Изоферменты
ВВЕДЕНИЕ
Злаки среди всех семейств цветковых растений занимают особое
положение. К злакам принадлежат основные пищевые растения человечества –
пшеница мягкая (Triticum aestivum), рис посевной (Oryza sativa) и кукуруза
(Zea mays).
Значение злаков в жизни человека велико и многообразно. На первое
место среди всех следует поставить пшеницу, которая по праву считается
основной пищевой культурой человечества [1].
Пшеница – главная зерновая культура мира. По площади, занятой ее
посевами, около 225 миллионов га - пшеница занимает первое место среди
всех культивируемых растений. Она широко возделывается от северных полярных
районов до южных пределов пяти континентов.
Как было уже сказано, среди зерновых культур пшенице принадлежит
ведущее место по занимаемым площадям, а также и валовому сбору зерна.
Дальнейшее увеличение будет идти за счет повышения урожайности на основе
комплексной механизации, за счет новых технологий возделывания этой
культуры и внедрения новых сортов со стабильным урожаем в различные по
метеорологическим условиям годы.
Фундаментальными проблемами являются умение управлять механизмами
мутагенеза, закономерностями формирования в гибридных популяциях. Создание
новых типов растений на основе клеточной и генной инженерии. Знание этих
методов и процессов необходимо для успешного внедрения в практику
достижений генетической науки.
Детальное изучение и описание геномов важнейших зерновых культур
является одним из приоритетных направлений современной генетики растений.
Использование биохимических (молекулярных) маркеров позволяет изучать
генетическое разнообразие зерновых культур, в том числе и пшеницы.
Изменчивость видов пшеницы систематизируют в процессе их ботанико-
географического изучения; генетический потенциал изменчивости раскрывают
при селекционной и генетической работе с видами пшеницы и ее сородичами.
Важное значение в изучении частной генетики пшеницы имеют коллекции
мирового разнообразия видов рода Triticum. В настоящее время наиболее
крупные коллекции сосредоточены во Всероссийском НИИ растениеводства им.
Н.И.Вавилова (Россия, Санкт-Петербург) и в Институте генетики растений и
зародышевой плазмы (США, Белтсвилл). Коллекция ВИРа насчитывает более 60
тысяч образцов пшеницы из более 70 стран мира. Многие коллекции являются
источником хозяйственно-ценных свойств, необходимых в селекции пшеницы [2].
Совсем недавно внимание биологов было привлечено к классу
полимеров-белкам. Известно, что с ними связаны жизненные функции организма.
Одним из возможных путей использования белков является их вовлечение в
разработку филогенетического и генетического анализа, для решения
актуальных проблем прикладной ботаники, генетики и селекции. Особенно
перспективно использование белков в методах молекулярной генетики.
Белки – как генетические маркеры играют важную роль в изучении
наследственной конституции организма и, особенно в оценке исходного и
селекционного материала, поскольку облегчают контроль над включением
желаемых генетических факторов от родительских форм в создаваемые сорта и
гибриды.
Актуальность: Разработка новых научно-обоснованных методов селекции
пшеницы требует подробного исследования генетической природы и структуры
генома. Белковые маркеры играют важную роль в изучении, сохранении и
эффективности использования генетических ресурсов. Изучение генетической
изменчивости диких сородичей злаковых культур является особенно актуальным
для многих генетико-селекционных программ. Знание генетической природы
пшеницы необходимо для генетического улучшения культурной пшеницы.
Цель: изучение генетического разнообразия пшеницы с использованием
биохимических маркеров.
В связи с вышеизложенной целью нами были поставлены следующие задачи:
1. Изучить генетическую изменчивость ди-, тетра- и гексаплоидных видов
пшеницы.
2. Провести сравнительный электрофоретический анализ изоферментов
различных видов Triticum.
3. Раскрыть предполагаемые пути наследования различных генов,
контролирующих изоферментные системы.
Теоретическая значимость: изучение генетического разнообразия пшеницы
является весьма значимым в раскрытии скрытых механизмов в частной генетике
вида. Позволяет детально изучить имеющиеся работы в данной области и тем
самым открывает новые возможности для дальнейших исследований.
Практическая значимость: изучение генетического разнообразия пшеницы,
представляет большую значимость в селекционных работах, при подборе пар для
скрещивания, создании банка генов и др.
Исходная информация: начальной информацией при написании диссертации
служили работы отечественных ученых С.И.Абугалиевой, к.б.н., и
Е.К.Туруспекова, к.б.н.
Методика исследований: электрофоретическое разделение ферментов
белков в полиакриламидном геле (ПААГ) с последующим гистохимическим
окрашиванием.
Ожидаемые результаты: выявить мономорфность по ферментным системам глюкозо-
6-фосфат-дегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы,
аспартатаминотрансферазы.
Проведя сравнительный анализ электрофоретических спектров ферментных
систем, выявить их генетическую изменчивость для различных видов пшеницы.
Публикации: Абугалиева А.И., Абугалиева С.И., Орманбекова Г.Ш.,
Ледовской Ю.С., Есимбекова М.А.
Идентификация, анализ продуктивности и качества зерна сортового
генофонда озимого тритикалеСовременное состояние проблем и достижений
в области генетики и селекции (26-27 марта 2003., Алматы, Казахстан.
Материалы Международной научной конференции, посвященный 100-летию со дня
рождения Н.Л.-Удольской и 70-летию биологического факультета Казахского
Национального Университета им. аль-Фараби, с. 39.
Апробация: Результаты исследований представлены на 2-ой международной
конференции молодых ученых Современные проблемы, генетики, биотехнологии и
селекции растений (Харьков, Украина, 19.05.03).
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Общие положения
Внутривидовая генотипическая изменчивость пшеницы представлена
множеством сортов, коллекционных и природных форм, различающихся по многим
и особенно по селекционно-ценным признакам. Изменчивость описана по типу
развития, по степени зимостойкости, засухоустойчивости, устойчивости к
болезням и вредителям. Известна внутривидовая изменчивость по общему
габитусу растения, типу куста, форме и окраске колоса, по биохимическим и
другим признакам.
Закономерности наследственной (генотипической) изменчивости
проанализированы Н.И.Вавиловым на примере системы изменчивости рода
Triticum. Эти материалы послужили основой для выяснения гомологий и
аналогий в изменчивости видов пшеницы. Исследование системы изменчивости
видов, родов и семейств позволило Н.И. Вавилову сформулировать Закон
гомологических рядов в наследственной изменчивости, который стал началом
сравнительно-генетических исследований и теоретической основой нового
направления в генетике – сравнительной генетике видов, растений.
Пути и методы выявления и поддержания генотипической внутривидовой
изменчивости тесно связаны с биологией размножения вида. Биологии цветения
пшеницы посвящено много экспериментальных работ, обобщенных в обзорах. По
генетической структуре сорта пшеница принадлежит к числу автогамных
(самоопыляющихся) растений. Однако склонность к открытому цветению отмечена
у всех пшениц – больше у гексаплоидных видов, которые имеют значительные
сортовые различия. При определенных условиях у пшеницы возможно частичное
перекрестное опыление, ведущее к спонтанной гибридизации. Замечено, что
спонтанные гибриды чаще возникают у сортов, слабо адаптированных к
агроэкологическим условиям, и у форм мужскистерильных. У пшеницы в
природных и сортовых популяциях спонтанная гибридизация – возникновение
гетерозигот – постоянно сопровождается гомозиготизацией при регулярном
самоопылении. Поэтому сорта и формы пшеницы практически гомозиготны и
представляют собою в генетическом отношении чистолинейные совокупности.
Изучение генетики пшеницы, направленное на выяснение генетических
основ возникновения у нее многообразия, а также установление генетической
детерминации признаков и свойств, идет на основе выделения форм и линий,
различающихся по свойствам и признакам. Изученное генетическое многообразие
рода Triticum представлено в генетических коллекциях, где собраны линии,
маркированные определенными генными мутациями или хромосомными аберрациями.
В селекционных и генетических коллекциях собрано то многообразие, которое
способствует раскрытию системы изменчивости видов, интегрирующей
генетический потенциал видов и рода в целом [2].
Основными путями индуцирования изменчивости и выделения измененных
форм у пшеницы служат: спонтанный и индуцированный мутагенез, внутривидовая
гибридизация, автополиплоидия, анеуплоидия, отдаленная гибридизация
отдаленных экологически форм и близких видов, отдаленных видов и близких
родов (с последующей полиплоидией), замещение хромосом на чужеродные или
введение участков хромосом, а главное, сочетание этих методов. Все
перечисленные пути играют большую роль в возникновении внутривидовой
генотипической изменчивости и создании новых видовых форм.
Среди хлебных злаков род Triticum L. Выделяется наибольшим
полиморфизмом. Все виды пшениц (а их 27) подразделили на две группы,
которые образуют полиплоидный ряд.
I. Диплоидные виды (n = 7), геном А, сюда относится Т.boeoticum
(AbAb); T.urartu (AaAa); T.monococcum (AbAb);
II. Тетраплоидные виды (n = 14) геном А и В, к ним принадлежат
T.dicoccoides (AuAuBB) (дикая полба); T.dicoccum (AuAuBB)
(культурная полба); T.durum (AuAu); T.Poloniсum (AuAuBB);
T.arаrаticum (AbAbGG);
III. Гексаплоидные виды (n = 21), геном A, B и D, сюда относят
T.timopheevii (AbAbAbAbGG); T.aestivum (AuAuBBDD); T.compactum
(AuAuBBDD) [25].
В связи с представлением разнообразия геномного состава пшеницы
возникает вопрос о родстве между видами, закономерности кодирования белка,
совместимости видов до получения новых сортов, линий, а также улучшения уже
имеющихся. Большое значение в этом приобретают белки (ферменты) как
первичный продукт экспрессии гена. Еще в 1935 году Н.И. Вавилов обосновал
необходимость изучения генетики засухоустойчивости. Исследованими отдельных
авторов [3] показано, что засухоустойчивость контролируется полимерными
генами, ограничивающими продуктивность растений. Генкель П.А. (1967)
указал, что засухоустойчивость растений связана с сохранением или
способностью к синтезу белка, который программируется ДНК. Следовательно,
засуха детерминируется генетическим аппаратом [4].
В широком смысле изучение генетики растений началось благодаря
использование разработанного Хантером и Маркертом [5] метода зимограмм.
Метод основан на сочетании высокой разрешающей способности зонального
электрофореза, позволяющего разделять сложные смеси высокомолекулярных
соединений на основании размера и заряда их молекул и гистохимических
приемов проявления ферментативной активности. Электрофоретические варианты
изозимов оказались удобными маркерами в генетических исследованиях [6].
1.2. Применение молекулярных маркеров
Изоферменты – как генетически детерминированные маркеры, кодоминантны
и носят доминантный характер насследования.
Исследование изоферментов позволило значительно развить популяционную
генетику многолетних древесных растений. Так, например, при изучении
полиморфных ферментов по десяти локусам у сосны обыкновенной были
установлены частоты аллелей в выборках двуярусных популяций. По всем
локусам наблюдался множественный аллелизм и найдены четкие межпопуляционные
различия.
Ценность белков и ферментов как генетических маркеров подтверждена
огромным количеством работ [7].
Анализ изоферментов является важным экспериментальным методом в
современной генетике. Каждый тип субъединиц изоферментов продуцируется
особым геном независимо от того, кодируется ли фермент множественными
аллелями в одном локусе или множественными локусами.
Следовательно, если обнаружены субъединицы какого-то определенного
типа, то это не означает, что есть ген, кодирующий их, но что этот ген
активно экспрессируется. Таким образом, субъединица изофермента служит
маркером своего гена.
Использование изоферментов в качестве генетических маркеров удобно в
силу следующих обстоятельств:
1. Изоферменты можно определить в малом объеме, при этом анализировать
много проб одновременно.
2. Аллельные изоферменты проявляются кодоминантно; это означает, что один
аллель не маскирует другой. Таким образом, о генотипе особи можно
судить по фенотипическому признаку – спектру изоферментов.
3. С помощью изоферментного анализа удается выявить сильнейшие мутации,
незаметные при визуальном наблюдении.
4. В силу сложного обмена веществ, морфологические вещества – это обычно
результат взаимодействия многих генных локусов.
Определяя же активность гена по содержанию кодируемого им полипептида,
можно более точно анализировать отдельные генные локусы и при этом избегать
проблем связанных с влиянием других локусов.
Изоферменты не только средство, но и предмет генетических
исследований. Они позволяют выяснить, как кодируется фермент – одним или
несколькими участками по хромосомной карте – и как наследуются
сохраняющиеся при отборе изоферментные варианты, то есть, соответствует ли
тип наследования кодирования фермента множественными локусами [8].
Таким образом, изоферменты как специфические продукты генов являются
хорошими маркерами в изучении генетики пшеницы. Обусловлено такое значение
еще и тем, что ряд белков представлен внутри вида множественными аллельными
вариантами. Гены, кодирующие некоторые белки, собраны в тесно сцепленные
блоки – кластеры, рекомбинация в пределах которых происходит сравнительно
редко или практически не наблюдается. И здесь уже блок (группа белков)
выступает в качестве генетического маркера [9].
Итак, информация о генетическом контроле изоферментов и других белков
в решении задач генетики, селекции, систематики и изучении закономерностей
эволюции.
Изоферменты служат эффективными генетическими маркерами для
идентификации хромосом. Это значительно облегчает проведение генетического
анализа и позволяет исследовать процессы рекомбинации генеза, осуществлять
идентификацию сортов, изучать происхождение геномов пшеницы и т.д.
В настоящее время анализ изоферментов используется для идентификации
субституции и транслокации хромосом одного вида в геном другого. Известны
работы по идентификации с помощью изоферментов генотипов пшеницы с 1В и 1R
транслокациями. Так, И.Рао и М.Рао (I.Rao, M.Rao,1981) использовали
изоферменты алкогольдегидрогеназы в качестве генетических маркеров для
идентификации моносомных и дисомных субституций хромосомы С ржи Империал в
геном пшеницы Чайниз Спринг. Гены, кодирующие эти ферменты, локализованы
соответственно в коротком и длинном плечах хромосомы. В результате
проведенной работы было доказано, что в изучаемом материале имела место
замена в пшеничном геноме плеча хромосомы 4А пшеницы на длинное плечо
хромосомы С ржи [10].
Обратимся еще к нескольким работам, в которых тем или иным образом
раскрываются перспективы использования изоферментов как генетических
маркеров в исследовании генетики растений.
Так, в работе Бияшева Р.М. (автореферат диссертации кандидата
биологических наук) изучался полиморфизм изоферментов ячменя и возможные
пути его использования в селекционно-генетических исследованиях. В работе
изучен генетический контроль полиморфных систем 6-
фосфоглюконатдегидрогенозы, пероксидазы, лейцинаминопептидазы из зрелого
зерна ячменя также определены частоты встречаемости и ареалы аллелей,
контролирующих ферментные системы 6-PGD, EST, PRX, кислой фосфатазы и α-
амилазы у селекционных и местных сортов ячменя.
Идентифицированы и локализованы генетические факторы Pgd 2, ген Pgd-2
контралирует систему 6-фосфоглюканатдегидрогеназы ячменя, и локализован в
длинном плече хромосомы 5. Также показано, что изоферменты кодируемые
локусами Pgd-3, Prx-1, Lap-1 ведут себя как менделирующие признаки с
кодоминантным типом наследования. Это открывает широкие возможности путей
повышения урожайности ячменя, подбора пар для гибридизации и отбора
генотипов с комплексом необходимых признаков и свойств [11].
Изоферменты как биохимические маркеры генов нашли применение в
изучении генетической структуры популяций, филогенетических взаимоотношений
различных видов и групп растений.
Полиморфизм по локусам, контролирующим синтез ферментов, приводит к
накоплению в популяции определенного количества генетически
детерминированных типов ферментов. Источником разнообразия ферментов
является мутационный процесс и внутригенные рекомбинации.
Кинг и Аллорд (1972) описали частоту аллельных путей различных
локусов, контролирующих синтез эстераз, пероксидаз и фосфотаз в
четырнадцати популяциях овса [12].
Использовали изоферментные различия для выявления филогенетических
связей в определении рода Truticum. Изучая изоферментные спектры
алкогольдегидрогенозы и эстеразы 1, в экстрактах сухих семян диплоидных,
тетраплоидных, гексаплоидных и октаплоидных пшениц, обнаружено, что число
зон ферментативной активности возрастает с уровнем плоидности за счет
сочетания родительских вариантов фермента с гибридными зонами,
образующимися при гетеромономерной ассоциации. Харт (1970) исследовал
алкогольдегидрогеназу у гексаплоидных пшениц. При электрофорезе он выявил
три зоны активности ADG, установил, что гены, контролирующие синтез ADG,
локализованы в хромосомах 4А, 4В, 4D, то есть гомеологичных хромосомах,
полученных от трех диплоидных предков [13].
Немаловажную роль играют исследования по геному пшеницы с участием
изоферментов как белковых маркеров. Так ученым из Японии была предпринята
оценка эволюции пшеницы по продуктам экспрессии. Проблема заключалась в
следующем – выявление роли дупликации генов в эволюции и адаптации видов
культурных растений. Проводилось изучение спектров α-амилазы в проростках
замещенных линий пшеницы сорта Чайниз спринг и Аe.squarrosa. гены в α-AMY
расположены в хромосомах 6D, 6B, 7A, 7B и 7D. Интересно то, что α-AMY
хромосом группы 6 при прорастании активируются первыми. С использованием
электрофореза был исследован генетический контроль различных форм
липоксигенеза, эндопептидазы, кислой фосфотазы, аминопептидазы и
алкогольдегидрогеназы гексаплоидной пшеницы. Выявлено расположение 22
структурных генов в хромосомах. Отмечены существенные различия в изозимах,
кодируемых гомеологическими группами хромосом, что указывает на дивергенную
наследственность нуклеотидов структурных генов [14].
Благодаря изменчивости, позволительно находить генетические маркеры, с
которыми связаны те или иные внешние признаки (скрытая генетическая
изменчивость). Это выгодно в том, что на основании спектров белков возможна
классификация культивируемых сортов и включение в создаваемые сорта
желаемых признаков качества. Наличие маркерных белков обуславливает
возможность биохимически оценить родство сортов и биотипов пшеницы, а в
пределах ареала выделить генетические группы биотипов. Таким образом,
наследование продуктов экспрессии может оказаться весьма полезным при
определении филогенетических связей различных видов пшеницы и родства
сортов.
Обратимся к работам наших отечественных ученых, в которых идет речь о
генетической изменчивости видов Triticum и Aegilops на основе
электрофоретического анализа .
Рассмотрим работу к.б.н. С.И. Абугалиевой. Материалом для исследований
в которой служили диплоидные и полиплоидные виды Aegilops и Triticum.
Электрофоретическое разделение ферментных систем проводили в вертикальных
блоках полиакриламидного геля с использованием трис-аллюминий-лактатной
буферных систем, с последующим гистохимическим окрашиванием.
В работе разрешаются вопросы происхождения пшеницы и ее родство c
родственными видами. В исследовании изоферментные системы эстеразы (EST),
аспартатаминотрансферазы (ААТ), алкогольдугидрогеназы (ADH),
малатдегидрогеназы (MDH), глутаматдегидрогеназы (GDH), глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназы (GPD), катодной пероксидазы (PRX) и кислой фосфатазы
(ACP), кодируемые локусами Est 1, Est 5, Aat 1, Mdh 1, Mdh 2, Gdh 1, Gpd 1,
Prx и Acp 4, использовались в качестве молекулярных маркеров в изучении
генетической изменчивости видов Triticum и Aegilops. Было обнаружена
мономорфность по ферментным системам аспартатаминотрансферазы,
алкогольдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы и глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназы, что, по словам автора, свидетельствует в пользу
стабильности их экспрессии в ходе эволюции. Сравнительный же анализ
спектров малатдегидрогеназы, эстеразы и кислой фосфатазы позволил выявить
их генетическую изменчивость для диплоидных и полиплоидных видов пшеницы с
различным сочетанием геномов [15].
Различие между видами в данном случае заключалось в наличииотсутствии
зон активности изоферментов или различной электрофоретической подвижности.
Был выявлен межвидовой полиморфизм T.urаrtu, T.boeoticum и T.monococcum по
электрофоретической подвижности изоферментов эстеразы 1.
В тоже время спектры Est 1 тетраплоидных и гексаплоидных видов пшеницы
оказались сходными и включали в себя зоны ферментативной активности,
характерные для T.monococcum и T.boeoticum.
Также проведенный анализ предполагает возможные пути наследования
генов, контролирующих изоферментные системы на различных этапах эволюции
пшеницы [16].
Метод электрофоретического анализа белков и ферментов является
перспективным для оценки генетической изменчивости. Совокупность белков при
электрофорезе несет ценную информацию о структуре генома, кодирующего эти
белки. Белки-маркеры позволяют наряду с изменчивостью структурных генов,
выявить различную активность регуляторных генов, что отражается в виде
изменения количественного состояния фракций. Это соотношение
рассматривается как количественный признак.
Ученым Н.И. Балашовой с сотрудниками изучена закономерность изменения
активности изопероксидаз растений важнейших сельскохозяйственных культур
[17].
Работа проводилась на контрольных по жаростойкости сортах томатов,
кукурузы, тритикале, сои.
Анализировали семи-, восьмидневные проростки, листья со среднего яруса.
Электрофорез проводили в вертикальных пластинах ПААГ по Дэвису. Показано,
что в электрофоретическом спектре пероксидаз, часть зон является стабильной
и сохраняет активность при определенном времени воздействия высоких
температур. Установлена различная скорость дезактивации фермента
пероксидазы проростков изучаемых сортов томата. Показано, что у
относительно жаростойких сортов изменение активности изопероскидазы в два
раза меньше, чем у неустойчивых, то есть, подтверждена версия, что у
жаростойких более устойчивая ферментная система.
Таким образом, метод электрофореза может быть использован для отбора
жаростойких генотипов.
Вернемся рассмотрению генетических маркеров пшеницы. Идентификация
генотипа представляет важную задачу генетики и селекции. Широкие
возможности открывает использование молекулярных генетических маркеров.
Анализ ряда полиморфных ферментных систем позволяет выявить новый пласт
наследственной изменчивости и дифференцировать фенотипически неразличимые
на уровне морфологических маркеров. Наиболее полиморфными среди белков у
пшеницы является – фракция белка зерновки – глиадин. Методами молекулярной
биологии показано, что в генетике мягкой пшеницы содержится от 50 до 300
глиадин-кодирующих последовательностей ДНК, имеющих разную степень
гомологии. Анализ наследования компонентов глиадина у многих сортов дает
предположение, что большинство глиадин-кодирующих генов любого сорта или
генотипа собрано в 6 кластеров. С помощью генетического картирования
установлено, что эти кластеры расположены в хромосомах 1А, 1В, 1D, 6А, 6В и
6D. Гены, находящиеся в одном кластере контролируют синтез определенной
группы компонентов глиадина [18].
Компоненты входящие в блок, наследуются совместно как простой
менделирующий признак, по каждому глиадин-контролирующему локусу
наблюдается множественный аллелизм, то есть существует 6 серий аллельных
вариантов блоков. Для генетики важным представляется то, что разные
аллельные варианты одного и того же кластера имеют различное количество
функционирующих генов. В связи с этим интересен вопрос об аллельных генах,
входящих в состав аллельных вариантов кластеров. Существование полиморфизма
внутри вида по глиадину гарантирует выявление необходимых генотипов при
семеноводстве, также обеспечивает контроль для исследований на пшенице,
связанного со сравнением генотипов до и после эксперимента.
Глиадин кодирующие гены можно успешно использовать для маркирования
хозяйственно-ценных признаков у пшеницы, выявить важные закономерности
формирования оптимального генотипа в селекционной работе.
Обратимся еще к работе наших отечественных ученых. Учеными С.И.
Абугалиевой, Р.М. Бияшевым, Е.В. Кожемякиным [30] изучался полиморфизм
ферментых белков пшеницы. В данной работе проводилось сравнение четырех
сортов озимой пшеницы, представленных 364 линиями, по электрофоретическим
вариантам следующих ферментных систем: катодной перосикдазы, α-амилазы и
глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы. Электрофорез проводили в вертикальных блоках
ПААГ.
В исследовании было выявлено для катодной перосикдазы два
фенотипических варианта. По энзимной системе среди 115 линий сорта Богорная
56 было выявлено 18 вариантных линий, сорта Безостая-1, ОПАКС-1 и
Кооператорка оказались инвариантными. По пероксидазе выявлено четыре-пять
зон активности фермента. Анализ материала позволил выявить два
фенотипических варианта, различающиеся по электрофоретической подвижности
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Сдвиг зон активности у всех наблюдался на
одинаковое расстояние.
Авторами было предположено, что эти зоны активности глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназы контролируются одним возможно полиаллельным локусом.
Также в работе отмечен большой уровень полиморфизма для α-амилазы. Было
выявлено 5 типов спектра для α-амилазы. Все сорта, кроме Кооператорки,
оказались полиморфными по данной ферментной системе. В заключении
говорится, что данные эксперимента показывают важность применения
ферментных систем катодной пероксидазы, α-амилазы и глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназы в генетических исследованиях сортовых форм,
установления подлинности и чистоты семян сортов пшеницы, для выяснения их
генеалогий.
В последнее время перспективным методом в современной биологии
является метод культуры клеток и тканей растений, однако в данных
исследованиях возникает проблема оценки генетической изменчивости и ее
влиянии на селектируемые признаки. В работе Е.К. Туруспекова, Р.М. Бияшева,
Ж. Джардемалиева и М.К. Карабаева проводился анализ генетически
обусловленной изменчивости клеток посредством маркерных признаков у
растений регенерантов [19]. В качестве таких признаков использовались
ферментные системы малатдегидрогеназы, эстеразы, катодной пероксидазы,
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы из тканей зерна
пшеницы. Изменчивость оценивалась по электрофоретическим фенотипам
указанных выше энзимных систем. Всего было скринировано 125 растений-
регенрантов сорта Заря; 54 - сорта Лютесценс и 56 – сорта Коопператорка.
Выявлены растения-регенеранты, отличающиеся от исходных форм по
изоферментам GPD, MDH, EST, PRX, а ADH оказалось инвариантным. По системам
PRX EST изменчивость характеризовалась появлением или исчезновением
активности.
Таким образом, с помощью данных ферментных систем можно маркировать и
даже локализовать генетическую нестабильность культивируемых клеток и
тканей на уровне растений-регенрантов, так как известен генетический
контроль данных изоферментов и место локализации генов экспрессии на
хромосомах.
В одной из работ С.И. Абугалиевой приводится пример использования
молекулярных маркеров при идентификации сортов и линий, отборе генотипов и
создании новых сортов мягкой пшеницы [20].
В работе использовались районирование сорта, дигаплоидные линии мягкой
пшеницы. Электрофорез осуществлялся по общепринятой методике с некоторыми
модификациями.
Результаты стали следующими. Районирование сорта мягкой пшеницы
Казахстана проанализированы по аллелям энзим-кодирующих локусов,
изоферментов PRX, ACP, EST, β-AMY, α-AMY, AAT, ADH, 6-PGD, MDG, ME, GDH,
GPD. Из анализированных локусов полиморфными проявили себя α-AMY 2 (5
аллелей), Prt-4, Acp-1, Est-5, Gpd-1, локусы Aа+1, Adh-1, Est-1, Me, Mdh-1,
Mdh-2 оказались мономорфными. Была построена дендрограмма, показывающая
сходства и различия сортов мягкой пшеницы по энзим-кодирующим локусам.
Обнаружен полиморфизм внутри сортов среди таких сортов как ОПАК-1, Богарная
56 по EST, ACP, PRX, α-AMY, GPD.
Было выявлено редкое сочетание аллелей. В соавторстве с учеными КазНИИЗ
переданы на государственное испытание сорта озимой пшеницы Кастекская
(1997) и Алтыншаш (1999), также ОПАКС-58.
В последнее время уделяется внимание изучению генофонда твердой пшеницы
(Triticum durum Desf). Так исследователями ИФГБР (Института физиологии,
генетики и биоинженерии) проведена работа по сравнительному изучению
генофонда твердой пшеницы, районированные в Казахстане: Безенчукская 139,
Горденформе 254, Кустанайская 52, Наурыз 2, Наурыз 3, Оренбургская 10,
Светлана. Использован метод выделения белков из зрелого зерна. Разделение
белков проходило в вертикальных блоках полиакриламидного геля с последующим
окрашиванием.
В исследованиях проведен электрофоретический анализ изоферментов β-
амилазы, эстеразы, катодной пероксидазы, глюкозы 6-фосфатдегидрогеназы,
глютаматдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, малатдегидрогеназы,
контролируемые соответственно восьми энзим-кодирующими локусами. В итоге
выявлен внутрисортовой полиморфизм сортов по изучаемым ферментным системам.
При этом сорта мономорфные по ряду изоферментам проявляли внутрисортовой
полиморфизм по одному-двум локусам. В результате анализа построена
дендрограмма, показывающая родство исследованных сортов по аллелям данных
локусов.
Работа определяет необходимость комплексного изучения данных сортов для
эффективного выявления доноров и источников хозяйственно-ценных
признаков.[20]
Однозначно, развитие молекулярной биологии позволило основывать
закономерности гена в признаке. Из-за сложности метода изучения
последовательности нуклеотидов ДНК, основное внимание направлено на поиски
белков – специфических маркеров. Первыми такими белками, как уже показано,
стали изоферменты. Исходя из тематики диссертации видно, что в нашем случае
исследуется проблема родства между видами рода Triticum. Очевидно то, что
родственные виды должны иметь сходство по полиморфизму изоферментов,
причем, чем более близкое происхождение имеют виды, тем меньше различий
можно ожидать в изоферментных спектрах .
Белковые системы, вне всяких сомнений, играют важную роль при
воссоздании филогенеза ныне существующих видов в совокупности с другими
методами на морфологическом, цитогенетическом и молекулярном уровнях.
Основываясь на полученные данные, установлено, что существует корреляция
между числом аллелей и молекулярной массой изучаемых полиморфных белков. У
групп живых организмов существует корреляция между уровнем полиморфизма
белков и уровнем гетерозиготности по изучаемым локусам.
Открытие полиморфизма изоферментов позволило проводить генетический
анализ изменчивости многих локусов и генетической структуры природных и
культивируемых популяций животных и растений. Так, израильскими учеными, в
частности Эвиатаром Нево, изучалось генетическое разнообразие дикого ячменя
Hordeum spontaneum L. Было исследовано 28 локусов у 1179 растений 28
популяций. Он сделал вывод, что H.spontaneum в Израиле генетически высоко
полиморфен. Региональное и локальное генетическое разнообразие коррелирует
с климатическими условиями, видами почв. Автором изучено генетическое
разнообразие дикого ячменя из Ирана. Им исследовано 30 локусов у 13
популяций дикого ячменя с помощью электрофореза. Нево показал, что
H.spontaneum из Ирана очень богат генетически; генетическое разнообразие
может резко отличаться от на коротких географических дистанциях.[21]
Еще в начале 80-х годов ученые Томксли и Рик показали блестящий пример
использование изоферментов в качестве генетических маркеров. В результате
их работ была составлена карта генных локусов, контролирующие различные изо-
и аллоферменты у томатов. Распределение соответствующих генов оказалось
неслучайным. В хромосоме 2 идентифицированы два генных кластера, кодирующие
ферменты с одинаковой каталической активностью – Prx - 2, 3, Est - 1, 5, 6,
7, а также локусы Tpi - 2, Pgm - 2 и Adh-1. показано, что многие гены,
кодирующие различные варианты изоферментов, образовались в результате
тандемных дупликаций [22,23].
Подобные данные о локализации генов могут с успехом использоваться в
качестве эффективных генетических маркеров для картирования генов других
изозимов, а также генов, кодирующих морфологические или физиологические
признаки, в том числе устойчивость к патогенам и вредителям. Изоферменты
служат эффективными маркерами для идентификации хромосом. Так изоферментами
маркированы почти все хромосомы пшеницы. Это значительно облегчает
проведение генетического анализа и позволяет исследовать процессы
рекомбиногенеза, изучать происхождение геномов пшеницы.
Геном наиболее распространенного гексаплоидного вида культурной пшеницы
T.aestivum включает три генома диких предковых видов (АА, ВВ, DD), а геном
тетраплоидной твердой пшеницы T.durum – два генома (АА и ВВ). Спор об их
происхождении ведется на протяжении многих лет. Приводятся различные
предположения о предковых видах, родоначальниках геномов А и В. многие
сходятся во мнении, что предковой формой генома D является Aegilops
squarrosa. Это молодой геном T.aestivum.
Геном пшеницы состоит из семи гомеологических групп, каждая из которых
у мягкой пшеницы включает три, а у твердой – две хромосомы. В подобной
ситуации облегчается изучение генетики пшеницы с использованием глиадинов –
запасных белков пшеницы. Связано использование глиадинов тем, что их
электрофоретический спектр не изменяется под влиянием условий выращивания.
Прогресс с локализацией генов, контролирующих синтез глиадинов, тесно
связан с созданием серий анеуплоидных линий яровой китайской пшеницы Чайниз
Спринг [Sears, 1954, 1966] [24,25].
Используя гибридизацию с гаплоидами и мутагенез, он получил серию
нуллисомиков. Затем была создана серия дителосомиков и нуллитетрасомики.
Эти линии использовали Бойд и Ли (Boyd, Lee, 1967) [26] для локализации
генов, кодирующих компоненты глиадинов. Показано, что геном D контролирует
наименее подвижные полосы глиадина. Шефферд [Shepherd, 1968] [27] показал,
что глиадины мягкой пшеницы контролируются хромосомами 1А, 1В, 1D, 6А, 6В и
6D. Блоки запасных белков, контролируемые хромосомами геномов А и В весьма
разнообразны. Сделано предположение, что весь блок имеет общего
предшественника и полиморфизм возник в результате мутаций.
Не требует доказательств то, что основу генетической конституции
организма составляет геном, а именно базовое число хромосом характерное для
половых клеток. Это свойственно всем видам высокоорганизованных животных.
Многие виды растений являются аллополиплоидами: их генотипы представлены
двумя, тремя и более парами разных геномов. В эволюции аллополиплодии
принадлежит важная роль: почти половина видов покрытосеменных растений
представлены аллополиплоидами. Подобную структуру генотипа имеет пшеница,
картофель, рис, хлопчатник, овощные культуры из семейства крестоцветных.
Для селекции аллополиплоидность важна в том, что с конкретными геномами
связаны многие биологические и хозяйственные свойства и признаки растения –
продуктивность и качество урожая, устойчивость к неблагоприятным факторам,
иммунитет.
C целью привлечения нужных геномов, их проявления, необходимы знания
природы геномов и геномных отношений культурных растений с их дикими
сородичами. В подобных случаях значительны методы быстрой и точной
идентификации генома. Решающая роль, несомненно, принадлежит белковым
маркерам [28].
1.3. Изоферменты в изучении происхождения генома пшеницы
В начале литературного обзора уже приводилась сводка о геномном
составе пшеницы. Напомним, что базовое число хромосом у пшеницы и ее
сородичей равно семи. По геномному составу пшеницы делятся на два
эволюционных ряда: turgidum с геномной формулой ААВВ и timopheevii с
геномной формулой ААGG.
До недавнего времени считалось, что источником генома А была дикая
однозернянка T.boeoticum Boiss (2n = 14), генома B-Aegilops speltoides
Tausch (2n = 14) или другие виды секции Sitopsis. Мягкая пшеница возникла
из какой-то тетраплоидной формы, принявшая геном D, диплоидными носителями
которого являются представителями Ae.tauschii Coss (= Ae.squarrosa L).
Касательно генома G, здесь есть неясности, поскольку эквивалентов ему
среди геномов существующих диплоидных сородичей пшеницы найдено не было.
Предполагается, что геном G это измененный в ходе эволюции геном В или
имеет самостоятельное происхождение, но донор или близкие ему сородичи пока
не найдены.
По поводу происхождения геномов А и В, также нет строгих доказательств.
В начале донором первого генома полиплоидной пшеницы считались T.monococcum
L. позднее ученые обратили внимание на дикую диплоидную пшеницу
T.boeoticum. Особенно противоречивы мнения относительно генома В группы
видов эгилопса. Поскольку они наиболее близки к роду Triticum. Сюда относят
Ae.speltoides Tausch., Ae.aucheri Boiss., Ae.longissima schw.et Masch.,
Ae.scharonensis Eig., Ae.bicornis. до недавнего времени не было четкого
представления о том, к какому из перечисленных видов мог принадлежать донор
генома В пшеницы. Относительно генома D гексаплоидной пшеницы сомнений не
было, хотя оставалось под сомнением к какому подвиду Ae.taischii
принадлежит донор этого генома.
Для идентификации геномов пшеницы были использованы признаки
маркирования видоспецифичными белками спиртовой фракции из эндосперма
зрелого зерна. Поиск был проведен на диплоидных сородичах – предполагаемых
донорах геномов полиплоидной пшеницы, то есть однозернянках, видах
эгилопса, несущих геном В и геном D.
Подвергнув анализу геномы однозернянок, а именно T.boeoticum и
T.monococcum и T.urartu, соответственно геномы А и В, в быстрых
электрофоретических компонентах, были выявлены маркеры генома первой группы
однозернянок (Аb) и маркеры генома второй группы (Au). Идентичность
T.boeoticum, T.monococcum по составу геномноспецифических белков
свидетельствует об общем геноме обоих видов [29].
Полагается, что эволюция генома А шла без качественных изменений
преимущественно по пути усложнения за счет увеличения повторов ряда генов и
генетических систем.
Геном T.urartu качественно отличен от генома предыдущих видов. На
отдаленность T.urartu от других однозернянок указывают также различия по
спектрам изозимов кислой фосфотазы и компонентов глиадина. Все это
подтверждает самостоятельность вида T.urartu. По ряду признаков, а именно
по содержанию ДНК в ядре, эффекту гипергибридизации ДНК и гетерогенности
глиадина, геном T.urartu весьма примитивен.
Диплоидные носители генома В. Эгилопсы, среди которых по структуре
электрофоретических спектров глиадина самыми примитивными являются геномы
Ae.bicornis и A.longissima, соответственно Bbi и Bl. Спектры глиадинов
геномов Ae.speltoides и Ae.oucheri неразличимы (геном Bsp). Впоследствии
геномы Ae.speltoides и T. monococcum и T.boeoticum оказались в некоторой
степени сходны. Такие данные позволяют считать, что геномы Bbi , Bl имеют
больше областей гомологии с геномом D, а геном Bsp – с геномом Аb.
Маркерами генома D являются специфические фракции белка и компоненты
глиадина. Эти компоненты характерны для всех представителей Ae.tauschii и
для гексаплоидной пшеницы с геномной формулой AABBDD, контролируемой
хромосомой IDS.
По типу спектров глиадина представители Ae.tauschii разделены на две
группы. Первая группа имеет полный спектр компонентов глиадина и состоит из
представителей Ae.tauschii ssp.strangulata геном подвида Dst.
Вторая группа лишена в спектре глиадина некоторых компонентов. Группа
состоит из представителей Ae.tauschii ssp.tauschii геном Deu. Последний
геном примитивен по сравнению с первым.
Сравнительный анализ видоспецифичных белков полиплоидных видов пшеницы
на гомологичные белки, рассмотренных выше диплоидных сородичей, показал,
что донором генома А в ряду пшеницы turgidum и aestivum была дикая
однозернянка T.urartu или близкая ей форма донором этого генома в ряду
timopheevii – T.boeoticum.
Данные о наличии в пшенице эммера генома А от T.urartu были
подтверждены. Имеются и косвенные доказательства гомологии генома T.urartu
геномам пшениц ряда turgidum и aestivum. В частности T.urartu стоит ближе к
пшенице эммера, тогда как T.boeoticum и T. monococcum – к видам пшеницы
ряда timopheevii. О близости T.urartu к ряду turgidum свидетельствуют
данные сравнительной морфологии.
Проделанная работа позволяет заключить, что источником первого генома
пшеницы ряда timopheevii были представители T.boeoticum, а для видов
пшеницы ряда turgidum и aestivum мог быть представитель T.urartu или
близкая ему форма.
Отмечается, что геном Аb у видов пшеницы ряда timopheevii неодинаков.
Наиболее полно он представлен у T.аraraticum и T.dicoccoides (Ирак), затем
идут T.timonovum, T. zhukovskyi, T.fungicidum и T.timopheevii [30].
По геному А образцы дикой двузернянки T.dicoccoides поделены на две
группы. Первая – иракского происхождения, идентична T.аraraticum и несет
геном Аb, другая - T.dicoccoides (Сирия и Палестина) – идентична T.dicoccum
и содержит геном Au. Один из представителей дикой двузернянки по геномному
составу идентичен T. durum.
Дальнейшие исследования генома Aegilops и ряда timopheevii дало
основания заключить, что источником генома G видов пшеницы группы
timopheevii мог быть Ae.speltoides (геном Bsp), тогда как Ae.longissima
или близкая ему форма могли быть источником генома В для отдельных форм
ряда turgidum и aestivum.
Что же касается генома D гексаплоидных пшениц, то не вызывает сомнений
его происхождение от Ae.tauschii. характерные для генома D от Ae.tauschii
компоненты глиадина обнаружены у всех видов гексаплоидной пшеницы ряда
aestivum.
Косвенным доказательством участия ssp.strangulata в формировании генома
D полиплоидной пшеницы может быть то, что при ресинтезе гексаплоидной
пшеницы из тетраплоидных сортов (ААВВ) наиболее полно восстанавливались
признаки мягкой пшеницы, в частности хлебопекарные свойства муки при
включении генома от ssp.strangulata.
Таким образом, по белкам у вида рода Triticum идентицировано пять
геномов, которые обозначены в соответствии с их происхождением Au, Ab, Bl,
Bsp, Dst. Результаты геномного состава полиплоидной пшеницы по белкам
маркерам дают основание представить геномный состав тетраплоидных пшениц
ряда timopheevii, то есть T.araraticum, T.dicoccoides, T.timopheevii и
T.militinae формулой AbAbBspBsp, ряда turgidum - формулой AuAuBlBl и ряда
aestivum - AuAuBlBl DstDst.
Важным подтверждением данной филогении пшеницы служит то
обстоятельство, что сравнительный анализ видоспецифичных белков диплоидных
носителей генома А и В показал, что к однозернянкам Т.boeoticum и
T.monococcum из видов эгилопса ближе всего стоит Ae.speltoides, а к
однозернянке T.urartu – Ae.longissima.
Подобная биологическая совместимость видов могла быть предпосылкой к
образованию алифидиплоидов с сочетанием геномов А и В. Эти сочетания
геномов и дали два эволюционных ряда полиплоидной пшеницы timopheevii и
turgidum. Гексаплоидная пшеница имеет более позднее происхождение в
сравнении с первичным амфидиплоидом, давшим ряд тетраплоидной пшеницы с
геномной формулой AuAuBlBl
Рассмотренное представление о природе и происхождении геномов пшеницы
служит основой для нового этапа работ по филогении и систематике рода
Triticum, открывает новые возможности поиска исходного материала для нужд
селекции[31]. Согласно данным гексаплоидная пшеница появилась около 10
тысяч лет назад в результате объединения тетроплоидной формы ААВВ с донором
генома D-Ae. Sqyarrosa. Различный уровень изменчивости в сериях блоков,
контролируемых геномами А и В, по сравнению с сериями, контролируемыми
геномом D, может быть объяснен большой селекционной ценностью определенных
блоков 1 D и 6 D. Неоднократному возникнавению гексоплоида ААВВDD могло
способствовать особое влияние генома D на фотосинтез, водный баланс
растения, свойства белков зерна и другие существенные параметры.
Предполагаемые различия компонентного состава глиадинов у тетроплоидных
форм ААВВ может быть следствием полифелитического происхождения диплоидных
доноров с геномами А и В (22). Изучения генетического контроля биосинтеза
запасных белков позволило значительно понять их природу.
Глиадины-белки пшеницы, контролируемые семействами (кластерами) генов,
локализованными у T. Aestivum в коротком плече хромосом 1 А, 1В, 1D, 6А,
6В,6D, а у Т durum в коротком плече хромосом 1А, 1В, 6А, 6В. Открытие
блоков компонентов глиадинов, множественность аллелизма их хромосомной
локализации позволило изучить сопряженность аллельного состояния отдельных
локусов с изменчивостью признаков растений. Индивидуальные белки это
продукты экспрессии структурных генов. Их состав достаточно полно отражает
происхождение генотипа и его индивидуальные особенности, что используется
для сортовой идентификации. Наиболее удобными оказались запасные белки у
злаков. У гексоплоидной пшеницы только глиадины контролируются 6-ю и даже 8-
ю кластерами генов, представленными множественными аллелями. Это позволяет
хорошо дифференцировать генотипы.
Идентификация, классификация и токсономические исследования высших
растений осуществлялись на основе электрофореза не только белков семян, но
и изозимов или обеих систем одновременно. Достаточно четко проявляется
специфика генотипов при определении эстераз из проростков пшеницы.
Комплексное исследование изозимов пероксидазы, (-амилазы,
маликдегидрогеназы, щелочных и кислых фосфатаз, алкогольдегидрогеназы,
лейцинаминопептидазы, глутаматоксалаттрансмилазы, ... продолжение
Вы можете абсолютно на бесплатной основе полностью просмотреть эту работу через наше приложение.
Злаки среди всех семейств цветковых растений занимают особое
положение. К злакам принадлежат основные пищевые растения человечества –
пшеница мягкая (Triticum aestivum), рис посевной (Oryza sativa) и кукуруза
(Zea mays).
Значение злаков в жизни человека велико и многообразно. На первое
место среди всех следует поставить пшеницу, которая по праву считается
основной пищевой культурой человечества [1].
Пшеница – главная зерновая культура мира. По площади, занятой ее
посевами, около 225 миллионов га - пшеница занимает первое место среди
всех культивируемых растений. Она широко возделывается от северных полярных
районов до южных пределов пяти континентов.
Как было уже сказано, среди зерновых культур пшенице принадлежит
ведущее место по занимаемым площадям, а также и валовому сбору зерна.
Дальнейшее увеличение будет идти за счет повышения урожайности на основе
комплексной механизации, за счет новых технологий возделывания этой
культуры и внедрения новых сортов со стабильным урожаем в различные по
метеорологическим условиям годы.
Фундаментальными проблемами являются умение управлять механизмами
мутагенеза, закономерностями формирования в гибридных популяциях. Создание
новых типов растений на основе клеточной и генной инженерии. Знание этих
методов и процессов необходимо для успешного внедрения в практику
достижений генетической науки.
Детальное изучение и описание геномов важнейших зерновых культур
является одним из приоритетных направлений современной генетики растений.
Использование биохимических (молекулярных) маркеров позволяет изучать
генетическое разнообразие зерновых культур, в том числе и пшеницы.
Изменчивость видов пшеницы систематизируют в процессе их ботанико-
географического изучения; генетический потенциал изменчивости раскрывают
при селекционной и генетической работе с видами пшеницы и ее сородичами.
Важное значение в изучении частной генетики пшеницы имеют коллекции
мирового разнообразия видов рода Triticum. В настоящее время наиболее
крупные коллекции сосредоточены во Всероссийском НИИ растениеводства им.
Н.И.Вавилова (Россия, Санкт-Петербург) и в Институте генетики растений и
зародышевой плазмы (США, Белтсвилл). Коллекция ВИРа насчитывает более 60
тысяч образцов пшеницы из более 70 стран мира. Многие коллекции являются
источником хозяйственно-ценных свойств, необходимых в селекции пшеницы [2].
Совсем недавно внимание биологов было привлечено к классу
полимеров-белкам. Известно, что с ними связаны жизненные функции организма.
Одним из возможных путей использования белков является их вовлечение в
разработку филогенетического и генетического анализа, для решения
актуальных проблем прикладной ботаники, генетики и селекции. Особенно
перспективно использование белков в методах молекулярной генетики.
Белки – как генетические маркеры играют важную роль в изучении
наследственной конституции организма и, особенно в оценке исходного и
селекционного материала, поскольку облегчают контроль над включением
желаемых генетических факторов от родительских форм в создаваемые сорта и
гибриды.
Актуальность: Разработка новых научно-обоснованных методов селекции
пшеницы требует подробного исследования генетической природы и структуры
генома. Белковые маркеры играют важную роль в изучении, сохранении и
эффективности использования генетических ресурсов. Изучение генетической
изменчивости диких сородичей злаковых культур является особенно актуальным
для многих генетико-селекционных программ. Знание генетической природы
пшеницы необходимо для генетического улучшения культурной пшеницы.
Цель: изучение генетического разнообразия пшеницы с использованием
биохимических маркеров.
В связи с вышеизложенной целью нами были поставлены следующие задачи:
1. Изучить генетическую изменчивость ди-, тетра- и гексаплоидных видов
пшеницы.
2. Провести сравнительный электрофоретический анализ изоферментов
различных видов Triticum.
3. Раскрыть предполагаемые пути наследования различных генов,
контролирующих изоферментные системы.
Теоретическая значимость: изучение генетического разнообразия пшеницы
является весьма значимым в раскрытии скрытых механизмов в частной генетике
вида. Позволяет детально изучить имеющиеся работы в данной области и тем
самым открывает новые возможности для дальнейших исследований.
Практическая значимость: изучение генетического разнообразия пшеницы,
представляет большую значимость в селекционных работах, при подборе пар для
скрещивания, создании банка генов и др.
Исходная информация: начальной информацией при написании диссертации
служили работы отечественных ученых С.И.Абугалиевой, к.б.н., и
Е.К.Туруспекова, к.б.н.
Методика исследований: электрофоретическое разделение ферментов
белков в полиакриламидном геле (ПААГ) с последующим гистохимическим
окрашиванием.
Ожидаемые результаты: выявить мономорфность по ферментным системам глюкозо-
6-фосфат-дегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы,
аспартатаминотрансферазы.
Проведя сравнительный анализ электрофоретических спектров ферментных
систем, выявить их генетическую изменчивость для различных видов пшеницы.
Публикации: Абугалиева А.И., Абугалиева С.И., Орманбекова Г.Ш.,
Ледовской Ю.С., Есимбекова М.А.
Идентификация, анализ продуктивности и качества зерна сортового
генофонда озимого тритикалеСовременное состояние проблем и достижений
в области генетики и селекции (26-27 марта 2003., Алматы, Казахстан.
Материалы Международной научной конференции, посвященный 100-летию со дня
рождения Н.Л.-Удольской и 70-летию биологического факультета Казахского
Национального Университета им. аль-Фараби, с. 39.
Апробация: Результаты исследований представлены на 2-ой международной
конференции молодых ученых Современные проблемы, генетики, биотехнологии и
селекции растений (Харьков, Украина, 19.05.03).
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Общие положения
Внутривидовая генотипическая изменчивость пшеницы представлена
множеством сортов, коллекционных и природных форм, различающихся по многим
и особенно по селекционно-ценным признакам. Изменчивость описана по типу
развития, по степени зимостойкости, засухоустойчивости, устойчивости к
болезням и вредителям. Известна внутривидовая изменчивость по общему
габитусу растения, типу куста, форме и окраске колоса, по биохимическим и
другим признакам.
Закономерности наследственной (генотипической) изменчивости
проанализированы Н.И.Вавиловым на примере системы изменчивости рода
Triticum. Эти материалы послужили основой для выяснения гомологий и
аналогий в изменчивости видов пшеницы. Исследование системы изменчивости
видов, родов и семейств позволило Н.И. Вавилову сформулировать Закон
гомологических рядов в наследственной изменчивости, который стал началом
сравнительно-генетических исследований и теоретической основой нового
направления в генетике – сравнительной генетике видов, растений.
Пути и методы выявления и поддержания генотипической внутривидовой
изменчивости тесно связаны с биологией размножения вида. Биологии цветения
пшеницы посвящено много экспериментальных работ, обобщенных в обзорах. По
генетической структуре сорта пшеница принадлежит к числу автогамных
(самоопыляющихся) растений. Однако склонность к открытому цветению отмечена
у всех пшениц – больше у гексаплоидных видов, которые имеют значительные
сортовые различия. При определенных условиях у пшеницы возможно частичное
перекрестное опыление, ведущее к спонтанной гибридизации. Замечено, что
спонтанные гибриды чаще возникают у сортов, слабо адаптированных к
агроэкологическим условиям, и у форм мужскистерильных. У пшеницы в
природных и сортовых популяциях спонтанная гибридизация – возникновение
гетерозигот – постоянно сопровождается гомозиготизацией при регулярном
самоопылении. Поэтому сорта и формы пшеницы практически гомозиготны и
представляют собою в генетическом отношении чистолинейные совокупности.
Изучение генетики пшеницы, направленное на выяснение генетических
основ возникновения у нее многообразия, а также установление генетической
детерминации признаков и свойств, идет на основе выделения форм и линий,
различающихся по свойствам и признакам. Изученное генетическое многообразие
рода Triticum представлено в генетических коллекциях, где собраны линии,
маркированные определенными генными мутациями или хромосомными аберрациями.
В селекционных и генетических коллекциях собрано то многообразие, которое
способствует раскрытию системы изменчивости видов, интегрирующей
генетический потенциал видов и рода в целом [2].
Основными путями индуцирования изменчивости и выделения измененных
форм у пшеницы служат: спонтанный и индуцированный мутагенез, внутривидовая
гибридизация, автополиплоидия, анеуплоидия, отдаленная гибридизация
отдаленных экологически форм и близких видов, отдаленных видов и близких
родов (с последующей полиплоидией), замещение хромосом на чужеродные или
введение участков хромосом, а главное, сочетание этих методов. Все
перечисленные пути играют большую роль в возникновении внутривидовой
генотипической изменчивости и создании новых видовых форм.
Среди хлебных злаков род Triticum L. Выделяется наибольшим
полиморфизмом. Все виды пшениц (а их 27) подразделили на две группы,
которые образуют полиплоидный ряд.
I. Диплоидные виды (n = 7), геном А, сюда относится Т.boeoticum
(AbAb); T.urartu (AaAa); T.monococcum (AbAb);
II. Тетраплоидные виды (n = 14) геном А и В, к ним принадлежат
T.dicoccoides (AuAuBB) (дикая полба); T.dicoccum (AuAuBB)
(культурная полба); T.durum (AuAu); T.Poloniсum (AuAuBB);
T.arаrаticum (AbAbGG);
III. Гексаплоидные виды (n = 21), геном A, B и D, сюда относят
T.timopheevii (AbAbAbAbGG); T.aestivum (AuAuBBDD); T.compactum
(AuAuBBDD) [25].
В связи с представлением разнообразия геномного состава пшеницы
возникает вопрос о родстве между видами, закономерности кодирования белка,
совместимости видов до получения новых сортов, линий, а также улучшения уже
имеющихся. Большое значение в этом приобретают белки (ферменты) как
первичный продукт экспрессии гена. Еще в 1935 году Н.И. Вавилов обосновал
необходимость изучения генетики засухоустойчивости. Исследованими отдельных
авторов [3] показано, что засухоустойчивость контролируется полимерными
генами, ограничивающими продуктивность растений. Генкель П.А. (1967)
указал, что засухоустойчивость растений связана с сохранением или
способностью к синтезу белка, который программируется ДНК. Следовательно,
засуха детерминируется генетическим аппаратом [4].
В широком смысле изучение генетики растений началось благодаря
использование разработанного Хантером и Маркертом [5] метода зимограмм.
Метод основан на сочетании высокой разрешающей способности зонального
электрофореза, позволяющего разделять сложные смеси высокомолекулярных
соединений на основании размера и заряда их молекул и гистохимических
приемов проявления ферментативной активности. Электрофоретические варианты
изозимов оказались удобными маркерами в генетических исследованиях [6].
1.2. Применение молекулярных маркеров
Изоферменты – как генетически детерминированные маркеры, кодоминантны
и носят доминантный характер насследования.
Исследование изоферментов позволило значительно развить популяционную
генетику многолетних древесных растений. Так, например, при изучении
полиморфных ферментов по десяти локусам у сосны обыкновенной были
установлены частоты аллелей в выборках двуярусных популяций. По всем
локусам наблюдался множественный аллелизм и найдены четкие межпопуляционные
различия.
Ценность белков и ферментов как генетических маркеров подтверждена
огромным количеством работ [7].
Анализ изоферментов является важным экспериментальным методом в
современной генетике. Каждый тип субъединиц изоферментов продуцируется
особым геном независимо от того, кодируется ли фермент множественными
аллелями в одном локусе или множественными локусами.
Следовательно, если обнаружены субъединицы какого-то определенного
типа, то это не означает, что есть ген, кодирующий их, но что этот ген
активно экспрессируется. Таким образом, субъединица изофермента служит
маркером своего гена.
Использование изоферментов в качестве генетических маркеров удобно в
силу следующих обстоятельств:
1. Изоферменты можно определить в малом объеме, при этом анализировать
много проб одновременно.
2. Аллельные изоферменты проявляются кодоминантно; это означает, что один
аллель не маскирует другой. Таким образом, о генотипе особи можно
судить по фенотипическому признаку – спектру изоферментов.
3. С помощью изоферментного анализа удается выявить сильнейшие мутации,
незаметные при визуальном наблюдении.
4. В силу сложного обмена веществ, морфологические вещества – это обычно
результат взаимодействия многих генных локусов.
Определяя же активность гена по содержанию кодируемого им полипептида,
можно более точно анализировать отдельные генные локусы и при этом избегать
проблем связанных с влиянием других локусов.
Изоферменты не только средство, но и предмет генетических
исследований. Они позволяют выяснить, как кодируется фермент – одним или
несколькими участками по хромосомной карте – и как наследуются
сохраняющиеся при отборе изоферментные варианты, то есть, соответствует ли
тип наследования кодирования фермента множественными локусами [8].
Таким образом, изоферменты как специфические продукты генов являются
хорошими маркерами в изучении генетики пшеницы. Обусловлено такое значение
еще и тем, что ряд белков представлен внутри вида множественными аллельными
вариантами. Гены, кодирующие некоторые белки, собраны в тесно сцепленные
блоки – кластеры, рекомбинация в пределах которых происходит сравнительно
редко или практически не наблюдается. И здесь уже блок (группа белков)
выступает в качестве генетического маркера [9].
Итак, информация о генетическом контроле изоферментов и других белков
в решении задач генетики, селекции, систематики и изучении закономерностей
эволюции.
Изоферменты служат эффективными генетическими маркерами для
идентификации хромосом. Это значительно облегчает проведение генетического
анализа и позволяет исследовать процессы рекомбинации генеза, осуществлять
идентификацию сортов, изучать происхождение геномов пшеницы и т.д.
В настоящее время анализ изоферментов используется для идентификации
субституции и транслокации хромосом одного вида в геном другого. Известны
работы по идентификации с помощью изоферментов генотипов пшеницы с 1В и 1R
транслокациями. Так, И.Рао и М.Рао (I.Rao, M.Rao,1981) использовали
изоферменты алкогольдегидрогеназы в качестве генетических маркеров для
идентификации моносомных и дисомных субституций хромосомы С ржи Империал в
геном пшеницы Чайниз Спринг. Гены, кодирующие эти ферменты, локализованы
соответственно в коротком и длинном плечах хромосомы. В результате
проведенной работы было доказано, что в изучаемом материале имела место
замена в пшеничном геноме плеча хромосомы 4А пшеницы на длинное плечо
хромосомы С ржи [10].
Обратимся еще к нескольким работам, в которых тем или иным образом
раскрываются перспективы использования изоферментов как генетических
маркеров в исследовании генетики растений.
Так, в работе Бияшева Р.М. (автореферат диссертации кандидата
биологических наук) изучался полиморфизм изоферментов ячменя и возможные
пути его использования в селекционно-генетических исследованиях. В работе
изучен генетический контроль полиморфных систем 6-
фосфоглюконатдегидрогенозы, пероксидазы, лейцинаминопептидазы из зрелого
зерна ячменя также определены частоты встречаемости и ареалы аллелей,
контролирующих ферментные системы 6-PGD, EST, PRX, кислой фосфатазы и α-
амилазы у селекционных и местных сортов ячменя.
Идентифицированы и локализованы генетические факторы Pgd 2, ген Pgd-2
контралирует систему 6-фосфоглюканатдегидрогеназы ячменя, и локализован в
длинном плече хромосомы 5. Также показано, что изоферменты кодируемые
локусами Pgd-3, Prx-1, Lap-1 ведут себя как менделирующие признаки с
кодоминантным типом наследования. Это открывает широкие возможности путей
повышения урожайности ячменя, подбора пар для гибридизации и отбора
генотипов с комплексом необходимых признаков и свойств [11].
Изоферменты как биохимические маркеры генов нашли применение в
изучении генетической структуры популяций, филогенетических взаимоотношений
различных видов и групп растений.
Полиморфизм по локусам, контролирующим синтез ферментов, приводит к
накоплению в популяции определенного количества генетически
детерминированных типов ферментов. Источником разнообразия ферментов
является мутационный процесс и внутригенные рекомбинации.
Кинг и Аллорд (1972) описали частоту аллельных путей различных
локусов, контролирующих синтез эстераз, пероксидаз и фосфотаз в
четырнадцати популяциях овса [12].
Использовали изоферментные различия для выявления филогенетических
связей в определении рода Truticum. Изучая изоферментные спектры
алкогольдегидрогенозы и эстеразы 1, в экстрактах сухих семян диплоидных,
тетраплоидных, гексаплоидных и октаплоидных пшениц, обнаружено, что число
зон ферментативной активности возрастает с уровнем плоидности за счет
сочетания родительских вариантов фермента с гибридными зонами,
образующимися при гетеромономерной ассоциации. Харт (1970) исследовал
алкогольдегидрогеназу у гексаплоидных пшениц. При электрофорезе он выявил
три зоны активности ADG, установил, что гены, контролирующие синтез ADG,
локализованы в хромосомах 4А, 4В, 4D, то есть гомеологичных хромосомах,
полученных от трех диплоидных предков [13].
Немаловажную роль играют исследования по геному пшеницы с участием
изоферментов как белковых маркеров. Так ученым из Японии была предпринята
оценка эволюции пшеницы по продуктам экспрессии. Проблема заключалась в
следующем – выявление роли дупликации генов в эволюции и адаптации видов
культурных растений. Проводилось изучение спектров α-амилазы в проростках
замещенных линий пшеницы сорта Чайниз спринг и Аe.squarrosa. гены в α-AMY
расположены в хромосомах 6D, 6B, 7A, 7B и 7D. Интересно то, что α-AMY
хромосом группы 6 при прорастании активируются первыми. С использованием
электрофореза был исследован генетический контроль различных форм
липоксигенеза, эндопептидазы, кислой фосфотазы, аминопептидазы и
алкогольдегидрогеназы гексаплоидной пшеницы. Выявлено расположение 22
структурных генов в хромосомах. Отмечены существенные различия в изозимах,
кодируемых гомеологическими группами хромосом, что указывает на дивергенную
наследственность нуклеотидов структурных генов [14].
Благодаря изменчивости, позволительно находить генетические маркеры, с
которыми связаны те или иные внешние признаки (скрытая генетическая
изменчивость). Это выгодно в том, что на основании спектров белков возможна
классификация культивируемых сортов и включение в создаваемые сорта
желаемых признаков качества. Наличие маркерных белков обуславливает
возможность биохимически оценить родство сортов и биотипов пшеницы, а в
пределах ареала выделить генетические группы биотипов. Таким образом,
наследование продуктов экспрессии может оказаться весьма полезным при
определении филогенетических связей различных видов пшеницы и родства
сортов.
Обратимся к работам наших отечественных ученых, в которых идет речь о
генетической изменчивости видов Triticum и Aegilops на основе
электрофоретического анализа .
Рассмотрим работу к.б.н. С.И. Абугалиевой. Материалом для исследований
в которой служили диплоидные и полиплоидные виды Aegilops и Triticum.
Электрофоретическое разделение ферментных систем проводили в вертикальных
блоках полиакриламидного геля с использованием трис-аллюминий-лактатной
буферных систем, с последующим гистохимическим окрашиванием.
В работе разрешаются вопросы происхождения пшеницы и ее родство c
родственными видами. В исследовании изоферментные системы эстеразы (EST),
аспартатаминотрансферазы (ААТ), алкогольдугидрогеназы (ADH),
малатдегидрогеназы (MDH), глутаматдегидрогеназы (GDH), глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназы (GPD), катодной пероксидазы (PRX) и кислой фосфатазы
(ACP), кодируемые локусами Est 1, Est 5, Aat 1, Mdh 1, Mdh 2, Gdh 1, Gpd 1,
Prx и Acp 4, использовались в качестве молекулярных маркеров в изучении
генетической изменчивости видов Triticum и Aegilops. Было обнаружена
мономорфность по ферментным системам аспартатаминотрансферазы,
алкогольдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы и глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназы, что, по словам автора, свидетельствует в пользу
стабильности их экспрессии в ходе эволюции. Сравнительный же анализ
спектров малатдегидрогеназы, эстеразы и кислой фосфатазы позволил выявить
их генетическую изменчивость для диплоидных и полиплоидных видов пшеницы с
различным сочетанием геномов [15].
Различие между видами в данном случае заключалось в наличииотсутствии
зон активности изоферментов или различной электрофоретической подвижности.
Был выявлен межвидовой полиморфизм T.urаrtu, T.boeoticum и T.monococcum по
электрофоретической подвижности изоферментов эстеразы 1.
В тоже время спектры Est 1 тетраплоидных и гексаплоидных видов пшеницы
оказались сходными и включали в себя зоны ферментативной активности,
характерные для T.monococcum и T.boeoticum.
Также проведенный анализ предполагает возможные пути наследования
генов, контролирующих изоферментные системы на различных этапах эволюции
пшеницы [16].
Метод электрофоретического анализа белков и ферментов является
перспективным для оценки генетической изменчивости. Совокупность белков при
электрофорезе несет ценную информацию о структуре генома, кодирующего эти
белки. Белки-маркеры позволяют наряду с изменчивостью структурных генов,
выявить различную активность регуляторных генов, что отражается в виде
изменения количественного состояния фракций. Это соотношение
рассматривается как количественный признак.
Ученым Н.И. Балашовой с сотрудниками изучена закономерность изменения
активности изопероксидаз растений важнейших сельскохозяйственных культур
[17].
Работа проводилась на контрольных по жаростойкости сортах томатов,
кукурузы, тритикале, сои.
Анализировали семи-, восьмидневные проростки, листья со среднего яруса.
Электрофорез проводили в вертикальных пластинах ПААГ по Дэвису. Показано,
что в электрофоретическом спектре пероксидаз, часть зон является стабильной
и сохраняет активность при определенном времени воздействия высоких
температур. Установлена различная скорость дезактивации фермента
пероксидазы проростков изучаемых сортов томата. Показано, что у
относительно жаростойких сортов изменение активности изопероскидазы в два
раза меньше, чем у неустойчивых, то есть, подтверждена версия, что у
жаростойких более устойчивая ферментная система.
Таким образом, метод электрофореза может быть использован для отбора
жаростойких генотипов.
Вернемся рассмотрению генетических маркеров пшеницы. Идентификация
генотипа представляет важную задачу генетики и селекции. Широкие
возможности открывает использование молекулярных генетических маркеров.
Анализ ряда полиморфных ферментных систем позволяет выявить новый пласт
наследственной изменчивости и дифференцировать фенотипически неразличимые
на уровне морфологических маркеров. Наиболее полиморфными среди белков у
пшеницы является – фракция белка зерновки – глиадин. Методами молекулярной
биологии показано, что в генетике мягкой пшеницы содержится от 50 до 300
глиадин-кодирующих последовательностей ДНК, имеющих разную степень
гомологии. Анализ наследования компонентов глиадина у многих сортов дает
предположение, что большинство глиадин-кодирующих генов любого сорта или
генотипа собрано в 6 кластеров. С помощью генетического картирования
установлено, что эти кластеры расположены в хромосомах 1А, 1В, 1D, 6А, 6В и
6D. Гены, находящиеся в одном кластере контролируют синтез определенной
группы компонентов глиадина [18].
Компоненты входящие в блок, наследуются совместно как простой
менделирующий признак, по каждому глиадин-контролирующему локусу
наблюдается множественный аллелизм, то есть существует 6 серий аллельных
вариантов блоков. Для генетики важным представляется то, что разные
аллельные варианты одного и того же кластера имеют различное количество
функционирующих генов. В связи с этим интересен вопрос об аллельных генах,
входящих в состав аллельных вариантов кластеров. Существование полиморфизма
внутри вида по глиадину гарантирует выявление необходимых генотипов при
семеноводстве, также обеспечивает контроль для исследований на пшенице,
связанного со сравнением генотипов до и после эксперимента.
Глиадин кодирующие гены можно успешно использовать для маркирования
хозяйственно-ценных признаков у пшеницы, выявить важные закономерности
формирования оптимального генотипа в селекционной работе.
Обратимся еще к работе наших отечественных ученых. Учеными С.И.
Абугалиевой, Р.М. Бияшевым, Е.В. Кожемякиным [30] изучался полиморфизм
ферментых белков пшеницы. В данной работе проводилось сравнение четырех
сортов озимой пшеницы, представленных 364 линиями, по электрофоретическим
вариантам следующих ферментных систем: катодной перосикдазы, α-амилазы и
глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы. Электрофорез проводили в вертикальных блоках
ПААГ.
В исследовании было выявлено для катодной перосикдазы два
фенотипических варианта. По энзимной системе среди 115 линий сорта Богорная
56 было выявлено 18 вариантных линий, сорта Безостая-1, ОПАКС-1 и
Кооператорка оказались инвариантными. По пероксидазе выявлено четыре-пять
зон активности фермента. Анализ материала позволил выявить два
фенотипических варианта, различающиеся по электрофоретической подвижности
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Сдвиг зон активности у всех наблюдался на
одинаковое расстояние.
Авторами было предположено, что эти зоны активности глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназы контролируются одним возможно полиаллельным локусом.
Также в работе отмечен большой уровень полиморфизма для α-амилазы. Было
выявлено 5 типов спектра для α-амилазы. Все сорта, кроме Кооператорки,
оказались полиморфными по данной ферментной системе. В заключении
говорится, что данные эксперимента показывают важность применения
ферментных систем катодной пероксидазы, α-амилазы и глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназы в генетических исследованиях сортовых форм,
установления подлинности и чистоты семян сортов пшеницы, для выяснения их
генеалогий.
В последнее время перспективным методом в современной биологии
является метод культуры клеток и тканей растений, однако в данных
исследованиях возникает проблема оценки генетической изменчивости и ее
влиянии на селектируемые признаки. В работе Е.К. Туруспекова, Р.М. Бияшева,
Ж. Джардемалиева и М.К. Карабаева проводился анализ генетически
обусловленной изменчивости клеток посредством маркерных признаков у
растений регенерантов [19]. В качестве таких признаков использовались
ферментные системы малатдегидрогеназы, эстеразы, катодной пероксидазы,
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы из тканей зерна
пшеницы. Изменчивость оценивалась по электрофоретическим фенотипам
указанных выше энзимных систем. Всего было скринировано 125 растений-
регенрантов сорта Заря; 54 - сорта Лютесценс и 56 – сорта Коопператорка.
Выявлены растения-регенеранты, отличающиеся от исходных форм по
изоферментам GPD, MDH, EST, PRX, а ADH оказалось инвариантным. По системам
PRX EST изменчивость характеризовалась появлением или исчезновением
активности.
Таким образом, с помощью данных ферментных систем можно маркировать и
даже локализовать генетическую нестабильность культивируемых клеток и
тканей на уровне растений-регенрантов, так как известен генетический
контроль данных изоферментов и место локализации генов экспрессии на
хромосомах.
В одной из работ С.И. Абугалиевой приводится пример использования
молекулярных маркеров при идентификации сортов и линий, отборе генотипов и
создании новых сортов мягкой пшеницы [20].
В работе использовались районирование сорта, дигаплоидные линии мягкой
пшеницы. Электрофорез осуществлялся по общепринятой методике с некоторыми
модификациями.
Результаты стали следующими. Районирование сорта мягкой пшеницы
Казахстана проанализированы по аллелям энзим-кодирующих локусов,
изоферментов PRX, ACP, EST, β-AMY, α-AMY, AAT, ADH, 6-PGD, MDG, ME, GDH,
GPD. Из анализированных локусов полиморфными проявили себя α-AMY 2 (5
аллелей), Prt-4, Acp-1, Est-5, Gpd-1, локусы Aа+1, Adh-1, Est-1, Me, Mdh-1,
Mdh-2 оказались мономорфными. Была построена дендрограмма, показывающая
сходства и различия сортов мягкой пшеницы по энзим-кодирующим локусам.
Обнаружен полиморфизм внутри сортов среди таких сортов как ОПАК-1, Богарная
56 по EST, ACP, PRX, α-AMY, GPD.
Было выявлено редкое сочетание аллелей. В соавторстве с учеными КазНИИЗ
переданы на государственное испытание сорта озимой пшеницы Кастекская
(1997) и Алтыншаш (1999), также ОПАКС-58.
В последнее время уделяется внимание изучению генофонда твердой пшеницы
(Triticum durum Desf). Так исследователями ИФГБР (Института физиологии,
генетики и биоинженерии) проведена работа по сравнительному изучению
генофонда твердой пшеницы, районированные в Казахстане: Безенчукская 139,
Горденформе 254, Кустанайская 52, Наурыз 2, Наурыз 3, Оренбургская 10,
Светлана. Использован метод выделения белков из зрелого зерна. Разделение
белков проходило в вертикальных блоках полиакриламидного геля с последующим
окрашиванием.
В исследованиях проведен электрофоретический анализ изоферментов β-
амилазы, эстеразы, катодной пероксидазы, глюкозы 6-фосфатдегидрогеназы,
глютаматдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, малатдегидрогеназы,
контролируемые соответственно восьми энзим-кодирующими локусами. В итоге
выявлен внутрисортовой полиморфизм сортов по изучаемым ферментным системам.
При этом сорта мономорфные по ряду изоферментам проявляли внутрисортовой
полиморфизм по одному-двум локусам. В результате анализа построена
дендрограмма, показывающая родство исследованных сортов по аллелям данных
локусов.
Работа определяет необходимость комплексного изучения данных сортов для
эффективного выявления доноров и источников хозяйственно-ценных
признаков.[20]
Однозначно, развитие молекулярной биологии позволило основывать
закономерности гена в признаке. Из-за сложности метода изучения
последовательности нуклеотидов ДНК, основное внимание направлено на поиски
белков – специфических маркеров. Первыми такими белками, как уже показано,
стали изоферменты. Исходя из тематики диссертации видно, что в нашем случае
исследуется проблема родства между видами рода Triticum. Очевидно то, что
родственные виды должны иметь сходство по полиморфизму изоферментов,
причем, чем более близкое происхождение имеют виды, тем меньше различий
можно ожидать в изоферментных спектрах .
Белковые системы, вне всяких сомнений, играют важную роль при
воссоздании филогенеза ныне существующих видов в совокупности с другими
методами на морфологическом, цитогенетическом и молекулярном уровнях.
Основываясь на полученные данные, установлено, что существует корреляция
между числом аллелей и молекулярной массой изучаемых полиморфных белков. У
групп живых организмов существует корреляция между уровнем полиморфизма
белков и уровнем гетерозиготности по изучаемым локусам.
Открытие полиморфизма изоферментов позволило проводить генетический
анализ изменчивости многих локусов и генетической структуры природных и
культивируемых популяций животных и растений. Так, израильскими учеными, в
частности Эвиатаром Нево, изучалось генетическое разнообразие дикого ячменя
Hordeum spontaneum L. Было исследовано 28 локусов у 1179 растений 28
популяций. Он сделал вывод, что H.spontaneum в Израиле генетически высоко
полиморфен. Региональное и локальное генетическое разнообразие коррелирует
с климатическими условиями, видами почв. Автором изучено генетическое
разнообразие дикого ячменя из Ирана. Им исследовано 30 локусов у 13
популяций дикого ячменя с помощью электрофореза. Нево показал, что
H.spontaneum из Ирана очень богат генетически; генетическое разнообразие
может резко отличаться от на коротких географических дистанциях.[21]
Еще в начале 80-х годов ученые Томксли и Рик показали блестящий пример
использование изоферментов в качестве генетических маркеров. В результате
их работ была составлена карта генных локусов, контролирующие различные изо-
и аллоферменты у томатов. Распределение соответствующих генов оказалось
неслучайным. В хромосоме 2 идентифицированы два генных кластера, кодирующие
ферменты с одинаковой каталической активностью – Prx - 2, 3, Est - 1, 5, 6,
7, а также локусы Tpi - 2, Pgm - 2 и Adh-1. показано, что многие гены,
кодирующие различные варианты изоферментов, образовались в результате
тандемных дупликаций [22,23].
Подобные данные о локализации генов могут с успехом использоваться в
качестве эффективных генетических маркеров для картирования генов других
изозимов, а также генов, кодирующих морфологические или физиологические
признаки, в том числе устойчивость к патогенам и вредителям. Изоферменты
служат эффективными маркерами для идентификации хромосом. Так изоферментами
маркированы почти все хромосомы пшеницы. Это значительно облегчает
проведение генетического анализа и позволяет исследовать процессы
рекомбиногенеза, изучать происхождение геномов пшеницы.
Геном наиболее распространенного гексаплоидного вида культурной пшеницы
T.aestivum включает три генома диких предковых видов (АА, ВВ, DD), а геном
тетраплоидной твердой пшеницы T.durum – два генома (АА и ВВ). Спор об их
происхождении ведется на протяжении многих лет. Приводятся различные
предположения о предковых видах, родоначальниках геномов А и В. многие
сходятся во мнении, что предковой формой генома D является Aegilops
squarrosa. Это молодой геном T.aestivum.
Геном пшеницы состоит из семи гомеологических групп, каждая из которых
у мягкой пшеницы включает три, а у твердой – две хромосомы. В подобной
ситуации облегчается изучение генетики пшеницы с использованием глиадинов –
запасных белков пшеницы. Связано использование глиадинов тем, что их
электрофоретический спектр не изменяется под влиянием условий выращивания.
Прогресс с локализацией генов, контролирующих синтез глиадинов, тесно
связан с созданием серий анеуплоидных линий яровой китайской пшеницы Чайниз
Спринг [Sears, 1954, 1966] [24,25].
Используя гибридизацию с гаплоидами и мутагенез, он получил серию
нуллисомиков. Затем была создана серия дителосомиков и нуллитетрасомики.
Эти линии использовали Бойд и Ли (Boyd, Lee, 1967) [26] для локализации
генов, кодирующих компоненты глиадинов. Показано, что геном D контролирует
наименее подвижные полосы глиадина. Шефферд [Shepherd, 1968] [27] показал,
что глиадины мягкой пшеницы контролируются хромосомами 1А, 1В, 1D, 6А, 6В и
6D. Блоки запасных белков, контролируемые хромосомами геномов А и В весьма
разнообразны. Сделано предположение, что весь блок имеет общего
предшественника и полиморфизм возник в результате мутаций.
Не требует доказательств то, что основу генетической конституции
организма составляет геном, а именно базовое число хромосом характерное для
половых клеток. Это свойственно всем видам высокоорганизованных животных.
Многие виды растений являются аллополиплоидами: их генотипы представлены
двумя, тремя и более парами разных геномов. В эволюции аллополиплодии
принадлежит важная роль: почти половина видов покрытосеменных растений
представлены аллополиплоидами. Подобную структуру генотипа имеет пшеница,
картофель, рис, хлопчатник, овощные культуры из семейства крестоцветных.
Для селекции аллополиплоидность важна в том, что с конкретными геномами
связаны многие биологические и хозяйственные свойства и признаки растения –
продуктивность и качество урожая, устойчивость к неблагоприятным факторам,
иммунитет.
C целью привлечения нужных геномов, их проявления, необходимы знания
природы геномов и геномных отношений культурных растений с их дикими
сородичами. В подобных случаях значительны методы быстрой и точной
идентификации генома. Решающая роль, несомненно, принадлежит белковым
маркерам [28].
1.3. Изоферменты в изучении происхождения генома пшеницы
В начале литературного обзора уже приводилась сводка о геномном
составе пшеницы. Напомним, что базовое число хромосом у пшеницы и ее
сородичей равно семи. По геномному составу пшеницы делятся на два
эволюционных ряда: turgidum с геномной формулой ААВВ и timopheevii с
геномной формулой ААGG.
До недавнего времени считалось, что источником генома А была дикая
однозернянка T.boeoticum Boiss (2n = 14), генома B-Aegilops speltoides
Tausch (2n = 14) или другие виды секции Sitopsis. Мягкая пшеница возникла
из какой-то тетраплоидной формы, принявшая геном D, диплоидными носителями
которого являются представителями Ae.tauschii Coss (= Ae.squarrosa L).
Касательно генома G, здесь есть неясности, поскольку эквивалентов ему
среди геномов существующих диплоидных сородичей пшеницы найдено не было.
Предполагается, что геном G это измененный в ходе эволюции геном В или
имеет самостоятельное происхождение, но донор или близкие ему сородичи пока
не найдены.
По поводу происхождения геномов А и В, также нет строгих доказательств.
В начале донором первого генома полиплоидной пшеницы считались T.monococcum
L. позднее ученые обратили внимание на дикую диплоидную пшеницу
T.boeoticum. Особенно противоречивы мнения относительно генома В группы
видов эгилопса. Поскольку они наиболее близки к роду Triticum. Сюда относят
Ae.speltoides Tausch., Ae.aucheri Boiss., Ae.longissima schw.et Masch.,
Ae.scharonensis Eig., Ae.bicornis. до недавнего времени не было четкого
представления о том, к какому из перечисленных видов мог принадлежать донор
генома В пшеницы. Относительно генома D гексаплоидной пшеницы сомнений не
было, хотя оставалось под сомнением к какому подвиду Ae.taischii
принадлежит донор этого генома.
Для идентификации геномов пшеницы были использованы признаки
маркирования видоспецифичными белками спиртовой фракции из эндосперма
зрелого зерна. Поиск был проведен на диплоидных сородичах – предполагаемых
донорах геномов полиплоидной пшеницы, то есть однозернянках, видах
эгилопса, несущих геном В и геном D.
Подвергнув анализу геномы однозернянок, а именно T.boeoticum и
T.monococcum и T.urartu, соответственно геномы А и В, в быстрых
электрофоретических компонентах, были выявлены маркеры генома первой группы
однозернянок (Аb) и маркеры генома второй группы (Au). Идентичность
T.boeoticum, T.monococcum по составу геномноспецифических белков
свидетельствует об общем геноме обоих видов [29].
Полагается, что эволюция генома А шла без качественных изменений
преимущественно по пути усложнения за счет увеличения повторов ряда генов и
генетических систем.
Геном T.urartu качественно отличен от генома предыдущих видов. На
отдаленность T.urartu от других однозернянок указывают также различия по
спектрам изозимов кислой фосфотазы и компонентов глиадина. Все это
подтверждает самостоятельность вида T.urartu. По ряду признаков, а именно
по содержанию ДНК в ядре, эффекту гипергибридизации ДНК и гетерогенности
глиадина, геном T.urartu весьма примитивен.
Диплоидные носители генома В. Эгилопсы, среди которых по структуре
электрофоретических спектров глиадина самыми примитивными являются геномы
Ae.bicornis и A.longissima, соответственно Bbi и Bl. Спектры глиадинов
геномов Ae.speltoides и Ae.oucheri неразличимы (геном Bsp). Впоследствии
геномы Ae.speltoides и T. monococcum и T.boeoticum оказались в некоторой
степени сходны. Такие данные позволяют считать, что геномы Bbi , Bl имеют
больше областей гомологии с геномом D, а геном Bsp – с геномом Аb.
Маркерами генома D являются специфические фракции белка и компоненты
глиадина. Эти компоненты характерны для всех представителей Ae.tauschii и
для гексаплоидной пшеницы с геномной формулой AABBDD, контролируемой
хромосомой IDS.
По типу спектров глиадина представители Ae.tauschii разделены на две
группы. Первая группа имеет полный спектр компонентов глиадина и состоит из
представителей Ae.tauschii ssp.strangulata геном подвида Dst.
Вторая группа лишена в спектре глиадина некоторых компонентов. Группа
состоит из представителей Ae.tauschii ssp.tauschii геном Deu. Последний
геном примитивен по сравнению с первым.
Сравнительный анализ видоспецифичных белков полиплоидных видов пшеницы
на гомологичные белки, рассмотренных выше диплоидных сородичей, показал,
что донором генома А в ряду пшеницы turgidum и aestivum была дикая
однозернянка T.urartu или близкая ей форма донором этого генома в ряду
timopheevii – T.boeoticum.
Данные о наличии в пшенице эммера генома А от T.urartu были
подтверждены. Имеются и косвенные доказательства гомологии генома T.urartu
геномам пшениц ряда turgidum и aestivum. В частности T.urartu стоит ближе к
пшенице эммера, тогда как T.boeoticum и T. monococcum – к видам пшеницы
ряда timopheevii. О близости T.urartu к ряду turgidum свидетельствуют
данные сравнительной морфологии.
Проделанная работа позволяет заключить, что источником первого генома
пшеницы ряда timopheevii были представители T.boeoticum, а для видов
пшеницы ряда turgidum и aestivum мог быть представитель T.urartu или
близкая ему форма.
Отмечается, что геном Аb у видов пшеницы ряда timopheevii неодинаков.
Наиболее полно он представлен у T.аraraticum и T.dicoccoides (Ирак), затем
идут T.timonovum, T. zhukovskyi, T.fungicidum и T.timopheevii [30].
По геному А образцы дикой двузернянки T.dicoccoides поделены на две
группы. Первая – иракского происхождения, идентична T.аraraticum и несет
геном Аb, другая - T.dicoccoides (Сирия и Палестина) – идентична T.dicoccum
и содержит геном Au. Один из представителей дикой двузернянки по геномному
составу идентичен T. durum.
Дальнейшие исследования генома Aegilops и ряда timopheevii дало
основания заключить, что источником генома G видов пшеницы группы
timopheevii мог быть Ae.speltoides (геном Bsp), тогда как Ae.longissima
или близкая ему форма могли быть источником генома В для отдельных форм
ряда turgidum и aestivum.
Что же касается генома D гексаплоидных пшениц, то не вызывает сомнений
его происхождение от Ae.tauschii. характерные для генома D от Ae.tauschii
компоненты глиадина обнаружены у всех видов гексаплоидной пшеницы ряда
aestivum.
Косвенным доказательством участия ssp.strangulata в формировании генома
D полиплоидной пшеницы может быть то, что при ресинтезе гексаплоидной
пшеницы из тетраплоидных сортов (ААВВ) наиболее полно восстанавливались
признаки мягкой пшеницы, в частности хлебопекарные свойства муки при
включении генома от ssp.strangulata.
Таким образом, по белкам у вида рода Triticum идентицировано пять
геномов, которые обозначены в соответствии с их происхождением Au, Ab, Bl,
Bsp, Dst. Результаты геномного состава полиплоидной пшеницы по белкам
маркерам дают основание представить геномный состав тетраплоидных пшениц
ряда timopheevii, то есть T.araraticum, T.dicoccoides, T.timopheevii и
T.militinae формулой AbAbBspBsp, ряда turgidum - формулой AuAuBlBl и ряда
aestivum - AuAuBlBl DstDst.
Важным подтверждением данной филогении пшеницы служит то
обстоятельство, что сравнительный анализ видоспецифичных белков диплоидных
носителей генома А и В показал, что к однозернянкам Т.boeoticum и
T.monococcum из видов эгилопса ближе всего стоит Ae.speltoides, а к
однозернянке T.urartu – Ae.longissima.
Подобная биологическая совместимость видов могла быть предпосылкой к
образованию алифидиплоидов с сочетанием геномов А и В. Эти сочетания
геномов и дали два эволюционных ряда полиплоидной пшеницы timopheevii и
turgidum. Гексаплоидная пшеница имеет более позднее происхождение в
сравнении с первичным амфидиплоидом, давшим ряд тетраплоидной пшеницы с
геномной формулой AuAuBlBl
Рассмотренное представление о природе и происхождении геномов пшеницы
служит основой для нового этапа работ по филогении и систематике рода
Triticum, открывает новые возможности поиска исходного материала для нужд
селекции[31]. Согласно данным гексаплоидная пшеница появилась около 10
тысяч лет назад в результате объединения тетроплоидной формы ААВВ с донором
генома D-Ae. Sqyarrosa. Различный уровень изменчивости в сериях блоков,
контролируемых геномами А и В, по сравнению с сериями, контролируемыми
геномом D, может быть объяснен большой селекционной ценностью определенных
блоков 1 D и 6 D. Неоднократному возникнавению гексоплоида ААВВDD могло
способствовать особое влияние генома D на фотосинтез, водный баланс
растения, свойства белков зерна и другие существенные параметры.
Предполагаемые различия компонентного состава глиадинов у тетроплоидных
форм ААВВ может быть следствием полифелитического происхождения диплоидных
доноров с геномами А и В (22). Изучения генетического контроля биосинтеза
запасных белков позволило значительно понять их природу.
Глиадины-белки пшеницы, контролируемые семействами (кластерами) генов,
локализованными у T. Aestivum в коротком плече хромосом 1 А, 1В, 1D, 6А,
6В,6D, а у Т durum в коротком плече хромосом 1А, 1В, 6А, 6В. Открытие
блоков компонентов глиадинов, множественность аллелизма их хромосомной
локализации позволило изучить сопряженность аллельного состояния отдельных
локусов с изменчивостью признаков растений. Индивидуальные белки это
продукты экспрессии структурных генов. Их состав достаточно полно отражает
происхождение генотипа и его индивидуальные особенности, что используется
для сортовой идентификации. Наиболее удобными оказались запасные белки у
злаков. У гексоплоидной пшеницы только глиадины контролируются 6-ю и даже 8-
ю кластерами генов, представленными множественными аллелями. Это позволяет
хорошо дифференцировать генотипы.
Идентификация, классификация и токсономические исследования высших
растений осуществлялись на основе электрофореза не только белков семян, но
и изозимов или обеих систем одновременно. Достаточно четко проявляется
специфика генотипов при определении эстераз из проростков пшеницы.
Комплексное исследование изозимов пероксидазы, (-амилазы,
маликдегидрогеназы, щелочных и кислых фосфатаз, алкогольдегидрогеназы,
лейцинаминопептидазы, глутаматоксалаттрансмилазы, ... продолжение
Вы можете абсолютно на бесплатной основе полностью просмотреть эту работу через наше приложение.
Похожие работы
Дисциплины
- Информатика
- Банковское дело
- Оценка бизнеса
- Бухгалтерское дело
- Валеология
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Религия
- Общая история
- Журналистика
- Таможенное дело
- История Казахстана
- Финансы
- Законодательство и Право, Криминалистика
- Маркетинг
- Культурология
- Медицина
- Менеджмент
- Нефть, Газ
- Искуство, музыка
- Педагогика
- Психология
- Страхование
- Налоги
- Политология
- Сертификация, стандартизация
- Социология, Демография
- Статистика
- Туризм
- Физика
- Философия
- Химия
- Делопроизводсто
- Экология, Охрана природы, Природопользование
- Экономика
- Литература
- Биология
- Мясо, молочно, вино-водочные продукты
- Земельный кадастр, Недвижимость
- Математика, Геометрия
- Государственное управление
- Архивное дело
- Полиграфия
- Горное дело
- Языковедение, Филология
- Исторические личности
- Автоматизация, Техника
- Экономическая география
- Международные отношения
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности), Защита труда
