ИДЕНТИФИКАЦИЯ НЕФТЕОКИCЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

Тип работы: Дипломная работа
Бесплатно: Антиплагиат
Объем: 29 страниц
В избранное:

КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ АЛЬ - ФАРАБИ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ

ВЫПУСКНАЯ РАБОТА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ НЕФТЕОКИCЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

ИСПОЛНИТЕЛЬ:

СТУДЕНТКА 4 КУРСА ЛИ И. Г.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ

К. Б. Н., ДОЦЕНТ МУКАШЕВА Т. Д.

НОРМОКОНТРОЛЕР ЖУМАТАЕВА С. Ж.

ДОПУЩЕНА К ЗАЩИТЕ:

ЗАВ. КАФЕДРОЙ

МИКРОБИОЛОГИИ

Д. Б. Н., ПРОФЕССОР ЖУБАНОВА А. А.

АЛМАТЫ, 2003

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. 1. Углеводородокисляющие микроорганизмы

1. 2 Микробная деструкция углеводородов нефти

и нефтепродуктов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2. 1. Объект исследования

2. 1. Питательные среды

2. 3. Методы исследования

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3. 1. Отбор активных нефтеокисляющих бактерий

3. 2. Идентификация отобранных бактерий .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ . . .

РЕФЕРАТ

ВВЕДЕНИЕ

Проблема охраны окружающей среды от нефтяных загрязнений приобретает все большую остроту в связи с ограниченностью возможностей и дороговизной применения для этих целей механических, физических способов очистки. [1]

Нефть и нефтепродукты являются одними из самых опасных и широкомасштабных загрязнителей окружающей среды, поскольку при современных объемах добычи их потери составляют 50млн тонн в год. [2]

Попадая в окружающую среду углеводороды нефти оказывают угнетающее действие на локальные экологические системы: губят живые организмы и существенно изменяют условия их обитания. [3]

Если нефтяные загрязнения характерны в основном только для районов добычи нефти, ее переработки и транспортировки, то загрязнение нефтепродуктами, такими как дизельное топливо, керосин, смазочные масла, мазут и т. д. распространены повсеместно.

Процесс самовосстановления загрязненной среды, по мнению большинства исследователей, идет более 15 - 20 лет. По данным Оборина с соавторами, полного восстановления нефтезагрязненных почв не происходило ни через 15, ни через 25 лет после загрязнения.

Среди мер, принимаемых с целью очистки окружающей среды от указанных загрязнителей, важное место занимает интенсификация микробиологических способов деструкции нефти и нефтепродуктов. [4]

Целью данной работы является отбор активных нефтеокисляющих микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненных почв Тенгизского месторождения, обладающих способностью к деструкции нефти и их идентификация. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Изучение способности культур к росту на средах, содержащих высокие концентрации нефти и отбор активных штаммов.
Первичная идентификация бактерий.
Определение их родовой принадлежности.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. 1. Углеводородокисляющие микроорганизмы.

Общая характеристика. Микроорганизмы, использующие углеводороды широко распространены в природе. [5] Углеводородокисляющие микроорганизмы - составная часть гетеротрофного микробиоценоза. Присутствие углеводород усваивающих бактерий в окружающей среде - важный экологический фактор. В условиях увеличивающегося загрязнения экологическая роль этих микроорганизмов возрастает. [6]

Известно около 15 видов микроорганизмов, из них более 100 видов способны использовать углеводороды нефти в качестве источника энергии. [7] . Микроорганизмы - деструкторы нефти в основном относятся к аэробным и факультативно аэробным организмам. [6] Там, где среда загрязняется нефтью, эти микроорганизмы находят благоприятные условия для своего развития. [8]

Экология. Углеводородокисляющие микроорганизмы распространены повсеместно в почве, воде, разлагающихся веществах и т. д. [9]

Микроорганизмы, потребляющие углеводороды нефти, являются обычными сочленами биоценозов почв.

Во всех почвах в большом количестве содержатся микроорганизмы, способные окислять жидкие парафины и значительно реже - использующие летучие углеводороды. В почвах, содержащих нефть микроорганизмов, использующих н-алканы и ароматические углеводороды, находится значительно больше, чем в почвах без этих соединений.

Почва - весьма благоприятный субстрат для выделения микроорганизмов, использующих углеводороды нефти. В ней обитают бактерии, относящиеся к родам: Mycobacterium, Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Pseudomonas.

Для почв, содержащих нефтепродукты, характерно присутствие форм микроорганизмов: окисляющих газообразные углеводороды, термофилов, усваивающих твердые парафины, бактерий, использующих ароматические углеводороды.

Из почв, пропитанных нефтью впервые были выделены аэробные спорообразующие бактерии с оптимальной температурой роста 45 - 65°С, усваивающих углеводороды. Они принадлежат видам Bacillus subtilis, Bac. brevis, Bac. coagulans. Большая группа штаммов описана как новая разновидность - Bac. circulans ssp. thermophilus nov. ssp.

Из почв нефтяных месторождений (Западная Украина) выделены нафталинусваивающие бактерии, представлены в основном видами рода Pseudomonas: Pseud. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. putida, Ps. boreopolis. По ряду свойств изолированные штаммы отличаются от типовых и обладают строгой специфичностью по отношению к нафталину как единственному источнику углеродного питания.

Из нефтеносных почв выделено свыше 20 видов аспорогенных дрожжей ( роды Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Torulopsis, Sporobolomyces, Trichosporon, Cryptococcus и др. ) [5]

Тауссон сообщает о существовании микроорганизмов, окисляющих углеводороды в почвах пустыни. Там, где почва беспрестанно загрязняется нефтью, эти организмы находят благоприятные условия для своего развития, и большой процент общего количества почвенных микробов является активным. [7]

Бактерии и дрожжи, обладающие способностью усваивать парафины, обитают в ризосфере и филосфере растений, желудочно-кишечном тракте животных. Они выделяются из растительных материалов, подвергнутых биологическому консервированию.

Среди бактерий и дрожжей Квасников и др. обнаружили виды, обладающие способностью фиксировать азот атмосферы при использовании углеводородов в качестве единственного источника углеродного питания и энергии.

Микроорганизмы, окисляющие водороды широко распространены в воде и на дне морей. Скопление углеводородов при наличии благоприятных условий вызывает усиленное размножение микроорганизмов.

Наибольшее количество углеводородокисляющих микроорганизмов обнаруживается в теплое время года и может в 10 - 100 раз превышать количество сапрофитов, высеваемых на МПА. В холодный период года углеводород усваивающие бактерии обнаруживаются значительно реже.

Имеется тесная связь между видовым разнообразием, количеством нефтеокисляющих микроорганизмов и наличием нефтяного загрязнения в водоеме. В прибрежных водах морей, где нефтяное загрязнение постоянно, от 5 до 50% микроорганизмов способны окислять отдельные углеводороды и их смесь. Характер вертикального распределения углеводородокисляющих микроорганизмов также указывает на положительную корреляцию их численности с количеством нефтяных загрязнении, которое более значительное в портах и поверхностном слое воды. Углеводородокисляющие бактерии обнаружены в приатмосферном микрогоризонте Черного моря; зимой их 10² - 10³ клеток в 1 мл. В сильно загрязненных районах Черного моря содержание этих организмов достигает 10³ - 10 в 7 степени клеток в 1 мл.

Большое количество углеводородокисляющих бактерий было обнаружено в грязи различных морских заливов и бухт. [7]

Численность микроорганизмов - деструкторов нефти не может служить количественным, а только качественным. В то же время численность углеводородокисляющих бактерий является фактором, ограничивающим скорость биодеградации. Чем больше численность углеводород усваивающих микроорганизмов, тем меньше требуется времени для их размножения и тем шире спектр углеводородов, подвергающихся окислению. Так, дополнительная инокуляция почвы микроорганизмами повышает биодеградацию дизельного топлива на 10 - 17 %[6]

Большое количество углеводородокисляющих бактерий было обнаружено в грязи различных морских заливов и бухт.

Мюлкин - Филлипс и Стюарт изучали распределение углеводородокисляющих микроорганизмов в 35 - сантиметровом слое грунта и установили, что наибольшее количество этих организмов обнаруживается в самом глубоком слое; в верхней части 35 - сантиметровой колонки грунта их содержание составляло 10 клеток на 1 грамм. Авторы объяснили это тем, что углеводороды концентрируются в нижнем слое, а поверхностный перемешивается с водой. [5]

Из всего вышеизложенного можно сделать выводы, что углеводородокисляющие бактерии наиболее часто встречаются в местах непосредственного загрязнения нефтью: в почве и воде. Микроорганизмы - деструкторы нефти также можно встретить в донных осадках морей и различных водоемов, в грязи морских заливов и бухт. Углеводородокисляющая микрофлора в основном представлена бактериями, но довольно часто встречаются дрожжи и грибы.

Наибольшая численность микроорганизмов, окисляющих нефть обнаруживается в теплое время года, в холодное время они попадаются значительно реже.

Видовой состав микроорганизмов - нефтедеструкторов. Углеводородокисляющие микроорганизмы относятся ко многим таксономическим группам. В настоящее время известно около 100 видов бактерий и мицеллярных грибов, обладающих способностью усваивать углеводороды. [7]

Наиболее распространенным родом является р. Pseudomonas :род Pseudomonas является очень обширным; виды его обнаруживаются повсеместно: в воздухе, почве, пресной и соленой воде. Известно почти 200 видов, многие из которых подвижны, передвигаясь с помощью жгутиков. Некоторые вырабатывают зеленоватый флуоресцирующий пигмент, растворимый в воде. Образование пигментов характерно для видов: Ps. aeruginosa, Ps. boreopdis, Ps. oleovorans, Ps. fluorescens и другие. Присутствие пигмента нехарактерно для морских бактерий.

Большинство видов р. Pseudomonas вызывают брожение глюкозы, но не лактозы. Обычно они способны к восстановлению нитратов до нитритов, аммиака или азота.

Бактерии имеют вид палочек, единичных или парных, или даже коротких цепочек, размером в среднем от 0. 5 до 2 мкм. Морфология колоний может быть различной. [7]

Представителями данного рода являются виды: Ps. sinuosa, Ps. boreopolis, Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. putida, Ps. desmolyticum, Ps. radiobacter, Ps. liquefaciens и другие. [7, 9]

Порядок Actinomycetales. Данный порядок характеризуется нитевидным строением клеток, хотя у микобактерий цепочки клеток или мицелий чаще всего либо являются рудиментарными, либо отсутствуют. [7]

Порядок Actinomycetales включает в себя такие семейства как сем. Mycobacteriaceae и сем. Actinomycetaceae.

р. Mycobacterium. Давно известно, что микобактерии способны усваивать углеводороды. [10]

Микобактерии содержат 30% липидов, неизменным компонентом которых являются миколовые кислоты, сосредоточенные в клеточной стенке. У сапрофитных микобактерий поглощение углеводородов происходит путем пассивной диффузии. [6]

Микобактерии часто бывают окрашенными - красно - оранжевые (группа rhodochrous ) - выделены из вод Арктики. Они преобладают, в частности, в микрофлоре южного нефтеносного района. [11]

В молодом возрасте они имеют вид мелких, неподвижных палочек 2 - 3 мкм длиной и 0. 4 - 0. 6 мкм в поперечнике, часто соединенных попарно под углом. При старении клетки превращаются в очень короткие одиночные палочки. [10] Помимо палочек встречаются кокки, но реже. [12]

В основном микобактерии обладают слабой биохимической активностью: медленно разжижают желатин, либо вообще не разжижают, молоко не изменяют, практически не активны к сахарам, редко обладают инвертазной активностью и не восстанавливают нитраты. [10, 11, 12]

Типичные виды: M. album, M. luteum, M. rubrum, M. mucosum, M. convolum, M. lactiscola, M. paraffinicum, M. brevicale, M. phlei и другие. [7, 10, 11, 12]

р. Nocardia (сем. Actinomycetaceae ) р. Proactinomycetes, p. Actinomyces и р. Micromonospora характеризуются разветвленным мицелием. Actinomyces и Nocardia являются потенциально патогенными для животных, тогда как Micromonospora редко бывают патогенными.

Наиболее характерными представителями р. Nocardia являются виды: N. actinomorphus, N. opacus, N. paraffinae, N. rubber, N. polychronogenes, N. agrestris и др. [7]

Род Bacillus : наиболее активные деструкторы. Рода Bacillus объединяет широкий ряд палочковидных аэробных и факультативно анаэробных эндоспорообразующих бактерий. Он включает термофильные и психрофильные, пресноводные и галофильные, ацидофильные и алкалофильные бактерии, способные гетеротрофно потреблять широкий ряд органических соединений или расти автотрофно.

Анализ последовательностей 16S РНК показал, что внутри рода содержится несколько филогенетически различных групп, часть которых уже выделена в новые роды: Alicyclobacillus, Paenibacillus, Halobacillus, Brevibacillus, Aneuribacillus, Virgibacillus . [13] Крахмал не гидролизуют, желатин не разжижают. [9]

Представители: Bac. hexacarbovorum, Bac. mesentericus, Bac. subtilis, Bac. circulans, Bac. brevis, Bac. palustris, Bac. sphaericus, Bac. mucoides, Bac. idosus и др. [5, 7]

p. Desulfovibrio состоит из небольшой группы облигатных анаэробов, которые восстанавливают сульфаты до сульфидов. Они обнаруживаются в почве, соленой и пресной воде и морских илах. Обычно имеют вид изогнутых палочек или коротких цепочек, и в этом случае похожи на штопор.

В некоторых культурах наблюдаются необычно разбухшие клетки D. desulfuricans . Они передвигаются с помощью единичного полярного жгутика, хорошо развиваются в пресной воде и на начальной стадии выделения культуры не развиваются в морской воде, тогда как D. aestuarii предпочитает морскую воду или 3% минеральный раствор, обогащенный сульфатами и пептоном.

P. rubenshickii близок к обоим видам микроорганизмов, но он способен использовать масляную, пропановую, валерьяновую, пальмитиновую и стеариновую кислоты, галактозу, сахарозу, лактозу и мальтозу. [7]

род. Methanomonas : считается состоящим из вида: Meth. methanica , широко распространенного в природе, вернее - в почве. Молодые клетки обычно представляют короткие палочки размером 0. 5 - 0. 8 мкм на 2. 0 - 3. 0 мкм и подвижны благодаря жгутику. Старые культуры могут иметь клетки почти крупные. Зонген выделил микроорганизм, который он очевидно считал принадлежащим к роду Pseudomonas , хотя относил их к Bac. methanicus . Орла - Джексон дал этому виду современное название Methanomonas methanica .

Метанобразующие бактерии являются облигатными аэробами, и поэтому неактивны в морских осадках и всюду, где глубина превышает несколько сантиметров. [7]

Помимо вышеуказанного вида, в природе встречается вид Methyiomonas sp ., который осуществляет биодеградацию хлорированных углеводородов. Установлено, что смешанная культура метанокисляющих бактерий деградирует хлорированные углеводороды ( 3 - хлорэтилен, хлоралканы) в течение 2 - 4 суток. [14] .

Род Rhodococcus . Постоянный компонент микрофлоры нефтяных залежей. Они используют газообразные н - алканы, включая их углерод в клеточную биомассу. [6]

В основном это аэробы, часто неподвижные, некислотоустойчивы. [15] Палочковидные ( Rhodococcus erythropolis , пропаноокисляющие родококки) ; характерными свойствами представителей рода Rhodococcus является их плеоморфизм и 3х-стадийный жизненный цикл развития, включающий образование рудиментарного или хорошо развитого первичного мицелия, который фрагментируется на палочки и кокковидные клетки (микроцисты) . Жизненный цикл кокки - палочки - кокки осуществляется обычно за 24 - 28 часов, реже за несколько суток [15] .

Наиболее известные виды: Rhod. rhodochrous, Rhod. ruber, Rh. erythropolis, Rhod. luteus, Rhod. opacus, Rhod. maris, Rhod. terrae, Rhod. rubropertinctus, Rhod. equa, Rhod. chlorophenolicus.

Род Аrthrobacter : можно встретить в морях, в почве, пресных водохранилищах. Способны образовывать гликолипиды на н - алканах, усваивать антрацен, фенол. Не образуют миколовых кислот. В клетку углеводород поступает не через всю клеточную стенку, а через отдельные её участки. Выделяющееся из клетки вещество эмульгирует углеводород, а места его выхода служат каналами для поступления углеводородного субстрата в клетку[16] .

Артробактерии являются одними из наиболее распространённых в почвах микроорганизмов, которые обеспечивают удивительную устойчивость к неблагоприятным факторам среды[16] .

Типичными представителями - деструкторами данного рода являютяся: Arthrobaster sp., A. calcoaceticus, A. paraffineus, A. globiformis и др.

Род Aspergillus . Представителями этого рода являются наиболее изученными из грибов. Аспергиллы характеризуются большой скоростью роста в самых разнообразных экологических условиях. Они обладают жизнеспособностью под действием ряда экстремальных факторов [7] .

Образующиеся гифы проникают в среду с углеводородами, обильно ветвясь в ней. В гифах обнаруживаются жировые включения. Эти включения играют важную роль при усвоении углеводородов, эмульгируя их сложные фракции [17] . Аспергиллы были выделены из лесных почв, нефтяного ила, дизельного топлива [6] .

аспергиллы: Aspergillus niger, A. fumigatus, A. sp, A. flavus, A. ochraceus, A. alliaceus, A. luchaensis и др. [7, 18] .

Род Candida : Для выращивания на парафинах в промышленных условиях рекомендованы штаммы C. guilliermondii и C. tropicalis .

Известно, что дрожжи C. guilliermondii Kangeron et Guerra являются гетероталличными гаплоидами, имеющими два типа спаривания, и при соответствующих условиях могут скрещиваться и давать диплоидное потомство. В связи с этим данный вид перенесён в род Pichia и классифицируется как Pichia guilliermondii Wickerham [19] .

Таким образом, углеводородокисляющие микроорганизмы представлены вышеуказанными родами и видами, но следует заметить, что это далеко не все представители и роды данной группы организмов: кроме названных представителей в природе встречаются следующие роды бактерий: Rhodococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Acinetobacter, Micrococcus, Achromobacter; дрожжей: Rhodotorula, Trichosporon и др. ; грибов Penicillum, Aspergillus [6] .

Довольно перспективным в отношении очистки различных экосистем является род Rhodopsuedomonas , который встречается в основном в северных регионах. Типичные представители: Rh. capsulata, Rh. sphaeroides, Rh. palustris, Rh. rubrum и др. [20]

Таблица1. Таксономический перечень микроорганизмов, усваивающих углеводороды и микроорганизмов, родственных с ними

... продолжение

Вы можете абсолютно на бесплатной основе полностью просмотреть эту работу через наше приложение.