Изоферменты

Тип работы: Материал
Бесплатно: Антиплагиат
Объем: 35 страниц
В избранное:

ВВЕДЕНИЕ

Злаки среди всех семейств цветковых растений занимают особое положение. К злакам принадлежат основные пищевые растения человечества - пшеница мягкая (Triticum aestivum), рис посевной (Oryza sativa) и кукуруза (Zea mays) .

Значение злаков в жизни человека велико и многообразно. На первое место среди всех следует поставить пшеницу, которая по праву считается основной пищевой культурой человечества [1] .

Пшеница - главная зерновая культура мира. По площади, занятой ее посевами, около 225 миллионов га - пшеница занимает первое место среди всех культивируемых растений. Она широко возделывается от северных полярных районов до южных пределов пяти континентов.

Как было уже сказано, среди зерновых культур пшенице принадлежит ведущее место по занимаемым площадям, а также и валовому сбору зерна. Дальнейшее увеличение будет идти за счет повышения урожайности на основе комплексной механизации, за счет новых технологий возделывания этой культуры и внедрения новых сортов со стабильным урожаем в различные по метеорологическим условиям годы.

Фундаментальными проблемами являются умение управлять механизмами мутагенеза, закономерностями формирования в гибридных популяциях. Создание новых типов растений на основе клеточной и генной инженерии. Знание этих методов и процессов необходимо для успешного внедрения в практику достижений генетической науки.

Детальное изучение и описание геномов важнейших зерновых культур является одним из приоритетных направлений современной генетики растений.

Использование биохимических (молекулярных) маркеров позволяет изучать генетическое разнообразие зерновых культур, в том числе и пшеницы. Изменчивость видов пшеницы систематизируют в процессе их ботанико-географического изучения; генетический потенциал изменчивости раскрывают при селекционной и генетической работе с видами пшеницы и ее сородичами. Важное значение в изучении частной генетики пшеницы имеют коллекции мирового разнообразия видов рода Triticum. В настоящее время наиболее крупные коллекции сосредоточены во Всероссийском НИИ растениеводства им. Н. И. Вавилова (Россия, Санкт-Петербург) и в Институте генетики растений и зародышевой плазмы (США, Белтсвилл) . Коллекция ВИРа насчитывает более 60 тысяч образцов пшеницы из более 70 стран мира. Многие коллекции являются источником хозяйственно-ценных свойств, необходимых в селекции пшеницы [2] .

Совсем недавно внимание биологов было привлечено к классу полимеров-белкам. Известно, что с ними связаны жизненные функции организма. Одним из возможных путей использования белков является их вовлечение в разработку филогенетического и генетического анализа, для решения актуальных проблем прикладной ботаники, генетики и селекции. Особенно перспективно использование белков в методах молекулярной генетики.

Белки - как генетические маркеры играют важную роль в изучении наследственной конституции организма и, особенно в оценке исходного и селекционного материала, поскольку облегчают контроль над включением желаемых генетических факторов от родительских форм в создаваемые сорта и гибриды.

Актуальность: Разработка новых научно-обоснованных методов селекции пшеницы требует подробного исследования генетической природы и структуры генома. Белковые маркеры играют важную роль в изучении, сохранении и эффективности использования генетических ресурсов. Изучение генетической изменчивости диких сородичей злаковых культур является особенно актуальным для многих генетико-селекционных программ. Знание генетической природы пшеницы необходимо для генетического улучшения культурной пшеницы.

Цель: изучение генетического разнообразия пшеницы с использованием биохимических маркеров.

В связи с вышеизложенной целью нами были поставлены следующие задачи:

Изучить генетическую изменчивость ди-, тетра- и гексаплоидных видов пшеницы.
Провести сравнительный электрофоретический анализ изоферментов различных видов Triticum.
Раскрыть предполагаемые пути наследования различных генов, контролирующих изоферментные системы.

Теоретическая значимость: изучение генетического разнообразия пшеницы является весьма значимым в раскрытии скрытых механизмов в частной генетике вида. Позволяет детально изучить имеющиеся работы в данной области и тем самым открывает новые возможности для дальнейших исследований.

Практическая значимость: изучение генетического разнообразия пшеницы, представляет большую значимость в селекционных работах, при подборе пар для скрещивания, создании банка генов и др.

Исходная информация: начальной информацией при написании диссертации служили работы отечественных ученых С. И. Абугалиевой, к. б. н., и Е. К. Туруспекова, к. б. н.

Методика исследований: электрофоретическое разделение ферментов /белков/ в полиакриламидном геле (ПААГ) с последующим гистохимическим окрашиванием.

Ожидаемые результаты: выявить мономорфность по ферментным системам глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, .

Проведя сравнительный анализ электрофоретических спектров ферментных систем, выявить их генетическую изменчивость для различных видов пшеницы.

Публикации: Абугалиева А. И., Абугалиева С. И., Орманбекова Г. Ш., Ледовской Ю. С., Есимбекова М. А.

Идентификация, анализ продуктивности и качества зерна сортового генофонда озимого тритикале//«Современное состояние проблем и достижений в области генетики и селекции» (26-27 марта 2003., Алматы, Казахстан. Материалы Международной научной конференции, посвященный 100-летию со дня рождения Н. Л. -Удольской и 70-летию биологического факультета Казахского Национального Университета им. аль-Фараби, с. 39.

Апробация: Результаты исследований представлены на 2-ой международной конференции молодых ученых «Современные проблемы, генетики, биотехнологии и селекции растений» (Харьков, Украина, 19. 05. 03) .

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. 1. Общие положения

Внутривидовая генотипическая изменчивость пшеницы представлена множеством сортов, коллекционных и природных форм, различающихся по многим и особенно по селекционно-ценным признакам. Изменчивость описана по типу развития, по степени зимостойкости, засухоустойчивости, устойчивости к болезням и вредителям. Известна внутривидовая изменчивость по общему габитусу растения, типу куста, форме и окраске колоса, по биохимическим и другим признакам.

Закономерности наследственной (генотипической) изменчивости проанализированы Н. И. Вавиловым на примере системы изменчивости рода Triticum. Эти материалы послужили основой для выяснения гомологий и аналогий в изменчивости видов пшеницы. Исследование системы изменчивости видов, родов и семейств позволило Н. И. Вавилову сформулировать Закон гомологических рядов в наследственной изменчивости, который стал началом сравнительно-генетических исследований и теоретической основой нового направления в генетике - сравнительной генетике видов, растений.

Пути и методы выявления и поддержания генотипической внутривидовой изменчивости тесно связаны с биологией размножения вида. Биологии цветения пшеницы посвящено много экспериментальных работ, обобщенных в обзорах. По генетической структуре сорта пшеница принадлежит к числу автогамных (самоопыляющихся) растений. Однако склонность к открытому цветению отмечена у всех пшениц - больше у гексаплоидных видов, которые имеют значительные сортовые различия. При определенных условиях у пшеницы возможно частичное перекрестное опыление, ведущее к спонтанной гибридизации. Замечено, что спонтанные гибриды чаще возникают у сортов, слабо адаптированных к агроэкологическим условиям, и у форм мужскистерильных. У пшеницы в природных и сортовых популяциях спонтанная гибридизация - возникновение гетерозигот - постоянно сопровождается гомозиготизацией при регулярном самоопылении. Поэтому сорта и формы пшеницы практически гомозиготны и представляют собою в генетическом отношении чистолинейные совокупности.

Изучение генетики пшеницы, направленное на выяснение генетических основ возникновения у нее многообразия, а также установление генетической детерминации признаков и свойств, идет на основе выделения форм и линий, различающихся по свойствам и признакам. Изученное генетическое многообразие рода Triticum представлено в генетических коллекциях, где собраны линии, маркированные определенными генными мутациями или хромосомными аберрациями. В селекционных и генетических коллекциях собрано то многообразие, которое способствует раскрытию системы изменчивости видов, интегрирующей генетический потенциал видов и рода в целом [2] .

Основными путями индуцирования изменчивости и выделения измененных форм у пшеницы служат: спонтанный и индуцированный мутагенез, внутривидовая гибридизация, автополиплоидия, анеуплоидия, отдаленная гибридизация отдаленных экологически форм и близких видов, отдаленных видов и близких родов (с последующей полиплоидией), замещение хромосом на чужеродные или введение участков хромосом, а главное, сочетание этих методов. Все перечисленные пути играют большую роль в возникновении внутривидовой генотипической изменчивости и создании новых видовых форм.

Среди хлебных злаков род Triticum L. Выделяется наибольшим полиморфизмом. Все виды пшениц (а их 27) подразделили на две группы, которые образуют полиплоидный ряд.

Диплоидные виды (n = 7), геном А, сюда относится Т. boeoticum (AbAb) ; T. urartu (AaAa) ; T. monococcum (AbAb) ;
Тетраплоидные виды (n = 14) геном А и В, к ним принадлежат T. dicoccoides (AuAuBB) (дикая полба) ; T. dicoccum (AuAuBB) (культурная полба) ; T. durum (AuAu) ; T. Poloniсum (AuAuBB) ; T. arаrаticum (AbAbGG) ;
Гексаплоидные виды (n = 21), геном A, B и D, сюда относят T. timopheevii (AbAbAbAbGG) ; T. aestivum (AuAuBBDD) ; T. compactum (AuAuBBDD) [25] .

В связи с представлением разнообразия геномного состава пшеницы возникает вопрос о родстве между видами, закономерности кодирования белка, совместимости видов до получения новых сортов, линий, а также улучшения уже имеющихся. Большое значение в этом приобретают белки (ферменты) как первичный продукт экспрессии гена. Еще в 1935 году Н. И. Вавилов обосновал необходимость изучения генетики засухоустойчивости. Исследованими отдельных авторов [3] показано, что засухоустойчивость контролируется полимерными генами, ограничивающими продуктивность растений. Генкель П. А. (1967) указал, что засухоустойчивость растений связана с сохранением или способностью к синтезу белка, который программируется ДНК. Следовательно, засуха детерминируется генетическим аппаратом [4] .

В широком смысле изучение генетики растений началось благодаря использование разработанного Хантером и Маркертом [5] метода зимограмм. Метод основан на сочетании высокой разрешающей способности зонального электрофореза, позволяющего разделять сложные смеси высокомолекулярных соединений на основании размера и заряда их молекул и гистохимических приемов проявления ферментативной активности. Электрофоретические варианты изозимов оказались удобными маркерами в генетических исследованиях [6] .

1. 2. Применение молекулярных маркеров

Изоферменты - как генетически детерминированные маркеры, кодоминантны и носят доминантный характер насследования.

Исследование изоферментов позволило значительно развить популяционную генетику многолетних древесных растений. Так, например, при изучении полиморфных ферментов по десяти локусам у сосны обыкновенной были установлены частоты аллелей в выборках двуярусных популяций. По всем локусам наблюдался множественный аллелизм и найдены четкие межпопуляционные различия.

Ценность белков и ферментов как генетических маркеров подтверждена огромным количеством работ [7] .

Анализ изоферментов является важным экспериментальным методом в современной генетике. Каждый тип субъединиц изоферментов продуцируется особым геном независимо от того, кодируется ли фермент множественными аллелями в одном локусе или множественными локусами.

Следовательно, если обнаружены субъединицы какого-то определенного типа, то это не означает, что есть ген, кодирующий их, но что этот ген активно экспрессируется. Таким образом, субъединица изофермента служит маркером своего гена.

Использование изоферментов в качестве генетических маркеров удобно в силу следующих обстоятельств:

Изоферменты можно определить в малом объеме, при этом анализировать много проб одновременно.
Аллельные изоферменты проявляются кодоминантно; это означает, что один аллель не маскирует другой. Таким образом, о генотипе особи можно судить по фенотипическому признаку - спектру изоферментов.
С помощью изоферментного анализа удается выявить сильнейшие мутации, незаметные при визуальном наблюдении.
В силу сложного обмена веществ, морфологические вещества - это обычно результат взаимодействия многих генных локусов.

Определяя же активность гена по содержанию кодируемого им полипептида, можно более точно анализировать отдельные генные локусы и при этом избегать проблем связанных с влиянием других локусов.

Изоферменты не только средство, но и предмет генетических исследований. Они позволяют выяснить, как кодируется фермент - одним или несколькими участками по хромосомной карте - и как наследуются сохраняющиеся при отборе изоферментные варианты, то есть, соответствует ли тип наследования кодирования фермента множественными локусами [8] .

Таким образом, изоферменты как специфические продукты генов являются хорошими маркерами в изучении генетики пшеницы. Обусловлено такое значение еще и тем, что ряд белков представлен внутри вида множественными аллельными вариантами. Гены, кодирующие некоторые белки, собраны в тесно сцепленные блоки - кластеры, рекомбинация в пределах которых происходит сравнительно редко или практически не наблюдается. И здесь уже блок (группа белков) выступает в качестве генетического маркера [9] .

Итак, информация о генетическом контроле изоферментов и других белков в решении задач генетики, селекции, систематики и изучении закономерностей эволюции.

Изоферменты служат эффективными генетическими маркерами для идентификации хромосом. Это значительно облегчает проведение генетического анализа и позволяет исследовать процессы рекомбинации генеза, осуществлять идентификацию сортов, изучать происхождение геномов пшеницы и т. д.

В настоящее время анализ изоферментов используется для идентификации субституции и транслокации хромосом одного вида в геном другого. Известны работы по идентификации с помощью изоферментов генотипов пшеницы с 1В и 1R транслокациями. Так, И. Рао и М. Рао (I. Rao, M. Rao, 1981) использовали изоферменты алкогольдегидрогеназы в качестве генетических маркеров для идентификации моносомных и дисомных субституций хромосомы С ржи Империал в геном пшеницы Чайниз Спринг. Гены, кодирующие эти ферменты, локализованы соответственно в коротком и длинном плечах хромосомы. В результате проведенной работы было доказано, что в изучаемом материале имела место замена в пшеничном геноме плеча хромосомы 4А пшеницы на длинное плечо хромосомы С ржи [10] .

Обратимся еще к нескольким работам, в которых тем или иным образом раскрываются перспективы использования изоферментов как генетических маркеров в исследовании генетики растений.

Так, в работе Бияшева Р. М. (автореферат диссертации кандидата биологических наук) изучался полиморфизм изоферментов ячменя и возможные пути его использования в селекционно-генетических исследованиях. В работе изучен генетический контроль полиморфных систем 6-, пероксидазы, лейцинаминопептидазы из зрелого зерна ячменя также определены частоты встречаемости и ареалы аллелей, контролирующих ферментные системы 6-PGD, EST, PRX, кислой фосфатазы и α-амилазы у селекционных и местных сортов ячменя.

Идентифицированы и локализованы генетические факторы Pgd 2, ген Pgd-2 контралирует систему 6- ячменя, и локализован в длинном плече хромосомы 5. Также показано, что изоферменты кодируемые локусами Pgd-3, Prx-1, Lap-1 ведут себя как менделирующие признаки с кодоминантным типом наследования. Это открывает широкие возможности путей повышения урожайности ячменя, подбора пар для гибридизации и отбора генотипов с комплексом необходимых признаков и свойств [11] .

Изоферменты как биохимические маркеры генов нашли применение в изучении генетической структуры популяций, филогенетических взаимоотношений различных видов и групп растений.

Полиморфизм по локусам, контролирующим синтез ферментов, приводит к накоплению в популяции определенного количества генетически детерминированных типов ферментов. Источником разнообразия ферментов является мутационный процесс и внутригенные рекомбинации.

Кинг и Аллорд (1972) описали частоту аллельных путей различных локусов, контролирующих синтез эстераз, пероксидаз и фосфотаз в четырнадцати популяциях овса [12] .

Использовали изоферментные различия для выявления филогенетических связей в определении рода Truticum. Изучая изоферментные спектры алкогольдегидрогенозы и эстеразы 1, в экстрактах сухих семян диплоидных, тетраплоидных, гексаплоидных и октаплоидных пшениц, обнаружено, что число зон ферментативной активности возрастает с уровнем плоидности за счет сочетания родительских вариантов фермента с гибридными зонами, образующимися при гетеромономерной ассоциации. Харт (1970) исследовал алкогольдегидрогеназу у гексаплоидных пшениц. При электрофорезе он выявил три зоны активности ADG, установил, что гены, контролирующие синтез ADG, локализованы в хромосомах 4А, 4В, 4D, то есть гомеологичных хромосомах, полученных от трех диплоидных предков [13] .

Немаловажную роль играют исследования по геному пшеницы с участием изоферментов как белковых маркеров. Так ученым из Японии была предпринята оценка эволюции пшеницы по продуктам экспрессии. Проблема заключалась в следующем - выявление роли дупликации генов в эволюции и адаптации видов культурных растений. Проводилось изучение спектров α-амилазы в проростках замещенных линий пшеницы сорта Чайниз спринг и Аe. squarrosa. гены в α-AMY расположены в хромосомах 6D, 6B, 7A, 7B и 7D. Интересно то, что α-AMY хромосом группы 6 при прорастании активируются первыми. С использованием электрофореза был исследован генетический контроль различных форм липоксигенеза, эндопептидазы, кислой фосфотазы, аминопептидазы и алкогольдегидрогеназы гексаплоидной пшеницы. Выявлено расположение 22 структурных генов в хромосомах. Отмечены существенные различия в изозимах, кодируемых гомеологическими группами хромосом, что указывает на дивергенную наследственность нуклеотидов структурных генов [14] .

Благодаря изменчивости, позволительно находить генетические маркеры, с которыми связаны те или иные внешние признаки (скрытая генетическая изменчивость) . Это выгодно в том, что на основании спектров белков возможна классификация культивируемых сортов и включение в создаваемые сорта желаемых признаков качества. Наличие маркерных белков обуславливает возможность биохимически оценить родство сортов и биотипов пшеницы, а в пределах ареала выделить генетические группы биотипов. Таким образом, наследование продуктов экспрессии может оказаться весьма полезным при определении филогенетических связей различных видов пшеницы и родства сортов.

Обратимся к работам наших отечественных ученых, в которых идет речь о генетической изменчивости видов Triticum и Aegilops на основе электрофоретического анализа .

Рассмотрим работу к. б. н. С. И. Абугалиевой. Материалом для исследований в которой служили диплоидные и полиплоидные виды Aegilops и Triticum. Электрофоретическое разделение ферментных систем проводили в вертикальных блоках полиакриламидного геля с использованием трис-аллюминий-лактатной буферных систем, с последующим гистохимическим окрашиванием.

В работе разрешаются вопросы происхождения пшеницы и ее родство c родственными видами. В исследовании изоферментные системы эстеразы (EST), (ААТ), алкогольдугидрогеназы (ADH), малатдегидрогеназы (MDH), глутаматдегидрогеназы (GDH), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (GPD), катодной пероксидазы (PRX) и кислой фосфатазы (ACP), кодируемые локусами Est 1, Est 5, Aat 1, Mdh 1, Mdh 2, Gdh 1, Gpd 1, Prx и Acp 4, использовались в качестве молекулярных маркеров в изучении генетической изменчивости видов Triticum и Aegilops. Было обнаружена мономорфность по ферментным системам , алкогольдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, что, по словам автора, свидетельствует в пользу стабильности их экспрессии в ходе эволюции. Сравнительный же анализ спектров малатдегидрогеназы, эстеразы и кислой фосфатазы позволил выявить их генетическую изменчивость для диплоидных и полиплоидных видов пшеницы с различным сочетанием геномов [15] .

Различие между видами в данном случае заключалось в наличии/отсутствии зон активности изоферментов или различной электрофоретической подвижности. Был выявлен межвидовой полиморфизм T. urаrtu, T. boeoticum и T. monococcum по электрофоретической подвижности изоферментов эстеразы 1.

В тоже время спектры Est 1 тетраплоидных и гексаплоидных видов пшеницы оказались сходными и включали в себя зоны ферментативной активности, характерные для T. monococcum и T. boeoticum.

Также проведенный анализ предполагает возможные пути наследования генов, контролирующих изоферментные системы на различных этапах эволюции пшеницы [16] .

... продолжение

Вы можете абсолютно на бесплатной основе полностью просмотреть эту работу через наше приложение.