но потом погибает после нескольких пересевов на свежую среду. Это является показателем того, что питательная среда лишена специфических элементов или органических веществ, недостаток которых сразу не проявляется. Организм может подавляться отходами жизнедеятельности, что отравляет его среду обитания, приводя к гибели. В природе эти отходы обычно нейтрализуются другими организмами [53].
Для сохранения водорослей в течение длительного времени в живом состоянии следует брать их в банки в небольшом количестве. Если же материала было взято много, то пробу нужно разлить на стеклянные невысокие и широкие сосуды для обеспечения большей поверхности соприкосновения с воздухом [53].
Отбор образцов для видового анализа и количественного учета водорослей и цианобактерий проводили по общепринятым методикам почвенной альгологии с глубины 0 - 5 см для изучения внутрипочвенных группировок фототрофов и пленки толщиной 0 - 2 мм при цветении почвы (Голлербах, Штина, 1969). Масса почвенных образцов из каждой зоны составляла не менее 1 кг. В дальнейшем для количественного анализа отбирали средние пробы по 10 г и фиксировали 4 % раствором формалина. Обычно в умеренной зоне отбор почвенных образцов для проведения альгологического анализа проводится в мае - октябре до выпадения снега. Наличие в последние годы аномально высокой температуры в зимний период позволяет легко проводить отбор почвенных образцов для выявления особенностей развития фототрофов в это время. Так, наше исследование было выполнено в конце ноября в условиях аномально теплой и бесснежной погоды, когда почва не промерзала очень долго [54] .
Для решения ряда вопросов, связанных с идентификацией, изучением физиологических и биохимических особенностей цианобактерий, исследованием их взаимоотношений с другими микроорганизмами необходимы культуры,
свободные от сопутствующей микрофлоры. Правила бактериологического кода также предусматривает, что любая культура должна быть освобождена от микроорганизмов другого вида.
Сложность получения аксеничных культур и отсутствие общепринятых методов долго не позволяли получить культуры цианобактерий в этом состоянии.
Основная трудность, с которой сталкиваются исследователи при очистке культур, связана с наличием мощных слизистых влагалищ и чехлов, диаметр которых может многократно превышать размеры самих клеток цианобактерий.
Получение каждого аксеничного штамма цианобактерий, практически каждый раз происходит по оригинальной методике, предложенной тем или другим автором. Важным моментом, обеспечивающим хороший рост водорослей в культурах,
является правильный сбор материала и подготовка его для посева.
Основные положения этого этапа работы можно свести к следующему. Сбор полевых образцов для последующего выделения из них культуры водорослей проводят в природе в период активной вегетации вида. Образцы воды, комочки грунта стараются отобрать в том месте, где интересующий организм представлен в максимальной численности и состоянии высокой жизненной активности.
Собранный материал в виде дерновинок, пленок, тины следует сразу же очистить. Как указывает К.А.Гусева, пробы необходимо отбирать там, где меньше всего сказывается влияние берега или каких- либо загрязнений. Не рекомендуется отбирать пробы в местах нагона планктона в водоеме, поскольку здесь обычно имеется большое количество отмерших водорослей и много бактерий [55].
Образец воды собирают в чистый (стерильный) флакон. Его заполняют водой не больше чем на 23 объема, закрывают пробкой (ватой, марлей). Флакон с образцом выдерживают при рассеянном освещении и ... продолжение
Вы можете абсолютно на бесплатной основе полностью просмотреть эту работу через наше приложение.
Джалолов Д.
Выделение чистых культур почвенных азотфиксирующих цианобактерий, перспективных для агробиотехнологии
ДИПЛОМНАЯ РАБОТА
Специальность 5B070100 - Биотехнология
Aлмaты 2020
Министерство образования и науки Республики Казахстан Казахский Национальный Университет имени аль-Фараби
Кафедра биотехнологии
Допущено к защите:
Заведующий кафедрой биотехнологии, к.б.н., доцент Киcтаубаева А.C.
ДИПЛОМНАЯ РАБОТА
Тема: ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР ПОЧВЕННЫХ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ, ПЕРСПЕКТИВНЫХ ДЛЯ АГРОБИОТЕХНОЛОГИИ
Выполнил: студент 4 курса
Джалолов Д.
Научный руководитель:
к.б.н., доцент
Садвакасова А.К.
Норма контролер: преподователь
Бектилеуова Н.К.
Aлмaты 2020
РЕЗЮМЕ
Дипломная работа cоcтоит из 61 cтраниц, 15 риcунков, 6 таблиц, 69 иcпользованных иcточников литературы.
Цель исследования: Выделение и изуч ение активных штаммов азотфиксирующих цианобактерий, перспективных в агробиотехнологии.
Задачи исследования:
1.Выделить альгологически и бактери ологически чистые культуры азотфиксирующих цианобактерий из почв и альгобактериальных матов; 2.Определить продуктивность и способность к азотфиксации у выделенных штаммов цианобактерий;
Определить ростстимулирующий эффект выделенных штаммов цианобактерий на сельскохозяйственные растения.
Объект исследования: Nostoc sp Т-2; Anabaena sp Рп-1; Oscillatoria TI-3
Методы исследований: стандартные микробиологические и альгологические методы исследования; Методические указания Сиренко Л.А., Гайсина Л.А., Заядан Б.К.
Полученные результаты:
Изучен видовой состав альгофлоры горячих источников Уйгурского района и почвы рисовых полей Алматинской области и выделены 4 альгологически чистых культур микроводорослей и цианобактерий относящихся к классу Oscillatoriophycideae и к классу Synechococcophycideae отдела сине - зеленых водорослей и к классу Chlorophyceae отдела зеленых микроводорослей. Все исследованные изоляты были введены в состав коллекции лаборатории. Получены бактериологически чистыми и идентифицированы по культурально- морфологическим и физиологическим признакам 3 культуры выделенных штаммов микроводорослей: Anabaena sp Рп-1, Nostoc sp Т-2, Oscillatoria sp T-1.
Определена продуктивность и азотфиксирующая способность выделенных чистых культур цианобактерий. Установлено, что из выделенных штаммов наиболее высокой продуктивностью прироста биомассы на безазотистой среде обладал штамм Anabaena sp Рп-1, коэффициент скорости роста которого был равен 0,24, с выходом сухой биомассы - 3,83гл.
Изучен ростстимулирующий эффект выделенных азотфиксирующих цианобактерий Anabaena sp Рп-1 и Nostoc sp Т-2 на сельскохозяйственные культуры. Установлено, что использование культуры цианобактерии Anabaena sp Рп-1 оказывает положительное действие на качество роста культуры риса и пшеницы (всхожесть, высота побега и длина корневой системы).
Научная новизна исследования: Выделен новый штамм цианобактерий представитель рода Anabaena, перспективный в качестве биоудобрения для сельскохозяйственных растений.
Практическая значимость цианобактерий в агробиотехнологии: Выделенные штаммы цианобактерий могут быть использованы в качестве биоудобрений для сельскохозяйственных растений.
Практическая база: лаборатория биотехнологии НИИ Проблем биологии и биотехнологии КазНУ им.аль-Фараби.
Оценка полноты решения поставленных задач: Все поставленные в научной работе задачи выполнены.
Рекомендации: Использование азотфиксирующей цианобактерии Anabaena sp Рп-1, выделенного из рисовых полей с. Бакбакты Алматинской области при культивировании сельскохозяйственных культур может быть весьма эффективным.
ТҰЖЫРЫМ
Дипломдық жұмыс 61 беттен, 15 cуреттен, 6 кеcтеден, 69 әдебиет көздерінен тұрады.
Зерттеу мақсаты: Агробиотехнологияд а перспективті, азотты түзетін цианобактериялардың белсенді штамдарын оқшаулау және зерттеу.
Зерттеу міндеттері:
Азотты бекітетін цианобактерияларды ң алгологиялық және бактериологиялық таза дақылдарын топырақтан және судан бөліп алу;
Цианобактериялардың оқшауланған штамдарының өнімділігін анықтау;
Ауылшаруашылық өсімдіктеріне цианобактериялар штамдарының өсуін ынталандырушы әсерін анықтау.
Зерттеу объектілері: Nostoc sp T-2; Anabaena sp RP-1; Oscillatoria TI-3
Зерттеу әдістері: микробиологиялық және алгологиялық зерттеудің стандартты әдістері; Әдістемелік нұсқаулықтар: Сиренко Л.А., Гайсина Л.А., Заядан Б.К.
Алынған нәтижелер:
Ұйғыр аймағының ыстық бұлақтарының альгофлорасының және Алматы облысының күріш алқаптарының топырақтарының құрамы зерттеліп, Oscillatoriophycideae класына және көк-жасыл балдырлар тобына жататын Synechococcophycideae класына жататын микробалдырлар мен цианобактериялардың 4 алгологиялық таза дақылдары зерттелді. Барлық зерттелген изоляттар зертханалық жинаққа енгізілді. Оқшауланған микробалдыр штамдарының 3 культурасы бактериологиялық таза түрінде алынды, және морфологиялық және физиологиялық сипаттамалары бойынша Anabaena sp Рп-1, Nostoc sp Т-2, Oscillatoria sp T-1 болып анықталды:
Цианобактериялардың оқшауланған таза дақылдарының өнімділігі мен азотты бекіту қабілеті анықталды. Оқшауланған штамдардан азотсыз ортада биомасса өсуінің ең жоғары өнімділігіне Anabaena sp Рп-1 штаммы ие болды, өсу жылдамдығы 0,24 құрады, құрғақ биомасса өнімділігі 3,83 г л.
Азотты түзетін Anabaena sp Pn-1 және Nostoc sp T-2 цианобактерияларының өсімдіктердің өсуіне ықпал ететін әсері зерттелді. Anabaena sp Pn-1 цианобактерия дақылының қолдануы күріш пен бидай дақылдарының өсу сапасына (өну, өсу биіктігі мен тамырдың ұзындығы) оң әсер ететіні анықталды.
Зерттеудің ғылыми жаңалығы: ауылшаруашылық өсімдіктері үшін биотыңайтқыш ретінде перспективті Anabaena тұқымдасынан цианобактериялардың жаңа штаммы бөлініп алынды.
Агробиотехнологиядағы цианобактериялардың практикалық маңыздылығы: Цианобактериялардың оқшауланған штаммдары ауылшаруашылық өсімдіктері үшін биотыңайтқыш ретінде қолданыла алады.
Практикалық база: әл-Фараби атындағы ҚазҰУ Биология және биотехнология мәселелері ғылыми-зерттеу институтының биотехнология зертханасы.
Міндеттерді шешудің толықтығын бағалау: ғылыми жұмыста қойылған барлық тапсырмалар орындалды.
Ұсыныстар: Күріш егістерінен бөлініп алынған азотты бекітетін Anabaena sp Pn-1 цианобактерия штаммы қолдану дақылдарды өсіруде өте тиімді.
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
9
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
10
1
Обзор литературы
10
1.1
Цианобактерии - как объекты агробиотехнологии
10
1.1.1
Систематическое положение цианобактерий, их морфологическая
характеристика и особенности клеточного строения
10
1.1.2
Распространение, экология и значение цианобактерий
16
1.1.3
Азотфиксирующая активность цианобактерий
18
1.1.4
Биопрепараты на основе цианобактерий
20
1.2
Выделение чистых культур цианобактерий из природных субстратов
23
2
Материалы и методы исследования
29
2.1
Объекты исследования
29
2.2
Методы исследований
29
2.2.1
Определение видового состава микроводорослей
29
2.2.2
Отбор фототрофных микроорганизмов из природных источников и получение альгологически чистых культур
29
2.2.3
Методика получения бактериологическ и чистых культур
микроводорослей
30
2.2.4
Методика культивирования микроводор ослей в лабораторных
условиях
30
2.2.5
Метод определения продуктивности прироста биомассы
33
2.2.6
Методика определения способности к азотфиксации цианобактерий
33
2.2.7
Методика определения ростстимулирую щего эффекта
цианобактерий в отношении злаковых культур
33
2.2.8
Статистические методы
34
3
Результаты исследования и их обсуждение
36
3.1
Выделение продуктивных штаммов микроводорослей, из природных субстратов перспективных для агробиотехнологии
36
3.2
Определение видового состава микров одорослей горячих источников Уйгурского района и выделение альгологически чистых
культур микроводорослей
37
3.3
Получение бактериологически чистых культур выделенных штаммов
микроводорослей
43
3.4
Определение продуктивности и способ ности к азотфиксации
выделенных культур цианобактерий
46
3.5
Изучение ростстимулирующего эффекта азотфиксирующих
цианобактерий на сельскохозяйственные растения
47
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
52
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
53
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. Одной из основных задач земледелия является разработка аспектов к сохранению и увеличению плодородия почвы. Избыточное содержание различных гербицидов и тяжелых металлов в почве приводит к токсическому эффекту и уничтожению существенной части флоры. Для решения этой проблемы перспективными являются группа фотосинтезирующих микроорганизмов - цианобактерии. На данный момент становится ясным положительная экологическая роль цианобактерий в почве в качестве азотфиксаторов и накопителей органического вещества [1].
С точки зрения прикладного использования, цианобактерии технологичны, культивируются на дешевых питательных средах (не требуют органических соединений и источников минерального азота) характеризуются быстрым накоплением биомассы даже в экстенсивных культурах, не требующих дорогого оборудования. Вместе с тем, на общем фоне исследований цианобактерии не достаточно изучены в агробиотехнологии. Поэтому внимание к этой группе микроорганизмов в практическом аспекте сосредоточено на изучении их действия на растения и возможности составления на их основе активных препаратов. В связи с этим поиск и выделение активных штаммов азотфиксирующих цианобактерий представляется актуальным.
Научная новизна исследования: Выделен новый штамм цианобактерий представитель рода Anabaena, перспективный в качестве биоудобрения для сельскохозяйственных растений.
Практическая значимость цианобактерий в агробиотехнологии: Выделенные штаммы цианобактерий могут быть использованы в качестве биоудобрений для сельскохозяйственных растений.
Цель исследования: Выделение и изучение активных штаммов азотфиксирующих цианобактерий, перспективных в агробиотехнологии.
Задачи исследования:
Выделить альгологически и бактериол огически чистые культуры азотфиксирующих цианобактерий из почв и альгобактериальных матов; 2.Определить продуктивность выделенных штаммов цианобактерий; 3.Определить ростстимулирующий эффект выделенных штаммов цианобактерий на сельскохозяйственные растения.
Объект исследования: Nostoc sp Т-2; Anabaena sp Рп-1; Oscillatoria TI-3
Теоретическая и методологическая основа: стандартные микробиологические и альгологические методы исследования; Методические указания Сиренко Л.А., Гайсина Л.А., Заядан Б.К.
Практическая база: лаборатория биотехнологии НИИ Проблем биологии и биотехнологии КазНУ им.аль-Фараби.
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
Обзор литературы
Цианобактерии - как объекты агробиотехнологии
Систематическое положение цианобактерий, их морфологическая характеристика и особенности клеточного строения
Цианобактерии (Cyanoprokaryota) - древняя группа фотосинтезирующих прокариотических организмов, населяющая и наземные экосистемы. Благодаря долгой эволюционной истории, они смогли накопить запас адаптационных свойств, позволивших им освоить практически все типы местообитания, существующие на нашей планете и стать важным компонентом автотрофного блока биосферы [2].
К цианобактериям относится большая группа микроорганизмов, сочетающих прокариотное строение клетки со способностью осуществлять фотосинтез, сопровождающийся выделением O2, что свойственно разным группам водорослей и высших растений. Объединение черт, присущих организмам, относящимся к разным царствам или даже надцарствам живой природы, сделало цианобактерии объектом борьбы за принадлежность к низшим растениям (водорослям) или бактериям (прокариотам) [3].
Систематика цианобактерий была рассмотрена и изучена достаточно много раз. Вопрос о положении цианобактерий (сине-зеленых водорослей) в системе живого мира имеет долгую и противоречивую историю. В течение длительного времени они рассматривались как одна из групп низших растений, поэтому и систематика осуществлялась в соответствии с правилами Международного кодекса ботанической номенклатуры. И только в 60-х гг. XX в., когда было установлено четкое различие между прокариотным и эукариотным типами клеточной организации и на основании этого К. Ван Нилем и Р. Стейниером сформулировано определение бактерий как организмов, имеющих прокариотное строение клетки, встал вопрос о пересмотре положения цианобактерий в системе живых организмов. Эта систематика вызвала негативную реакцию у многих научных деятелей, для которых было важным фундаментальные различия в систематике бактерий и растений, так как бактерии основывались на свойствах культуральных штаммов, а растения являлись материалом, взятым непосредственно из природы [4].
Наиболее разработанными и изученными системами цианобактерий, основанными на морфолого - онтогенетическом уровне были системы Л. Гейтлера и А.А. Еленкина [5].
В конце 80-х годов И. Комарёк и К. Анагностидис предложили свой вариант систематики цианобактерий, в котором совместно с морфологическими признаками использовали физиолого - биохимиче ские, цитологические и молекулярно - биологические аспекты. Исследователи предложили назвать отдел Cyanoprokaryota Komarek et Anagnos tidis и разделили его на 4 порядк а: Chroococcales (все одноклеточные формы), Oscillatoriales (нитчатые формы),
Nostocales (одноядерные гетероцитные формы) и Stigonematales (многорядные гетероцитные формы) (Рисунок 1) [6].
1 - общий вид; 2 - вид при малом увеличении микроскопа; 3 - отдельная нить при большом увеличении; 4 - гетероцисты анабены.
выход данной картины (Кондратьева Н.В. 1995)
Рисунок 1. Цианобактерии (Суаnophyta): А - Осциллатория (Oscillatoria); Б - Носток (Nostoc); В - Анабена (Аnabaena); Г - Лингбия (Lyngbуа); Д - Ривулярия (Rivularia); Е - глеокапса (Gleосарsа); Ж - хроококк (Chroococcus)
На данное время цианобактерии рассматриваются как самостоятельный отдел, и подразделяется на 5 групп: в 1-ю и 2-ю группу входят одноклеточные формы, клетки одиночные или образуют колонии, которые удерживаются за счет дополнительных слоев клеточной оболочки, а представители 3-5-й групп характеризуются как нитчатые формы. Предложенная система учитывает морфологические, культуральные, физиолого - биохимические и молекулярно- биологические [7].
Цианобактерии -- морфологически разнообразная группа грамотрицательных эубактерий, включающая одноклеточные, колониальные и многоклеточные формы. У последних единицей структуры служит нить (трихом). Нити бывают простые или ветвящиеся. Простые нити состоят из одного ряда клеток (однорядные трихомы),
имеющих одинаковые размеры, форму и строение, или клеток, различающихся по этим параметрам [8].
Ветвящиеся трихомы возникают в результате разных причин, в связи с чем различают ложное и истинное ветвление. К истинному ветвлению приводит способность клеток трихома делиться в разных плоскостях, в результате чего возникают многорядные трихомы или однорядные нити с однорядными же боковыми ветвями. Ложное ветвление трихомов не связано с особенностями деления клеток внутри нити, а есть результат прикрепления или соединения разных нитей под углом друг к другу [9].
Поскольку цианобактерии являются прокариотическими организмами, они не имеют клеточного ядра, хроматофоров, митохондрий, элементов эндоплазматической сети и вакуолей с клеточным соком. Клетку цианобактерий окружает четырехслойная клеточная стенка, включающая в себя мембрану. Стенка в основном состоит из пектиновых веществ и слизистых полисахаридов, целлюлоза в небольшом количестве. У многих цианобактерий поверх клеточных стенок находятся еще и слизистые слои, причем единая слизистая оболочка часто покрывает несколько клеток.
Клетки этих организмов могут быть окрашены различно в зависимости от соотношения пигментов: хлорофилла а и d (зеленые), каротиноидов (желтые, оранжевые), фикоцианина (синие) , фикоэритрина (красные) . В их цитоплазме находятся включения запасных питательных веществ, а также газовые вакуоли, или псевдовакуоли, - полости, заполненные газом в форме сот у планктонных форм. В периферической цитоплазме расположены одиночные тилакоиды, несущие пигменты. У нитчатых форм образуются специфические клетки - гетероцисты. Эти клетки крупнее остальных и имеют двойную оболочку. Они содержат фермент нитрогеназу, который играет важную роль в фиксации атмосферного азота [10]. В таблице 1 приведена характеристика некоторых видов цианобактерий.
Комплекс фотосинтетических пигментов представлен хлорофиллом а, каротиноидами и фикобилипротеидами, хлорофилл б отсутствует. Хлоропластов не имеют, крахмал не образуется. Продукт ассимиляции - гликогеноподобный полисахарид. В их клетках снаружи располагается четырехслойная клеточная стенка, в составе которой имеется муреин, который состоит из аминосахаров и аминокислот.
У большинства цианобактерий поверх клеточных стенок находятся слизистые слои, которые могут быть плотными и толстыми и образуют чехлы или капсулы, или же слизь представлена в виде тонкого жидкого слоя. Она предохраняет клетки от высыхания, участвует в движении. Размножаются цианобактерии вегетативным и бесполым способами путем деления клеток пополам. Половое размножение не установлено [10].
Таблица 1.
Характеристика представителей отдела Cyanophyta
Таксономия
Краткая характеристика
Микрофотография
(Увеличение х100)
Отдел Cyanophyta Класс
Hormogoniophyceae
Порядок Nostocales Род Nostocaceae Вид
Nostoc calsicola S- 2
Клетки дифференцированы по форме и функциям. Исключительно колониальные организмы, с хорошо развитой слизью, влияющей на форму колоний. Трихомы гетероцитные, однорядные, неразветвленные, с влагалищами или без них.
Отдел
Трихомы мягкие,
Cyanophyta
слизистые, прямые лил
Класс
слегка изогнуые, иногда
Hormogoniophyceae
одиночные, 3,5-4 мкм
Порядок
ширина, без влагалищ.
Nostocales
Клетки почти квадратные.
Род
Гетероцисты округло -
Anabaenaceae
эллипсоидные до
Вид
цилиндрических. С гладкой
Anabaena sp T- 1
бесцветной оболочкой,
располагаются рядом.
Отдел
Трихомы прямые
Cyanophyta
палочковидные, с
Класс
закругленными концами,
Hormogoniophyceae
окружены слизистым
Порядок
чехлом, клетки
Chroococcales
низкоцилиндрические
Род
плотно примыкают друг
Spirulinaceae
другу.
Вид
Spirulina
labyrinthiformus L- 2
Продолжение таблицы 1
1
2
3
Отдел
Дерновинки темно-сине-
Cyanophyta
зеленые. Трихомы прямые,
Класс
3,5- 5,6 мкм ширина, сине-
Hormogoniophyceae
зеленые к концам суженные
Порядок
и крючкообразно изогнутее,
Oscillatorales
с хорошо выраженными
Род
грануляциями, которые
Oscillatoraceae
могут отсутствовать.
Вид
Oscillatoria tenuis T- 1
Отдел
Округлые клетки с толстой
Cyanophyta
слоистой оболочкой. В
Класс
результате ряда делений
Chroococcophyceae
возникает сложная система
Род
вставленных друг в друга
Gleocapsa
слизистых оболочек или
Вид
слизистых пузырей,
Gleocapsa turgida
заключающих клетки.
Отдел
Близка к осциллатории, но
Cyanophyta
имеет плотное трубчатое
Класс
влагалище или чехол, в
Hormogoniophyceae
который заключена нить. Не
Порядок
имеет гормогонии. Широко
Oscillatoriales
распространена в водоемах
Род
различного типа.
Lyngbya
У некоторых представителей цианобактерий образуются специализированные клетки - гетероцисты и споры (акинеты). Они имеют утолщенную оболочку с сетчатой внутренней структурой без газовых вакуолей. Гетероцисты обычно неспособны к росту и делению и со временем отмирают, их единственная функция
- фиксация атмосферного азота. Гетероцисты могут располагаться на концах трихомов, у их основания, между вегетативными клетками и иногда сбоку.
Акинеты - покоящиеся споры с утолщенной оболочкой и большим количеством запасных питательных веществ (Рисунок 2). Обычно это более крупные, чем вегетативные клетки. Их образуют многие нитчатые цианобактерии. Споры могут выдерживать высыхание и затем прорастают каждая в новую особь, освобождающуюся через разрыв стенки.
а) б)
а - общий вид, б - фрагмент нити
вход данной картины (Кондратьева Н.В. 1995) Рисунок 2. Anabaena: 1) акинета 2) гетероциста
В условиях умеренного климата некоторые планктонные цианобактерии при похолодании образуют акинеты, которые опускаются на дно водоемов, где перезимовывают, а весной прорастают, и молодые, снабженные газовыми везикулами клетки, всплывают к поверхности водоема, к свету. Таким образом, акинеты - не только средство перезимовки, они предназначены для сохранения организма в различных неблагоприятных условиях [11-15].
Клетки цианобактерий мелкие, цилиндрические, округлые. В клетках окруженная оболочкой цитоплазма лишена вакуолей с клеточным соком, окрашена в периферических частях (хромотоплазма) и бесцветная в центре (центроплазма). В хромотоплазме содержатся пигменты. Различное соотношение пигментов обуславливает окраску цианобактерий. В центроплазме располагается ДНК, в отличие от эукариот она не ограничена ядерной оболочкой. Запасные вещества представлены цианофициновым крахмалом, цианофициновыми гранулами, полиэдральными тельцами, гликогеном, валютином. Клетки содержат псевдовакуоли - газовые вакуоли, мембрана которых состоит только из белка, они наполнены газом. Снаружи от цитоплазматической мембраны находится клеточная стенка, которая состоит из четырех четко разграниченных слоев. Один из слоев состоит из муреина - вещество, определяющее прочность стенки. У многих цианобактерий поверх клеточных стенок находятся слизистые слои, образуют капсулы или чехлы, предохраняют клетки от высыхания [16].
Распространение, экология и значение цианобактерий
Цианобактерии - уникальная группа древнейших микроорганизмов. Древность происхождения цианобактерий, их приспособленность к экстремальным условиям среды и способность вступать в симбиотические отношения с другими организмами дала им возможность создавать сообщества, способные выполнять функции многоклеточных организмов.
Живут цианобактерии главным образом в пресных водоемах, являясь пищей для водных животных. Входят в состав планктона, бентоса, живут на поверхности почвы. Они основные и постоянные обитатели скал, пещер, пустынь, арктических грунтов. Цианобактерии являются первыми поселенцами на вулканических и антропогенных субстратах [17].
Большинство азотфиксирующих цианобактерий встречается во всех почвенно - климатических зонах - от тундры до пустыни [18].
Способность цианобактерий входить в симбиотические отношения с различными видами флоры и фауны зависят биологическая активность и физиологическое состояние цианобактерий, проявляющиеся в темпах роста и интенсивности накопления азота и органического вещества [19].
К цианобактериям относят около 2000 видов, распространенных во влажной почве, в поверхностных слоях морских и пресных водоемов. Они могут жить на голых скалах и в пустынях, в горячих источниках при температуре 85 º С и в замерзших озерах подо льдом толщиной 5 м. Они первыми поселяются на: пожарищах, вулканических островах т.д. Цианобактерии часто образуют скопления в виде кустиков, корки или плотной массы, площадь которой может достигать нескольких сотен квадратных метров и до 1 м толщиной. Колонии и нити образуются после того, как клетки цианобактерий поделились, но не разошлись,
поскольку оболочка покрыта слизью. Цианобактерии часто вступают во взаимовыгодное сосуществование с водорослями, мхами, папоротниками, грибами и животными. Распространению многих цианобактерий способствует на то, что они способны образовывать устойчивые к высыханию споры. Итак, основными условиями, обеспечивающими распространение цианобактерий является наличие в среде обитания света и воды для фотосинтеза, кислорода для дыхания и молекулярного азота для азотфиксации [20].
Цианобактерии - древнейшие организмы среди способных выделять кислород. Именно они способствовали повышению в первоначальной атмосфере содержания кислорода, что сделало возможным существование на планете грибов, растений и животных. Отмирая, они участвуют в создании горных пород и почв. Однако цианобактерии могут наносить природе и человеку большие убытки. Так, массовое скопление цианобактерий вместе с микроскопическими водорослями у поверхности воды приводит к цветение. При этом вода окрашивается в сине- зеленый или коричневый цвет и приобретает болотного запаха, вызванного процессами гниения. В воде появляются ядовитые вещества, уменьшается количество кислорода, вследствие чего гибнет рыба и другие водные обитатели.
Цветение воды сейчас является настоящей экологической проблемой, поскольку в водоемы попадает все больше стоков, вредных веществ с полей и т.п. Меры известны: нельзя строить неподалеку от рек и озер склады минеральных удобрений и ядохимикатов, мыть в водоемах машины, скашивать тростник и т.п. Некоторые цианобактерии человек употребляет в пищу. Например, носток потребляют в Китае и Японии, а спирулину - местное население в районе озера Чад Африке. Из спирулины получают пищевой белок (спирулина), который используют как дополнение к еде. На плантациях риса цианобактерии используют как удобрение благодаря способности их к азотфиксации (например анабена в сосуществовании с папоротником азолов). Итак, в природе и в жизни человека цианобактерии имеют как положительное, так и отрицательное значение.
В природе азотфиксирующие бактерии и водоросли по-разному приспособились защищать свой главный фермент от кислорода. У анаэробных бактерий этой проблемы не существует. Обитая в глубоких слоях почвы, они могут жить только в бескислородных условиях [21-24].
Цианобактерии имеют специализированные толстые клетки, которые содержат особое вещество, препятствующее проникновению кислорода. Сходная защита возникла у аэробных (живущих в кислородных условиях) бактерий, у которых кислород при поступлении в клетку восстанавливается до воды.
Бобовые растения вместе с симбиотическими бактериями также выработали интересную защитную систему от кислорода, улавливаемого прежде, чем он достигнет клетки. Его "подстерегает" особый белок - гемоглобин, синтезируемый в корневых клубеньках. Подобно гемоглобину животных, этот белок способен связывать кислород и отдавать его при необходимости. Возможно, такая высокая
чувствительность нитрогеназы к кислороду, а также потребность в большом количестве энергии для ее работы является причиной того, что в природе не так уж много организмов, способных осуществлять биологическую фиксацию азота [25].
Значение цианобактерий:
Являются первичными продуцентами органического вещества в воде и почве.
Насыщают воду и атмосферу кислородом.
Участвуют в почвообразовании, в фиксации атмосферного азота.
Используются в качестве экологически чистого удобрения на рисовых полях (анабена).
Образуют много белка и биологически активных веществ (витаминов), поэтому используются для изготовления лекарственных препаратов (спирулина).
Вызывают цветение водоемов, продуцируют сильные нейротоксические яды, в результате чего вода становится непригодной для питья.
Азотфиксирующая активность цианобактерий
Азот - это элемент, который без преувеличения играет главнейшую роль в жизни на нашей планете. В молекулярной форме он занимает 78% объема земной атмосферы. В различных объектах биосферы содержится более 151 млрд. т азота, в том числе в органических соединениях почвенного покрова 150 млрд. т, в биомассе растений - 1.1 млрд. т, в биомассе животных - 61 млн.т.
Азот необходим всем живым организмам для синтеза азотсодержащих строительных блоков - аминокислот, из которых образуются белки и нуклеиновые кислоты. Поэтому его часто называют органогеном. Содержание азота в организме взрослого человека составляет около 3% от массы тела. Среди соединений азота немало токсичных для организма: окись азота, нитраты, нитриты, нитрозамины, аммиак и другие соединения.
Весь азот, входящий в состав живых организмов планеты практически является результатом биологической азотфиксации. Азотфиксация связана с активностью ферментного комплекса нитрогеназы. При этом происходит восстановление азота до аммиака, затем образуются азотсодержащие органические молекулы. Это восстановительный процесс в присутствии молекулярного кислорода нитрогеназа инактивируется. Цианобактерии живут в присутствии молекулярного кислорода, более того, они его образуют.
Азот в почвах - единственный из биофильных элементов, который исходно отсутствует в материнских горных породах и появляется только в результате деятельности бактерийдиазотрофов. Высокая подвижность всех природных соединений азота и большая скорость метаболизма являются основными причинами отсутствия заметных скоплений азота в природе (в виде минералов и руд).
Азот в почву поступает с атмосферными осадками, остатками животных и растений, минеральными и органическими удобрениями. Важным источником
пополнения азотного фонда почвы является азотфиксация свободноживущими микроорганизмами и клубеньковыми бактериями [26-31].
Цианобактерии являются уникальными организмами, так как они наряду с микроводорослями первичные продуценты органического вещества в почве. Количество его зависит от численности клеток, биомассы и скорости репродукции. Проблема биологической фиксации азота как одна из важных и интересных проблем современной биологии имеет значение в двух аспектах. С одной стороны, азотфиксация составляет один из резервов повышения почвенного плодородия; с другой стороны расшифровка механизма азотфиксации у микроорганизмов откроет
возможность искусственного воспроизведения этого процесса [32].
Несколько работ были посвящены изучению азотфиксации у цианобактерий. Было доказано, что бактериологический чистые культуры цианобактерии способны использовать молекулярный азот.
Исследования чистых культур цианобактерий позволило не только расширить список азотфиксаторов, но и выяснить основные условия азотфиксации у цианобактерий, интенсивность этого процесса и его связь с другими физиологическими функциями [33].
Фиксация молекулярного азота -- один из процессов, определяющих биологическую продуктивность на нашей планете, в связи с чем его изучение отнесено к числу первостепенных задач современной биологии. Круговорот азота в природе является одним из ключевых звеньев биогеохимических циклов Земли, атмосфера которой почти на 80% (по объему) состоит из этого химического элемента и служит его основным источником. Азот входит в состав протеинов, а также других молекул, составляющих основу структурной организации всех уровней живого. Человеку и животным он необходим в виде протеинов животного и растительного происхождения, растениям -- солей азотной кислоты и ионов аммония [34].
Разделение азотфиксаторов на ассоциативные и свободно живущие условно, поскольку способность к свободному обитанию в почве характерна для всех азотфиксирующих бактерий, при этом только симбиотические азотфиксаторы способны ассимилировать молекулярный азот исключительно в тесном взаимодействии с растениями. Связи цианобактерий с другими организмами достаточно разнообразны: они являются фикобионтами в лишайниках, живут в воздушных камерах мхов, в листьях водных папоротников и т. д. Следует отметить, что потенциальные возможности симбиотических азотфиксаторов значительно выше, чем свободноживущих. Симбиотические и ассоциативные системы растений и диазотрофов могут служить примером эволюционно сложившегося специфического взаимодействия живых организмов, изучение которых приобретает особую актуальность в связи с внедрением высокопродуктивного и экологически чистого земледелия. Фиксация молекулярного азота воздуха биологическим путем -- процесс связывания и усваивания азота
микроорганизмами. Он имеет большое практическое значение, поскольку промышленное производство химических азотных удобрений требует значительных затрат энергоресурсов, а сами по себе они могут быть вредны с точки зрения экологии. Всестороннее изучение этой проблемы обусловлено также необходимостью разработки новых эффективных биологических препаратов [35- 37].
Цианобактерии, фиксируя атмосферный азот, играют большую роль в повышении плодородия почвы. Перспективность применения азотфиксирующих цианобактерий в земледелии связана с их участием в круговороте азота, который существенно влияет на урожайность высших растений [38].
Цианобактерии участвуют в накоплении азота косвенно - через стимуляцию азотфиксирующих и олигонитрофильных бактерий и как фиксаторы элементарного азота [38].
Увеличение азота в почве наблюдается в основном за счет деятельности гетероцистных форм цианобактерий, развивающихся на поверхности почвы. Цианобактерии секретируются до 40% продуктов азотфиксации и до 30% от фиксированного углерода. Следовательно, накопление азота в почве происходит в результате деятельности азотфиксирующего комплекса, в котором ведущую роль играют цианобактерии [39].
Другие аспекты влияния цианобактерий на агроэкологическое благополучие почв не менее значимы. Среди них защита поверхностного слоя почвы от ветровой эрозии; удерживание влаги в почве, улучшающее водный режим почв в засушливое время; восстановление нарушенных почв.
Биопрепараты на основе цианобактерий
В агробиотехнологическом плане интересна азотфиксирующая способность цианобактерий. Наличие доступных форм органического вещества в почве никогда не лимитирует азотфиксацию у цианобактерий, обладающих собственным механизмом фотосинтеза [41].
Цианобактерии обладают агрономически значимой азотфиксацией и являются первичными продуцентами органического вещества.
Известно, что цианобактерии являются продуцентами большинства физиологически активных веществ (ФАВ), действующих на растения как положительно, так и в некоторых случаях отрицательно [42].
Применение цианобактерий в агробиотехнологии (АБТ) успешно реализуется на рисовых полях, обогащение почвы азотом для эффективного роста растений, площади листьев и урожайности сельскохозяйственных растений [43].
Однако, имеется ряд работ, в которых показано, что азотфиксирующие цианобактерии могут решить проблемы структуризации плодородия почв и соответственно, увеличить урожайность сельскохозяйственных растений. Таким образом, инокуляция пшеницы культурами цианобактерий усиливает адаптацию
растений к засолению, обеспечивая растение естественным азотом и фитогормонами [44].
Еще один вариант использования биомассы водных цианобактерий - крупномасштабное производство возобновляемых источников энергии в виде биогаза и важных биопродуктов [45].
Помимо всего этого цианобактерии являются выгодными в энергетическом отрасли, так как они автономны (из- за наличия фотосинтеза и азотфиксации) и не зависят от присутствия органического вещества в почве. Также обладают повышенной симбиотической активностью. И особо внимание привлекает их чрезвычайная устойчивость к факторам окружающей сред, следствием которой может явиться возможность использования биопрепаратов на основе цианобактерий во всех почвенно - климатических зонах [46].
Много отрицательных последствий имеет и такой процесс как химизация защиты растений. Накопление пестицидов в окружающей среде - сильный фактор риска для благополучия человечества. Поэтому нужны альтернативные, экологически безопасные средства повышения плодородия почвы и защиты растений от инфекций и вредителей. В этом плане большой интерес представляют биопрепараты на основе бактерий - азотфиксаторов и микробов - антагонистов [47].
Производство микробных препаратов может являться мощным прогрессом в промышленности и в сельском хозяйстве, а применение их - неотъемлемой частью высокоразвитого и экономичного земледелия.
В мировой практике применяются биопрепараты на основе цианобактерий. Например, в США применяется биопрепарат Майкроп, использование которого повышает урожай кукурузы; при применении препарата Плантере сойл инокулант (свободноживущие азотфиксаторы и цианобактерии) сбор пшеницы увеличился на 0,05- 0,51 тга.
Создание искусственных микробных ассоциаций, обладающих экологической поливалентностью, является одним из перспективных направлений в разработке эффективных биопрепаратов. Интерес к изучению микробных ассоциаций обусловлен тем, что одновидовые системы, как и монокультуры в сельском хозяйстве, неустойчивы по своей природе, поскольку в условиях стрессов уязвимы для возбудителей болезней и других факторов, оказывающих влияние на их функционирование в агроценозах.
Из цианобактерий были получены и внедрены в медицинскую практику новые цитостатики - апратоксин, ауридил, гектохлорин и лингбиябеллин. Цианобактерии разных видов продуцируют широкий набор эффективных антибиотиков, так называемых цианобактеринов. Носткарболин, выделенный из цианобактерий, сопоставим с эффективностью галантамина при лечении болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний.
При разработке новых препаратов необходимо уделять внимание не только селекции или подбору штаммов микроорганизмов, но и усовершенствованию технологий их изготовления, применения и хранения [48-50].
Создание и применение биопрепаратов на основе азотфиксирующих микроорганизмов -- наиболее эффективный прием повышения продуктивности растений и качества их урожая, позволяющий сохранять естественное плодородие почв и экологическое равновесие окружающей среды. Их использование дает возможность регулировать численность и активность полезной микрофлоры в ризосфере возделываемых культур, а также обеспечивать растения азотом, фиксированным из атмосферы [51].
Перечень биотехнологических продуктов -- микробных препаратов для растениеводства за последние десятилетия значительно расширился и включает препараты, созданные на основе свободноживущих, ассоциативных, симбиотрофных азотфиксирующих и фосфатмобилизирующих бактерий, а также препаратов бинарного действия, получаемых в результате сочетания различных микроорганизмов.
Одним из перспективных объектов биотехнологии являются цианобактерии благодаря их способности к фотосинтезу, азотфиксации, синтезу комплекса биологически активных и рост активирующих веществ, положительно влияющих на плодородие почв и активность почвенной биоты [52].
Основные преимущества цианобактерий как объектов агробиотехнологии:
Цианобактерии - интересный объект для агробиотехнологии благодаря способности усваивать молекулярный азот и углекислый газ, что удешевляет производство в накоплении их биомассы.
Цианобактерии - неотъемлемая часть микробного населения почвы. Поэтому их введение в агробиоценоз не представляют экологической опасности.
Цианобактерии отличаются адаптационными свойствами в микробоценозе и в экстремальных условиях. Значит, они способны защитить организмы, находящиеся с ними в консортивной связи.
Положительное действие цианобактерии на плодородие почвы и на растение: азотфиксация, фотосинтез, санитарный эффект.
Цианобактерии могут легко входить во взаимоотношение с различной микрофлорой.
Также создание консорциумов на основе цианобактерий могут быть использованы не только в агробиотехнологии, но и к примеру для ремедиации почвы после загрязнения (нефть, полютанты, добыча полезных ископаемых).
Таким образом, азотфиксирующие цианобактерии и создание консорциумов на их основе - перспективное направление в развитии биотехнологии.
Выделение чистых культур цианобактерий из природных субстратов Выделение микроводорослей в культуру с помощью традиционных методов является хорошо изученной процедурой. Выбор подходящей среды является важным условием для успешного культивирования водорослей. Часто первым шагом на пути к успешной изоляции водорослей из их природной среды являются комплексные данные об их среде обитания. Для успешного культивирования необходимы и знания таксономии. Для выращивания диатомовых водорослей необходим кремний, эвгленовых - аммоний, некоторые виды нуждаются в селене. Миксотрофные виды нуждаются в добавление источников питания для бактерий,
бесцветные фаготрофы могут требовать эукариотических источников питания.
При культивировании нужно учитывать уничтожение загрязнителей, особенно тех, которые могут конкурировать с нужным видом. Среди методов выделения водорослей наиболее распространенными являются изоляция с помощью разведения, изоляция отдельных клеток с помощью микропипеток, изоляция при помощи агара и др. Иногда желаемый вид растет на начальных стадиях изоляции, но потом погибает после нескольких пересевов на свежую среду. Это является показателем того, что питательная среда лишена специфических элементов или органических веществ, недостаток которых сразу не проявляется. Организм может подавляться отходами жизнедеятельности, что отравляет его среду обитания, приводя к гибели. В природе эти отходы обычно нейтрализуются другими организмами [53].
Для сохранения водорослей в течение длительного времени в живом состоянии следует брать их в банки в небольшом количестве. Если же материала было взято много, то пробу нужно разлить на стеклянные невысокие и широкие сосуды для обеспечения большей поверхности соприкосновения с воздухом [53].
Отбор образцов для видового анализа и количественного учета водорослей и цианобактерий проводили по общепринятым методикам почвенной альгологии с глубины 0 - 5 см для изучения внутрипочвенных группировок фототрофов и пленки толщиной 0 - 2 мм при цветении почвы (Голлербах, Штина, 1969). Масса почвенных образцов из каждой зоны составляла не менее 1 кг. В дальнейшем для количественного анализа отбирали средние пробы по 10 г и фиксировали 4 % раствором формалина. Обычно в умеренной зоне отбор почвенных образцов для проведения альгологического анализа проводится в мае - октябре до выпадения снега. Наличие в последние годы аномально высокой температуры в зимний период позволяет легко проводить отбор почвенных образцов для выявления особенностей развития фототрофов в это время. Так, наше исследование было выполнено в конце ноября в условиях аномально теплой и бесснежной погоды, когда почва не промерзала очень долго [54] .
Для решения ряда вопросов, связанных с идентификацией, изучением физиологических и биохимических особенностей цианобактерий, исследованием их взаимоотношений с другими микроорганизмами необходимы культуры,
свободные от сопутствующей микрофлоры. Правила бактериологического кода также предусматривает, что любая культура должна быть освобождена от микроорганизмов другого вида.
Сложность получения аксеничных культур и отсутствие общепринятых методов долго не позволяли получить культуры цианобактерий в этом состоянии.
Основная трудность, с которой сталкиваются исследователи при очистке культур, связана с наличием мощных слизистых влагалищ и чехлов, диаметр которых может многократно превышать размеры самих клеток цианобактерий.
Получение каждого аксеничного штамма цианобактерий, практически каждый раз происходит по оригинальной методике, предложенной тем или другим автором. Важным моментом, обеспечивающим хороший рост водорослей в культурах,
является правильный сбор материала и подготовка его для посева.
Основные положения этого этапа работы можно свести к следующему. Сбор полевых образцов для последующего выделения из них культуры водорослей проводят в природе в период активной вегетации вида. Образцы воды, комочки грунта стараются отобрать в том месте, где интересующий организм представлен в максимальной численности и состоянии высокой жизненной активности.
Собранный материал в виде дерновинок, пленок, тины следует сразу же очистить. Как указывает К.А.Гусева, пробы необходимо отбирать там, где меньше всего сказывается влияние берега или каких- либо загрязнений. Не рекомендуется отбирать пробы в местах нагона планктона в водоеме, поскольку здесь обычно имеется большое количество отмерших водорослей и много бактерий [55].
Образец воды собирают в чистый (стерильный) флакон. Его заполняют водой не больше чем на 23 объема, закрывают пробкой (ватой, марлей). Флакон с образцом выдерживают при рассеянном освещении и ... продолжение
Вы можете абсолютно на бесплатной основе полностью просмотреть эту работу через наше приложение.
Похожие работы
Дисциплины
- Информатика
- Банковское дело
- Оценка бизнеса
- Бухгалтерское дело
- Валеология
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Религия
- Общая история
- Журналистика
- Таможенное дело
- История Казахстана
- Финансы
- Законодательство и Право, Криминалистика
- Маркетинг
- Культурология
- Медицина
- Менеджмент
- Нефть, Газ
- Искуство, музыка
- Педагогика
- Психология
- Страхование
- Налоги
- Политология
- Сертификация, стандартизация
- Социология, Демография
- Статистика
- Туризм
- Физика
- Философия
- Химия
- Делопроизводсто
- Экология, Охрана природы, Природопользование
- Экономика
- Литература
- Биология
- Мясо, молочно, вино-водочные продукты
- Земельный кадастр, Недвижимость
- Математика, Геометрия
- Государственное управление
- Архивное дело
- Полиграфия
- Горное дело
- Языковедение, Филология
- Исторические личности
- Автоматизация, Техника
- Экономическая география
- Международные отношения
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности), Защита труда
