МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

Тип работы: Материал
Бесплатно: Антиплагиат
Объем: 98 страниц
В избранное:

Габдуллина Е.Ж., Лесова Ж.Т., Сейдахметова З.Ж.

Молекулярно-генетические основы биотехнологии

2019

удк
ббк
г
Габдуллина Е.Ж., Лесова Ж.Т., Сейдахметова З.Ж.

Молекулярно-генетические основы биотехнологии: учебное пособие. - алматы, 2019. - 95с.

Данное пособие по дисциплине Молекулярно-генетические основы биотехнологии предназначено для магистрантов ВУЗов, обучающихся по образовательной программе 7М05101 по специальности Биотехнология для изучения теоретических основ молекулярной генетики.
Молекулярно-генетические основы биотехнологии рассматривает вопросы современной молекулярной биологии, принципы структурной организации ДНК и РНК, механизмы репликации, репарации и рекомбинации ДНК, механизмы транскрипции, посттранскрипционной модификации РНК и сплайсинга, структурно-функциональную организацию нуклеиновых кислот, современные представления о молекулярных механизмах репликации ДНК и функционирования генома, регуляцию экспрессии генов и технологии рекомбинантных ДНК.

удк
ббк

Рецензенты:
Доктор медицинских наук Демченко Г.А.
Кандидат биологических наук Абдрешов С.Н.

ISBN

Рекомендовано к печати Учебно-методическим советом АТУ

Габдуллина Е.Ж., 2019

СОДЕРЖАНИЕ

Введение
4
1.
Определение молекулярной биологии как науки.
6
2.
Структура и функции белков.
9
3.
Структура нуклеиновых кислот.
18
4.
Молекулярные механизмы репликации ДНК
24
5.
Молекулярные механизмы транскрипции. Матричный синтез РНК
27
6.
Биосинтез белка. Трансляция генетической информации.
32
7.
Генетический код
34
8.
Технология рекомбинантных ДНК
42
9.
Секвенирование ДНК
43
10.
Клонирование ДНК
51
11.
Введение нового гена в клетку
57
12.
Направленный мутагенез и генная инженерия белков
73
13.
Генетическое сцепление и картирование генов
79
14.
Генотерапия
83
15.
Контроль исследований в области молекулярной биотехнологии
86
16
Список литературы
94

ВВЕДЕНИЕ

История изучения ДНК насчитывает более века - с момента открытия в ядрах клеток вещества, названного нуклеином. Полвека назад было доказано, что именно ДНК является носителем наследственности, а затем установлена ее принципиальная молекулярная структура - двойная спираль. В настоящее время молекулярная генетика, то есть изучение того, каким образом хранится и реализуется записанная в молекуле ДНК наследственная информация, является одной из наиболее бурно развивающихся областей науки вообще и биологии в частности. Для полной расшифровки генетического текста человека создана крупнейшая биологическая программа нашего времени. Только в США ежегодный объем финансирования по программе составляет около 200 млн. долларов. Сотни лабораторий в мире вовлечены в работу. В России исследования по этому направлению выполняются в рамках государственной научно-технической программы "Геном человека".
С появлением молекулярной генетики методы генетических исследований принципиально обогатились. От привычных по школьным учебникам морфологических (цвет глаз, цвет семян) и биохимических (группа крови) признаков перешли к непосредственному изучению собственно молекулы ДНК. Такой переход связан с созданием хитроумных методов и подходов, позволяющих работать с признаками, выявляемыми на уровне исследования самой молекулы ДНК. А это не так уж просто: ДНК простенькой бактерии содержит миллионы пар нуклеотидов, а геном человека - более трех миллиардов пар. Вся ядерная ДНК в клетке человека содержится в виде 23 пар молекул, соответствующих хромосомам. Хромосомы каждой пары называются гомологичными. Линейные последовательности генов в них одинаковы, размер соответствующих гомологичным хромосомам молекул ДНК один и тот же. Исключение составляют половые хромосомы X и Y. Они сильно отличаются друг от друга по размеру и содержанию генов.
Геном человека содержит от 50 до 100 тысяч генов. Гомологичные гены (то есть гены, находящиеся в гомологичных хромосомах в одних и тех же локусах) определяют один и тот же признак (например, цвет глаз или группу крови), но могут находиться в разных аллельных состояниях, определяющих различные фенотипические проявления данного признака (глаза могут быть карими или голубыми и т.п.). Аллельные гены отличаются небольшими изменениями последовательности нуклеотидов в ДНК, которые в одних случаях приводят к изменению кодируемого геном продукта и соответствующему изменению фенотипа, а в других случаях никакого заметного влияния на фенотип организма не оказывают.
Уникальное сочетание аллельных состояний всех пар генов и определяет биологическую индивидуальность каждого человека. Например, последовательности ДНК автора и читателя (а также любых двух людей, кроме монозиготных близнецов) почти одинаковы - они различаются только одним нуклеотидом из трехсот. Эти различия на молекулярном уровне определяют то, чем мы друг от друга отличаемся внешне, - цвет волос, глаз, кожи, отчасти рост, вес. Выявление таких замен, определение их значения для развития того или иного признака организма в норме и патологии составляют предмет фундаментальных исследований в этой области науки. Полученные при этом результаты уже имеют множество практических приложений.
Данное учебное пособие позволяет обучающимся специальности Биотехнология ознакомиться с основными методами молекулярно-генетических исследований

Определение молекулярной биологии как науки

Молекулярная биология исторически появилась как раздел биохимии. Датой рождения молекулярной биологии принято считать апрель 1953 года, когда в английском журнале Natur появилась статья Джеймса Д. Уотсона и Фрэнсиса Крика с предложением пространственной модели молекулы ДНК. Основанием для построения этой модели послужили работы по рентгеноструктурному анализу, в которых участвовали также Морис Х. Ф. Уилкинсон и Розалинда Франклин.
Это основополагающее открытие было подготовлено длительным этапом исследований генетики и биохимии вирусов и бактерий.
В 1928 году Фредерик Гриффит впервые показал, что экстракт убитых нагреванием болезнетворных бактерий может передавать признак патогенности неопасным бактериям. Исследование трансформации бактерий в дальнейшем привело к очистке болезнетворного агента, которым, вопреки ожиданиям, оказался не белок, а нуклеиновая кислота. Сама по себе нуклеиновая кислота не опасна, она лишь переносит гены, определяющие патогенность и другие свойства микроорганизма.
В 50-х годах XX века было показано, что у бактерий существует примитивный половой процесс, они способны обмениваться внехромосомной ДНК, плазмидами. Открытие плазмид, как и трансформации, легло в основу распространённой в молекулярной биологии плазмидной технологии. Ещё одним важным для методологии открытием стало обнаружение в начале XX века вирусов бактерий, бактериофагов. Фаги тоже могут переносить генетический материал из одной бактериальной клетки в другую. Заражение бактерий фагами приводит к изменению состава бактериальной РНК. Если без фагов состав РНК сходен с составом ДНК бактерии, то после заражения РНК становится больше похожа на ДНК бактериофага. Тем самым было установлено, что структура РНК определяется структурой ДНК. В свою очередь, скорость синтеза белка в клетках зависит от количества РНК-белковых комплексов. Так была сформулирована центральная догма молекулярной биологии: ДНК -- РНК -- белок.
Дальнейшее развитие молекулярной биологии сопровождалось как развитием её методологии, в частности, изобретением метода определения нуклеотидной последовательности ДНК (У. Гилберт и Ф. Сенгер, Нобелевская премия по химии 1980 года), так и новыми открытиями в области исследований строения и функционирования генов (см. История генетики). К началу XXI века были получены данные о первичной структуре всей ДНК человека и целого ряда других организмов, наиболее важных для медицины, сельского хозяйства и научных исследований, что привело к возникновению нескольких новых направлений в биологии: геномики, биоинформатики и др.
Молекулярная биология изучает основные свойства и проявления жизни на молекулярном уровне. Важнейшими направлениями в Молекулярной биологии являются исследования структурно-функциональной организации генетического аппарата клеток и механизма реализации наследственной информации (молекулярная генетика), исследование молекулярных механизмов взаимодействия вирусов с клетками (молекулярная вирусология), изучение закономерностей иммунных реакций организма (молекулярная иммунология), исследование появления разнокачественности клеток в ходе индивидуального развития организмов и специализации клеток (Молекулярная биология развития) и т. д. Молекулярная биология выделилась из биохимии и сформировалась как самостоятельная наука в 50-х годах. Рождение Молекулярной биологии часто относят к 1953, когда была опубликована работа Дж. Уотсона и Ф. Крика о пространственной структуре молекулы ДНК (т. н. двойной спирали), причём биологическая функция этой молекулы была увязана с её химическим строением (ещё в 1944 О. Эйвери с сотр. установил, что ДНК является носителем наследственной информации). В становлении Молекулярной биологии сыграли большую роль идеи и методы классической генетики, микробиологии, вирусологии, использование достижений точных наук -- физики, химии, математики, кристаллографии, особенно рентгено-структурный анализ). Основными объектами исследования в Молекулярной биологии являются вирусы, в т. ч. бактериофаги, клетки и субклеточные структуры (ядра, митохондрии, рибосомы, хромосомы, клеточные мембраны), а также макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты). Наиболее крупные достижения Молекулярной биологии это - расшифровка структуры некоторых белков и установление связи между их структурой и функцией (М. Перуц, Дж. Кендрю, Ф. Сенгер, К. Анфинсен и другие); определение структуры и механизма биологической функции нуклеиновых кислот и рибосом (Дж. Уотсон, ф. Крик, Р. Холли и другие); расшифровка генетического кода (М. Ниренберг, С. Очоа); открытие обратной транскрипции (X. Темин, Д. Балтимор); механизма основных этапов биосинтеза белковой молекулы (Ф. Крик, Ф. Жакоб, Ж. Mn) и нуклеиновых кислот (А. Корнберг, С. Очоа); установление структуры вирусов и механизмов их репликации, разработка методов генетической инженерии (П. Берг, В. Арбер, Г. О. Смит, Д. Натане); синтез гена (X. Корана) и т.д.
Советским учёным принадлежит формулирование принципа матричного синтеза биополимеров (Н. К. Кольцов), формирование основ современной биоэнергетики и механохимии (В. А. Энгельгардт), доказательство существования ДНК у высших растений (Н. А. Белозерский), создание вирусогенетической теории возникновения рака (Л. А. Зильбер), установление последовательности нуклеотидов в транспортной РНК (А. А. Баев), открытие и изучение информосом (А. С. Спирин) и др. Молекулярная биология имеет важное практическое значение в развитии сельского хозяйства (направленное и контролируемое изменение наследственного аппарата животных и растений для получения высокопродуктивных пород и сортов), микробиологической промышленности (бактериальный синтез биологически активных полипептидов и белков, аминокислот и др.) и как теоретическая основа различных разделов медицины (вирусология, иммунология и др.). Перед Молекулярной биологией стоят задачи решения проблем молекулярных основ злокачественного роста, предупреждения наследственных заболеваний, выяснения молекулярных основ катализа, действия гормонов, токсичных и лекарственных веществ, познания механизмов памяти, природы нервных процессов. Большое значение приобретает развитие генной инженерии, позволяющей целенаправленно оперировать генетическим аппаратом животных организмов. Молекулярная биология вместе с биохимией, биофизикой, биоорганической химией часто объединяют в одно общее направление -- физико-химическую биологию.
Молекуля́рная биоло́гия - раздел биологии, изучающий структуры и процессы, свойственные живым организмам, на уровне молекул. Молекулярная биология стремится объяснить важнейшие явления жизнедеятельности (наследственность, изменчивость, рост, развитие, движение, обмен веществ и энергии, чувствительность, иммунитет и др.) строением, свойствами и взаимодействием входящих в состав организмов химических веществ. В любом организме в каждый момент его существования проходит огромное число биохимических реакций, в которых участвуют молекулы большие и малые, простые и сложные, органические и неорганические. Все эти реакции строго упорядочены и, в зависимости от условий и потребностей организма, подвергаются настройке и регулировке. Решающая роль в организации этих процессов принадлежит двум классам больших молекул - белкам и нуклеиновым кислотам. Эти биополимеры и служат главным объектом исследования в молекулярной биологии.
С самого начала молекулярная биология развивалась как научная область, родственная, прежде всего биохимии и биофизике, а также генетике, микробиологии, вирусологии. В 30 - 40-е гг. 20 века для установления пространственной структуры важнейших белков стали применять рентгеноструктурный анализ, сыгравший впоследствии решающую роль и в установлении строения ДНК. Внедрение в эти годы в биологию методов и идей физики и химии заложило основы для развития молекулярного направления. Во многом его будущие успехи предопределил интерес физиков и химиков к проблеме наследственности. В 1944 г. вышла книга одного из создателей квантовой механики Э. Шрёдингера Что такое жизнь? С точки зрения физика, содержавшая краткое изложение основ генетики. Многими представителями точных наук эта работа была воспринята как призыв сосредоточить усилия на решении загадки вещества наследственности.
Через 9 лет Дж. Уотсон и Ф. Крик решили эту задачу. Ко времени выхода в свет их статьи (апрель 1953 г.), в которой предлагалась модель молекулы ДНК (так называемая двойная спираль), принято относить рождение молекулярной биологии. Модель Уотсона -- Крика ярко выражала главную направленность новой науки: биологические функции макромолекулы можно было объяснить её структурой (см. Дезоксирибонуклеиновые кислоты). При этом молекулярный уровень (двухцепочные ДНК) логично увязывался с субклеточным (репликация хромосом), клеточным (митоз, мейоз) и организменным (наследование признаков).
Близкий подход встречался и в более ранних работах. Ещё в 1927 г. Н.К. Кольцов высказал гипотезу о наследственных молекулах, способных воспроизводиться путём матричного синтеза, а В.А. Энгельгардту в 1939 г. удалось связать строение мышечных белков с их ролью в мышечном сокращении. Однако только после двойной спирали началось бурное развитие молекулярной биологии, ставшей лидером естествознания. Помимо многочисленных конкретных достижений (расшифровка генетического кода, раскрытие механизмов биосинтеза белка, пространственной структуры ферментов и других белков, строения и роли в клеточных процессах биологических мембран и т.д.), молекулярная биология выявила некоторые общие принципы, на основе которых осуществляются самые различные биологические процессы. Так, комплементарность взаимодействующих молекул (их взаимодополняемость, взаимное соответствие как ключа и замка), приводящая к образованию нековалентных химических связей между ними, лежит в основе процессов, требующих биологической специфичности (избирательности, узнавания), начиная от синтеза ДНК и белков и кончая образованием комплексов между ферментом и субстратом, антителом и антигеном, самосборкой вирусных частиц и цитоскелета. Точно так же принцип матричного синтеза используется клетками не однократно, а на разных этапах реализации генетической информации.

Контрольные вопросы:
1. Каковы перспективы развития молекулярной биологии?
2. Каково строение, функции белков и нуклеиновых кислот?
3. Генетическая роль нуклеиновых кислот?
4. Развитие и перспективы роста молекулярной биологии в Казахстане?
5. Каковы задачи молекулярной биологии?. Какие методы молекулярной биологии наиболее широко используются?

Структура и функции белков

Белки или протеины количественно преобладают над всеми другими макромолекулами живой клетки. Белки участвуют во всех биологических процессах, выполняя разнообразные функции: ферментативный катализ; транспорт и накопление; сокращение и движение; иммунная защита; передача информации в клетку; регуляция метаболизма; механическая опора и пр. Каждый белок имеет уникальную, свойственную лишь ему структуру и в такой же мере уникальную функцию, отличающуюся от функций других белков.
Структура белка
Белки - это высокомолекулярные соединения (полимеры), состоящие из a-аминокислот - мономерных звеньев, соединенных между собой пептидными связями. Все 20 аминокислот, встречающиеся в белках, это a-аминокислоты, общим признаком которых является наличие аминогруппы -NН2 и карбоксильной группы -СООН у α-углеродного атома. α-аминокислоты отличаются друг от друга структурой группы R и, следовательно, свойствами. Все аминокислоты можно сгруппировать на основе полярности R-групп, т.е. их способности взаимодействовать с водой при биологических значениях рН (рисунок 1).
Аминокислоты.

Рисунок 1 - Перечень известных аминокислот

Пептидные связи образуются при взаимодействии α-аминогруппы одной аминокислоты с α-карбоксильной группой другой аминокислоты: Пептидная связь - это амидная ковалентная связь, соединяющая аминокислоты в цепочку (рисунок 2). Следовательно, пептиды - это цепочки аминокислот. Полипептидная цепь имеет определенное направление, так как у неё разные концы - либо свободная a-аминогруппа (N-конец), либо свободная α-карбоксильная группа (С-конец):

Рисунок 2 - Пептидная связь в последовательности аминокислот

Изображение последовательности аминокислот в цепи начинается с N-концевой аминокислоты. С неё же начинается нумерация аминокислотных остатков. В полипептидной цепи многократно повторяется группа: -NH-H--. Эта группа формирует пептидный остов. Следовательно, полипептидная цепь состоит из остова (скелета), имеющего регулярную, повторяющуюся структуру, и отдельных боковых цепей R-групп. Первичная структура характеризуется порядком (последовательностью) чередования аминокислот в полипептидной цепи. Даже одинаковые по длине и аминокислотному составу пептиды могут быть разными веществами потому, что последовательность аминокислот в цепи у них разная. Последовательность аминокислот в белке уникальна и детерминируется генами. Даже небольшие изменения первичной структуры могут серьезно изменять свойства белка. Было бы неправильно заключить, что каждый аминокислотный остаток в белке необходим для сохранения нормальной структуры и функции белка. Например, были выявлены многие варианты последовательностей гемоглобина, функционирующие нормально. Объяснение этого заключается в понимании конформации белка и будет дано позднее.
Конформация полипептидных цепей
Функциональные свойства белков определяются их конформацией, т.е. расположением полипептидной цепи в пространстве (рисунок 3). Уникальность конформации для каждого белка определяется его первичной структурой. В белках различают два уровня конформации пептидной цепи - вторичную и третичную структуру. Вторичная структура белков обусловлена способностью групп пептидной связи к водородным взаимодействиям: = ... HN.

Рисунок 3 - Расположение полипептидной цепи в пространстве

По обеим сторонам жесткой пептидной связи возможно вращение: y и j-углы, характеризующие вращение относительно одинарных связей С a- и a-N.
Пептид стремится принять конформацию с максимумом водородных связей. Однако возможность их образования ограничивается тем, что пептидная связь имеет частично двойной характер, поэтому вращение вокруг нее затруднено. Пептидная цепь приобретает не произвольную, а строго определенную конформацию, фиксируемую водородными связями. Известны несколько способов укладки полипептидной цепи: α-спираль - образуется внутрицепочечными водородными связями между NH-группой одного остатка аминокислоты и -группой четвертого от нее остатка; β-структура (складчатый лист) - образуется межцепочечными водородными связями или связями между участками одной полипептидной цепи изогнутой в обратном направлении; беспорядочный клубок - это участки, не имеющие правильной, периодической пространственной организации. Но конформация этих участков также строго обусловлена аминокислотной последовательностью (рисунок 4, 5). Содержание α-спиралей и β -структур в разных белках различно: у фибриллярных белков - только α -спираль или только β -складчатый лист; а у глобулярных белков - отдельные фрагменты полипептидной цепи: либо α -спираль, либо β -складчатый лист, либо беспорядочный клубок.

Рисунок 4 - Конформация полипептидных цепей: а - α -спираль, б - β -складчатый лист.
В одном и том же белке могут присутствовать все три способа укладки полипептидной цепи:

Рисунок 5 - Способы укладки полипептидной цепи

Третичная структура глобулярных белков представляет ориентацию в пространстве полипептидной цепи, содержащей α -спирали, β -структуры и участки без периодической структуры (беспорядочный клубок) (рисунок 5). Дополнительное складывание скрученной полипептидной цепи образует компактную структуру (рисунок 6). Это происходит, прежде всего, в результате взаимодействия между боковыми цепями аминокислотных остатков. Существует несколько видов взаимодействия между R-группами, в основном не ковалентного характера:

Рисунок 6 - Виды взаимодействия между R-группами

Связи, стабилизирующие третичную структуру:
электростатические силы притяжения между R-группами, несущими противоположно заряженные ионогенные группы (ионные связи);
водородные связи между полярными (гидрофильными) R-группами;
гидрофобные взаимодействия между неполярными (гидрофобными) R-группами;
дисульфидные связи между радикалами двух молекул цистеина.
Эти связи ковалентные. Они повышают стабильность третичной структуры, но не всегда являются обязательными для правильного скручивания молекулы. В ряде белков они могут вообще отсутствовать.
Пространственная структура миоглобина (рисунок 7). В полипептидной цепи показаны только α -углеродные атомы. Красным показан гем (небелковый компонент).

Рисунок 7 - Пространственная структура миоглобина

Доменные белки содержат обособленные глобулы - домены, образованные одной и той же пептидной цепью. Домены соединены пептидными перемычками. Вторичная и третичная укладка полипептидной цепи белка полностью определяется его первичной структурой.
Денатурация
Белковая молекула имеет нативную (функциональную) конформацию благодаря наличию большого числа слабых связей и быстро денатурирует при изменении условий среды, от которых эти силы зависят. Изменение температуры, ионной силы, рН, а также обработка органическими или некоторыми дестабилизирующими агентами может привести к нарушению нативной конформации, что и называется денатурацией. Денатурирующие вещества образуют связи с аминогруппами или карбонильными группами пептидного остова или некоторыми боковыми остатками аминокислот, подменяя собственные внутримолекулярные связи в белке, вследствие чего вторичная и третичная структуры изменяются. Эти изменения не затрагивают первичную структуру, при этом биологическая активность белка утрачивается.
Ренативация
При определенных условиях денатурированный белок может быть ренативирован. Это происходит при удалении денатурирующего или дестабилизирующего фактора. Например, при удалении мочевины диализом полипептиды самопроизвольно восстанавливают свою нативную конформацию. То же происходит при медленном охлаждении денатурированного нагреванием белка (рисунок 8):

Рисунок 8 - Процессы денатурации и ренатурации

Это подтверждает, что характер укладки пептидной цепи предопределен первичной структурой.
Взаимодействие белков с лигандами
Основным свойством белка, обеспечивающим его функцию, является избирательное взаимодействие с определенным веществом - лигандом. Лигандами могут быть вещества разной природы, как низкомолекулярные соединения, так и макромолекулы, в том числе и белки. На белковых молекулах есть участки, к которым присоединяется лиганд - центры связывания или активные центры. Центры связывания формируются из аминокислотных остатков, сближенных в результате формирования вторичной и третичной структуры. Связи между белком и лигандом могут быть нековалентными и ковалентными. Высокая специфичность взаимодействия (узнавания) белка и лиганда обеспечивается комплементарностью структуры центра связывания пространственной структуре лиганда. Под комплементарностью понимают химическое и пространственное соответствие активного центра белка и лиганда. Взаимодействие между белком Р и лигандом L описывается уравнением:

белок + лиганд-- белково-лигандный комплекс.

Kдисс.= []x[L][L]. Здесь Кдисс. представляет собой константу диссоциации комплекса. Из уравнения равновесия реакции следует, что если [] = [L], то Кдисс.=[L]. Равенство [] и [L] наступает при полунасыщении белка лигандом, т.е. 50% молекул белка связаны с лигандом; а 50% свободны. Значит, Кдисс. равна такой концентрации L, при которой достигается насыщение белка на 50%. Изменение концентрации L при постоянной концентрации Р и возрастающей концентрации L описывается гиперболической кривой. Максимальная величина L означает, что весь белок связан с лигандом (кривая насыщения) (рисунок 9):

Рисунок 9 - График насыщения белка лигандом

По кривой насыщения можно определить Кдисс. и, следовательно, оценить сродство лиганда к белку. Чем меньше Кдисс., тем больше сродство L и .

Четвертичная структура и кооперативность
В белках различают первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры (рисунок 10):

Рисунок 10 - Структуры белка

Уровни структурной организации белка Четвертичная структура характерна для белков, построенных из двух или более пептидных цепей. Белки такого типа называются олигомерами. Четвертичная структура - это и количество, и способ укладки полипептидных цепей (протомеров) в пространстве:
Четвертичная структура гемоглобина: а - модель молекулы гемоглобина, каждый протомер содержит гем (изображен в форме диска); б - схема комплементарности контактных поверхностей протомеров.
Протомеры связаны друг с другом посредством лишь нековалентных связей (ионных, водородных, гидрофобных). Причем протомеры взаимодействуют друг с другом только определенными участками своей поверхности (контактные участки). Взаимное узнавание контактных участков происходит по принципу комплементарности. Каждый протомер взаимодействует с другим во многих точках. Следовательно, ошибочные комплексы в олигомере практически невозможны. Олигомерные белки способны взаимодействовать с несколькими лигандами в центрах, удаленных друг от друга. Связывание одного протомера с лигандом изменяет конформацию этого протомера, а также всего олигомера и, кроме того, сродство к другим лигандам.
Таким образом, функциональная активность олигомерных белков может регулироваться аллостерическими лигандами. Связь между структурой белка и его функцией можно рассмотреть на примере двух родственных белков: миоглобина и гемоглобина. Миоглобин-мономер (состоит из одной полипептидной цепи), основная его функция - запасание кислорода в тканях. Имея высокое сродство к кислороду, миоглобин легко присоединяет его и отдает кислород только при интенсивной мышечной работе, когда парциальное давление кислорода падает ниже 10 мм рт. ст. Гемоглобин-тетрамер (состоит из четырех протомеров). Основная функция гемоглобина - обратимое связывание с кислородом в легких, где парциальное давление кислорода высокое и гемоглобин взаимодействует с четырьмя молекулами кислорода. На рисунке 11 приведены данные о способности миоглобина и гемоглобина связывать кислород:

Рисунок 11 - Кривая насыщения кислородом миоглобина и гемоглобина

Гиперболическая форма кривой у миоглобина характерна для процесса связывания одной молекулы лиганда (в данном случае О2) единственным местом в белковой молекуле, состоящей из одной полипептидной цепи. Сигмоидальная кривая, полученная для гемоглобина, характерна для белков, содержащих несколько пептидных цепей и имеющих несколько мест связывания. В данном случае проявляется положительный кооперативный эффект, который объясняется следующим образом: первый связанный лиганд (О2) облегчает связывание второй молекулы О2 со вторым гемом, что в свою очередь облегчает связывание третьей молекулы О2 с третьим гемом, а это облегчает связывание последней молекулы О2 . В тканях СО2 и Н2О, образующиеся при катаболизме пищевых веществ, взаимодействуют с гемоглобином и уменьшают его сродство к кислороду, что облегчает поступление кислорода в ткани. В эритроцитах имеется также аллостерический лиганд 2,3-дифосфоглицерат, способный взаимодействовать с дезоксигемоглобином. Это препятствует обратному связыванию освободившегося кислорода с гемоглобином.
Таким образом, связывание гемоглобина с аллостерическими лигандами в тканях, при относительно высоком парциальном давлении, обеспечивает поступление кислорода в ткани. Из рассмотренных примеров следует заключить, что аллостерический эффект является результатом связывания лиганда со специфическим участком белка. Это вызывает значительное изменение в белковой молекуле, которая в свою очередь влияет на активность другого, пространственно удаленного участка. Кооперативные изменения конформации олигомерных белков составляют основу механизма регуляции функциональной активности не только гемоглобина, но и многих других белков.
Простые и сложные белки
Если белки кроме пептидных цепей содержат еще компоненты неаминокислотной природы, то такие белки называются сложными. Небелковую часть называют простетической группой, а белковую апопротеином. Сложный белок холопротеин может диссоциировать на компоненты: Холопротеин -- апопротеин + простетическая группа. Направление реакции зависит от прочности связи компонентов холопротеина. Простетической группой могут быть органические вещества, ионы металлов, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды и др. вещества.

Контрольные вопросы:
1. Каково химическое строение белков? Классификация типов макромолекулярной структуры белков.?
2. Каковы функции белков?
3. Методы выделения и изучения структуры белков?

Структура нуклеиновых кислот

Для понимания ряда особенностей структуры ДНК, важное значение имели закономерности состава и количественного содержания азотистых оснований, установленные впервые Э. Чаргаффом. Оказалось, что азотистые основания ДНК обычно варьируют у разных видов организмов, однако почти не претерпевают изменений у одного и того же вида в процессе развития или в зависимости от изменений окружающей среды либо характера питания. Показано также, что ДНК, выделенная из разных тканей одного и того же вида, имеет одинаковый состав азотистых оснований. Полученные количественные соотношения были названы правилами Чаргаффа. При анализе состава очищенной ДНК, выделенной из разных источников, были сделаны следующие выводы:
1) молярная доля пуринов равна молярной доле пиримидинов:

2) количество аденина и цитозина равно количеству гуанина и тимина:

3) количество аденина равно количеству тимина, а количество гуанина равно количеству цитозина: А = Т и Г = Ц; соответственно

4) существенным для характеристики вида (таксономическое значение) оказался так называемый коэффициент специфичности, отражающий отношение

Это отношение часто выражают в молярных процентах (Г + Ц), или процентах ГЦ-пар. Для животных и большинства растений этот коэффициент ниже 1 (от 0,54 до 0,94), у микроорганизмов он колеблется в значительных пределах (от 0,45 до 2,57).
Данные, полученные А. Н. Белозерским и его учениками, свидетельствуют о существовании в природе АТ-типа ДНК (у хордовых и беспозвоночных животных, высших растений, ряда бактерий, дрожжевидных организмов) и ГЦ-типа ДНК (у недрожжевидных грибов, актиномицетов, ряда бактерий и вирусов).
Известно, что структурными единицами нуклеиновых кислот являются мономерные молекулы - мононуклеотиды. Следовательно, нуклеиновые кислоты представляют собой полинуклеотиды. Это продукты полимеризации мононуклеотидов, число и последовательность расположения которых в цепях ДНК и РНК определяются в строгом соответствии с программой, заложенной в молекуле матрицы (см. главу 14). Мононуклеотиды легко образуются при гидролизе ДНК и РНК в присутствии нуклеаз, состоят из трех специфических компонентов: азотистого основания, углевода и фосфорной кислоты. В этой триаде мононуклеотида углевод занимает среднее положение. Соединения азотистого (любого) основания и углевода (рибозы или дезоксирибозы), получившие название нуклеозидов, легко образуются из мононуклеотида при гидролитическом отщеплении фосфорной кислоты в присутствии щелочи или при участии специфических ферментов - нуклеотидаз.
Нуклеозиды содержат пуриновое или пиримидиновое основание, соединенное с углеводом N-гликозидной связью. В составе нуклеиновых кислот обнаруживаются только β-нуклеозиды. Примером могут служить два мононуклеотида: аденозин-5'-монофосфорная кислота (АМФ) и цитидин-5'-монофосфорная кислота (ЦМФ):

Рисунок 12 - Структура нуклеиновых кислот

R у 2' углерода представлен Н- или ОН-группой в зависимости от типа нуклеиновой кислоты - ДНК или РНК. В образовании N-гликозидной связи в пуриновых нуклеотидах принимают участие N-9 пурина и С-1' пентозы, а в пиримидиновых нуклеотидах - N-1 пиримидина и С-1' пентозы. Чтобы отличить углеродные атомы рибозы или дезоксирибозы от углеродных атомов, входящих в состав пуриновых и пиримидиновых оснований, первые принято обозначать символом штрих: например, атомы у 3-го и 5-го углерода обозначают С-3' и С-5' или, чаще, 3' и 5'.
Следует отметить, что среди продуктов ферментативного гидролиза ДНК и РНК обнаруживаются, помимо нуклеозид-5'-монофосфатов, также нуклеозид-3'-монофосфаты. Положение фосфата определяется местом разрыва фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами, что указывает на характер связи нуклеотидов через остаток фосфорной кислоты, соединяющий 3' и 5' углеродные атомы пентозы.
В таблице 1 приведены состав и названия (включая тривиальные), а также сокращенные обозначения нуклеозидов и нуклеотидов (для РНК они называются рибонуклеотидами, а для ДНК - дезоксирибонуклеотидами).

Таблица 1 - Состав нуклеозидов и мононуклеотидов

Мононуклеотиды и их производные, а также динуклеотиды присутствуют в клетках в свободном виде и играют важную роль в обмене веществ. В частности, нуклеотидную структуру имеют многие коферменты, включая коферменты оксидоредуктаз. Мононуклеотиды, присоединяя еще один остаток фосфата, образуют фосфоангидридную связь (наподобие связи, имеющейся в пирофосфате) и превращаются в нуклеозиддифосфаты (соответственно они обозначаются сокращенно АДФ, ГДФ, УДФ, ЦДФ и ТДФ). Последние, присоединяя еще один остаток фосфата, образуют нуклеозидтрифосфаты (соответственно обозначаются АТФ, ГТФ, УТФ, ЦТФ и ТТФ).
Следует особо указать, что только свободные нуклеозидтрифосфаты в клетках являются предшественниками ферментативного синтеза ДНК и РНК. Однако в клетках имеются свободные, также природные нуклеозидтрифосфаты, не принимающие участия в синтезе белка, но выполняющие жизненно важные функции. В частности, одной из важнейших функций нуклеозидтрифосфатов и особенно АТФ является их участие в биоэнергетике всех живых организмов. Приводим схему образования молекул аденозинди- и аденозинтрифосфатов (некоторые атомы водорода, как и углерода, в пуриновом ядре и в кольце рибозы опущены):

Рисунок 13 - Схема образования молекул аденозинди- и аденозинтрифосфатов

Необходимо указать на существование в организме еще двух типов фосфорных эфиров нуклеотидов, когда фосфат связывает 2 атома кислорода пентозного остатка в одном и том же нуклеотиде и когда фосфатный мостик объединяет два разных мононуклеотида. Примером первого типа являются циклические нуклеотиды 2',3'- и 3',5'-, т.е. два возможных класса соединений, в которых кислородные атомы у С-2' и С-3' или у С-3' и С-5' участвуют в образовании циклической структуры:

Рисунок 14 - Типы циклических нуклеотидов

Первое из этих соединений, 2',3'-АМФ, образуется в качестве промежуточного продукта распада рибонуклеиновых кислот, в то время как циклический 3',5'-АМФ (цАМФ) является естественно встречающимся рибонуклеотидом (он образуется из АТФ в процессе реакции, катализируемой ферментом аденилатциклазой). цАМФ наделен рядом уникальных функций и высокой биологической активностью в регуляции процессов обмена, выполняя роль медиатора внеклеточных сигналов в клетках животных. Аналогичной функцией наделены цГМФ, производные УДФ, ЦТФ и нуклеотиды в составе кофакторов и коферментов.
На рисунке 15 показан пример, когда одна фосфатная группа связывает два разных рибонуклеотида, является структура гуанозилтимидинфосфата:

Рисунок 15 - Структура гуанозилтимидинфосфата

Это соединение хотя и не обнаружено в природе, но содержит тип связи, характерный для природных нуклеиновых кислот. Видно, что С-3' рибозы одного нуклеотида соединяется посредством фосфодиэфирной связи с С-5' рибозы второго нуклеотида.
В медицинской практике, в частности в онкологии, нашли широкое применение синтетические аналоги как азотистых оснований, так нуклеозидов и нуклеотидов. Эти аналоги, имеющие небольшие модификации в структуре основания или углевода, встраиваясь в соответствующие клеточные компоненты, оказывают заметный цитотоксический эффект. К наиболее распространенным лекарственным препаратам - аналогам пуриновых и пиримидиновых оснований (и соответствующим нуклеотидам) относятся 5-фторурацил, 6-тио- и 6-меркаптопурин, 8-азагуанин, 6-азауридин и 6-азацитидин, а также 5-йодпроизводное дезоксиуридина.
Помимо сокращенных названий и обозначений нуклеозидов и нуклеотидов (см. табл. 1), приняты буквенные обозначения нуклеозидов (и нуклеотидов): в частности, для аденозина (и АМФ) это А, для гуанозина (и ГМФ) - Г, для цитидина (и ЦМФ) - Ц, для уридина (и УМФ) - У, для тимидина (и ТМФ) - Т. Пользуясь этими символами, приведенный выше дирибонуклеозидмонофосфат можно обозначить как Г - Т. Заметим, что как по структуре, так и по свойствам Г - Т и Т - Г будут сильно отличаться друг от друга (как и в случае дипептидов).

Контрольные вопросы:
1. Какие виды нуклеиновых кислот известны?: Их общая характеристика.
2. Какова макромолекулярная структура ДНК?
3. Опишите модель Уотсона и Крика. Принцип матричного синтеза.
4. Каковы современные представления о молекулярных механизмах репликации ДНК?
5. Какова структура и свойства основных классов РНК (информационные, рибосомальные, транспортные)?

Молекулярные механизмы репликации ДНК

Репликация ДНК - ключевое событие в ходе деления клетки. Принципиально, чтобы к моменту деления ДНК была реплицирована полностью и при этом только один раз. Это обеспечивается определёнными механизмами регуляции репликации ДНК. Репликация проходит в три этапа:
инициация репликации
элонгация
терминация репликации.
Регуляция репликации осуществляется в основном на этапе инициации. Это достаточно легко осуществимо, потому что репликация может начинаться не с любого участка ДНК, а со строго определённого, называемого сайтом инициации репликации. В геноме таких сайтов может быть как всего один, так и много. С понятием сайта инициации репликации тесно связано понятие репликон. Репликон - это участок ДНК, который содержит сайт инициации репликации и реплицируется после начала синтеза ДНК с этого сайта. Геномы бактерий, как правило, представляют собой один репликон, это значит, что репликация всего генома является следствием всего одного акта инициации репликации. Геномы эукариот (а также их отдельные хромосомы) состоят из большого числа самостоятельных репликонов, это значительно сокращает суммарное время репликации отдельной хромосомы. Молекулярные механизмы, которые контролируют количество актов инициации репликации в каждом сайте за один цикл деления клетки, называются контролем копийности. В бактериальных клетках помимо хромосомной ДНК часто содержатся плазмиды, которые представляют собой отдельные репликоны. У плазмид существуют свои механизмы контроля копийности: они могут обеспечивать синтез как всего одной копии плазмиды за клеточный цикл, так и тысяч копий.
Молекулярный механизм репликации
Ферменты (хеликаза, топоизомераза) и ДНК-связывающие белки расплетают ДНК, удерживают матрицу в разведённом ... продолжение

Вы можете абсолютно на бесплатной основе полностью просмотреть эту работу через наше приложение.