ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ РЕПАРАЦИИ ДНК (XRCC1 И XRCC3) СРЕДИ ЖИТЕЛЕЙ, ПРОЖИВАЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ БЫВШЕГО СЕМИПАЛАТИНСКОГО ЯДЕРНОГО ПОЛИГОНА

Тип работы: Дипломная работа
Бесплатно: Антиплагиат
Объем: 37 страниц
В избранное:

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ
РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ИМЕНИ АЛЬ-ФАРАБИ

Биологический факультет

Кафедра генетики и молекулярной биологии

ВЫПУСКНАЯ РАБОТА

Изучение полиморфизма генов репарации ДНК (XRCC1 И XRCC3) среди жителей,
проживающих на территории бывШего Семипалатинского ядерного полигона

Исполнитель
Студентка 4 курса Хамдиева О.Х.

Научный руководитель
PhD,
старший преподаватель ________________ Алтынова Н.К.

Нормоконтролёр Сатылган И.А.

Допущен к защите
зав. кафедрой,
профессор, д.б.н.
Айташева З.Г.

Алматы, 2010
СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 3

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5
1.1 Воздействие радиации на организм 5
1.2 Радиационно-индуцированные хромосомные аберрации 9
1.3 Генные мутации 12
1.4 Репарация 13
1.5 Гены репарации как система защиты 14
1.5.1Ген XRCC1 14
1.5.2Ген XRCC3 16
1.6 Индивидуальная радиочувствительность 17
1.7 Минисателлитные мутации 19
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 21
2.1 Объекты исследования 21
2.1.1Выделение ДНК фенол – хлороформным методом 21
2.1.2Электрофорез 21
2.1.3Метод полимеразной цепной реакции 22
2.1.4Рестрикционный анализ 24
2.1.5Статистическая обработка результатов 25

3 Результаты и обсуждение 27
3.1 Изучение полиморфизма генов репарации 27
3.2 Изучение корреляции между полиморфизмом генов
ДНК-репарации и частотой минисателлитных мутаций 29
Выводы 32

Заключение 33
Cписок использованных источников 34
ПриЛОЖЕНИЯ 37
ВВЕДЕНИЕ

Острота проблемы эффектов малых доз, в очередной раз усиленная
последствиями испытаний на Семипалатинском полигоне, кажется, достигла
апогея, и находит отражение в статьях дискуссионного характера, содержащих
огромный фактический материал. В научной, и в публицистической литературе
продолжается острый обмен оценками медицинских последствий влияния
проводившихся испытаний на местное население между учеными и специалистами,
воспитанными на консервативных основах количественной радиобиологии, и
теми, кто пришел в радиационную медицину позже [1]. Вторые имеют желание
объективно регистрировать отклонения в здоровье пострадавших, которые
возникают в динамике послеаварийных лет. Очевидно, в условиях взаимной
критики родится взвешенный взгляд на проблему, и потомки получат
объективную и полную оценку того, что мы изучаем сегодня [2].
Уместно заметить, что почти за 60 прошедших лет существенную эволюцию
претерпели оценки медицинских последствий для здоровья пострадавшего
населения от атомных бомбардировок японских городов Хиросимы и Нагасаки. По
мнению исследователей, распространенность заболеваний, включая рак и
лейкемию, связана с воздействием ионизирующего излучения в те годы, когда
пациенты были детьми или молодыми людьми [1].
Данные о биологической эффективности и механизмах действия “малых” доз
ионизирующего излучения до настоящего времени остаются противоречивыми,
поскольку эффекты “малых” доз ионизирующего излучения оценивали, главным
образом, экстраполяцией результатов, полученных при облучении
экспериментальных животных относительно высокими дозами. Результаты такой
экстраполяции привели к созданию нескольких концепций, объясняющих
закономерности возникновения генетических повреждений при воздействии
“малых” доз ионизирующего излучения на облучённый организм или клеточные
культуры, таких как линейная беспороговая концепция; нелинейная, а также
концепция, отстаивающая существование явления гормезиса [2; 3]. Однако
данные последних лет свидетельствуют о том, что появление генетических
повреждений при воздействии “малых” доз ионизирующего излучения не
укладывается в рамки какой-либо одной концепции, т. к. характеризуется
взаимодействием сложных внутриклеточных механизмов, к которым относятся
механизмы эксцизионной репарации [4], репарации двунитевых разрывов ДНК
[5], изменения экспрессии некоторых специфических генов [6].
Известно, что ионизирующее излучение может вызывать у живых организмов
детерминистские (лучевая болезнь, сокращение продолжительности жизни,
поражение иммунной системы) и стохастические (канцерогенез, генетические
изменения) эффекты, которые зависят от дозы, её мощности и времени,
прошедшего с момента облучения. В последние десятилетия большое внимание
уделяется оценке темпов мутационного процесса и объёма генетического груза
в популяциях человека, подвергшихся воздействию неблагоприятных факторов.
Для такой оценки применяются несколько подходов: фенотипический анализ,
изучающий частоты наследственных заболеваний, врождённых пороков развития и
репродуктивную функцию; цитогенетический анализ (рутинный и FISH),
изучающий частоты нестабильных и стабильных хромосомных аберраций,
анеуплоидий и сестринских хроматидных обменов в соматических клетках
человека [7]; молекулярно-генетический анализ, позволяющий изучать генные
мутации в соматических и половых клетках [8].
Актуальность проблемы: Знания о закономерностях влияния ионизирующих
излучений на геном и индивидуальную радиочувствительность человека можно
было бы использовать в целях повышения эффекта лучевой терапии опухолей и
противолучевой защиты организма, а также при диагностике индивидуальной
предрасположенности людей к различным видам онкологических заболеваний.
Цель исследования: Изучение полиморфизма генов репарации ДНК (XRCC1 и
XRCC3) среди жителей, проживающих на территории бывшего Семипалатинского
ядерного полигона
Задачи исследования:
1. Изучить распостранённость генотипов (XRCC1 Arg194Trp, XRCC1
Arg399Gln, XRCC3 Thr241Met), связаных с нарушениями в работе систем
репарации ДНК среди облучённого населения и в контрольной группе.
2. Сравнить полиморфизм генов репарации (XRCC1, XRCC3) с известными
данными о мутациях в минисателлитных локусах среди жителей территорий,
прилегающих к СИЯП.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУР

1.1 Воздействие радиации на организм
К настоящему времени получены фундаментальные данные о реализации
эффектов ионизирующего излучения (ИИ) на разных уровнях биологической
организации: от молекулярной до организменной. Вместе с тем решение
некоторых вопросов как теоретического, так и практического характера до сих
пор затруднено в связи с отсутствием полных сведений о закономерностях
формирования радиационно-индуцированных эффектов, а также частоте их
развития в зависимости от интенсивности воздействия и собственно спектра
этих эффектов [9]. Причина сложившейся ситуации может быть обусловлена
несколькими обстоятельствами:
- существуют ограничения возможностей применяемых методов исследования
– эпидемиологических, клинических, лабораторных и пр.;
- прямая экстраполяция ситуации, развивающейся при воздействии высокой
интенсивности (большие дозы ИИ), как правило, не совпадает с ожидаемым
результатом при воздействии низкой интенсивности (малые дозы ИИ);
- изменения, вызванные воздействием ИИ (особенно при низких уровнях
облучения) неспецифичны и схожи с таковыми при развитии типовых
патологических процессов и заболеваний. Тем не менее, наличие значительного
массива уточненных данных о лицах, подвергавшихся радиационному
воздействию, а также обоснованный выбор современных методов исследования и
анализа, применяемых в комплексе, позволяют надеяться на получение
объективной информации и решение поставленных задач [10].
Воздействие радиации на организм может быть различным, но почти всегда
оно негативно. В результате воздействия ИИ на организм человека в тканях
могут происходить сложные физические, химические и биохимические процессы.
При попадании радиоактивных веществ внутрь организма поражающее действие
оказывают в первую очередь α-источники, и только затем β-источники, т.е. в
обратной наружному облучению последовательности. α-частицы, имеющие
небольшую плотность ионизации, разрушают слизистую оболочку, которая
является слабой защитой внутренних органов по сравнению с наружным кожным
покровом. Существует 3 пути поступления радиоактивных веществ в организм:
при вдыхании воздуха, загрязненного радиоактивными веществами, через
зараженную пищу или воду, через кожу, а также при заражении открытых ран.
Наиболее опасен первый путь, поскольку, во-первых, объем легочной
вентиляции очень большой, а во-вторых, значение коэффициента усвоения в
легких более высокое [11].
Действие радиации на организм в долгосрочном плане проявляется
мутациями, а в краткосрочном - лучевой болезнью различной степени тяжести.
ИИ воздействует на клетки организма, вызывая разрушение их белковой
структуры. Это приводит к образованию свободных радикалов и других
продуктов распада. Помимо смерти самой клетки, ее остатки вызывают общее
отравление организма. Хотя клетка и имеет мощные возможности для
самовосстановления, при интенсивном облучении не помогают и они [11].
Сложный патогенез радиационных поражений можно разделить на две фазы:
- фаза первичного действия радиации на молекулярном и клеточном уровне:
механизмы поглощения радиации, ионизация атомов и молекул, первичные физико-
химические процессы, вызванные непосредственным действием радиации в момент
облучения и являющиеся пусковым моментом развития дальнейших патологических
процессов.
- фаза развития патологических процессов в организме на молекулярном,
органном, системном и организменном уровнях.
Механизмы первичного действия радиации на клетки различны. Приведём
некоторые теории и гипотезы, которые, как оказалось, не противоречат, а
дополняют друг друга.
Теория прямого действия или теория мишени (Н.В. Тимофеев- Ресовский и
др.) объясняет лучевое поражение клетки как результат прямого попадания γ-
кванта или ионизирующей частицы в особо чувствительный объем клетки, в
"мишень", удар по которому (прежде всего в ядро клетки) ведет к
инактивации, гибели клетки. Эта теория была дополнена теорией непрямого,
косвенного действия радиации, в частности на воду, занимающую около 80%
массы клетки. При облучении воды образуются ионы и свободные радикалы,
которые существуют миллионные доли секунды, и могут оказывать повреждающее
действие на структуры клетки [12].
Кислородный эффект выражается в усилении повреждающего действия
радикалов в присутствии кислорода, который взаимодействует с радикалами
воды гидратированным электроном, образуя окисляющиеся радикалы.
Оказывается, при облучении в присутствии нормального содержания кислорода
все клетки и организмы более чувствительны к радиации, и, наоборот, любая
гипоксия, недостаток кислорода в момент облучения снижает
радиочувствительность в 2-3 раза, т.е. при этом повышается сопротивляемость
к облучению [6].
Была выдвинута сульфгидрильная гипотеза (З.Баб, Я.Траевский, др.):
окисляющее действие радиации на высокочувствительные SH - группы ферментов
и белков, и это может приводить к изменениям и нарушениям биоструктур
клетки. Эта гипотеза не оправдалась в полной мере, но в состав многих
радиопротекторов входят SH-группы. Были выдвинуты теории образования
первичных радиотоксинов: липидных радиотоксинов (осуществляют снижение
системы антиоксидантной защиты) в результате действия на ненасыщенные
жирные кислоты (Б.Н. Тарусов) и хиноидных, при облучении ароматических
соединений (А.М. Кузин) [12].
Следующий важный вопрос в радиобиологии: поражение каких биоструктур
имеет наиболее важное значение в радиационном поражении клетки: поражение
ядра или цитоплазмы?
В настоящее время все большее признание получает теория о решающей роли
действия радиации на генетические структуры клетки, нарушения функций и
структуры ДНК, хромосом, ядра. ДНК - это уникальная структура клетки
наиболее чувствительная к облучению, повреждение ее чревато различными
трагическими последствиями для всей клетки и даже последующих поколений.
При облучении в результате прямого и косвенного действия радиации в ДНК
наступают различные структурные нарушения: разрывы водородных связей,
нарушения оснований и точечные мутации, одиночные и двойные разрывы цепей
ДНК, усиление распада ДНК, нарушение мембранного комплекса ДНК, разрывы
хромосом и хромосомные мутации. Одновременно нарушаются ее функции: синтез
ДНК, наступает задержка митотических делений, нарушается генетический код,
синтез РНК, нарушается обмен веществ и т.д. Эти структурно-метаболические
изменения ДНК могут привести к гибели клетки. С другой стороны в то же
самое время происходит восстановление ДНК с помощью специальных
ферментативных систем, причем легче восстанавливаются одиночные разрывы,
труднее - двойные разрывы ДНК [13].
При облучении нарушаются и структуры цитоплазмы. Высокочувствительны
внутриклеточные мембраны и митохондрии, их повреждения приводят к
нарушениям метаболизма, окислительного фосфорилирования, недостатку АТФ и
внутриклеточной энергии. Нарушения в лизосомном аппарате приводят к
высвобождению протеолитических ферментов, которые могут вызвать аутолиз
клетки. Однако, поскольку такие структуры в клетке многочисленны и менее
чувствительны, эти нарушения легче восстанавливаются [14].
Степень радиационного поражения клетки зависит от дозы (График 1), вида
и мощности излучений, условий среды, содержания кислорода, жизненного цикла
клетки.
В зависимости от нарушений ДНК и цитоплазмы различают следующие эффекты
действия радиации на клетки: интерфазная гибель клеток вскоре после
облучения; репродуктивная гибель в процессе митоза или через несколько
клеточных делений; в некоторых клетках происходит репарация сублетальных
повреждений; появление мутантных клеток с генетическими нарушениями или с
онкологическими последствиями.

График 1. Зависимость частоты мутации от дозы радиоактивного облучения

Характерной чертой лучевой болезни, отличающейся от многих других
заболеваний, является поражение генетического аппарата клетки (ДНК,
хромосом), нарушение размножения клеток, массовая гибель
радиочувствительных клеток, опустошение радиочувствительных тканей и
систем, прежде всего кроветворной системы и слизистой кишечника. Наиболее
чувствительны к радиации интенсивно делящиеся клетки, поскольку если в
момент деления будет разрушена одна клетка, то погибнут обе. Это ведет к
истощению запаса этого типа клеток (если клетки интенсивно делятся, то они
примерно с такой же скоростью и умирают) [15].
Более всего страдают ткани костного мозга и лимфатической системы:
эритроциты и лейкоциты постоянно обновляются в организме. Так же
чувствительны клетки желудочно-кишечного тракта, клетки волосяного
фолликула. Менее всего чувствительны к радиации неделящиеся клетки нервной
системы. Из этого следует, дети и подростки более восприимчивы к радиации,
чем взрослые, а наиболее чувствителен - эмбрион в утробе.
Эффекты воздействия радиации на человека обычно делятся на две
категории (Таблица 1):
1) Соматические - возникающие в организме человека, который подвергался
облучению.
2) Генетические - связанные с повреждением генетического аппарата и
проявляющиеся в следующем или последующих поколениях: дети, внуки и
более отдаленные потомки человека, подвергшегося облучению [16].

Таблица 1.
Радиационные эффекты облучения человека

Радиационные эффекты облучения человека
Соматические эффекты Генетические эффекты
Лучевая болезнь Генные мутации
Локальные лучевые поражения Хромосомные аберрации
Лейкозы
Опухоли разных органов

1.2 Радиационно-индуцированные хромосомные аберрации
При воздействии радиации на любой живой организм главной мишенью ее
воздействия является генетический материал клетки. При этом
чувствительность этой мишени превышает чувствительность других
биологических мишеней (белков, мембран, надмолекулярных структур в десятки
раз). Причиной радиационной гибели многоклеточных организмов является
гибель фракции наиболее чувствительных и незаменимых для жизнедеятельности
организма клеток, которые, в свою очередь, гибнут из-за поражения их
генетического материала [12].
Генетический материал всех клеток представлен молекулами ДНК. Огромные
полимерные нити ДНК имеют строго определенную первичную структуру, которая
должна поддерживаться в неизменном виде в течение многих поколений. Однако
это условие при физиологических температурах по чисто термодинамическим
причинам не может быть выполнено. Например, в течение часа в ДНК каждой
клетки человека возникает несколько десятков тысяч повреждений, которые,
как правило, несовместимы с жизнеспособностью клетки. Частота различных
типов повреждений коррелирует с прочностью химических связей, разрыв
которых является причиной их возникновения.
Спонтанные повреждения ДНК встречаются довольно часто, такие события
имеют место в каждой клетке. Для устранения последствий подобных
повреждений имеется специальные репарационные механизмы (например,
ошибочный участок ДНК вырезается и на этом месте восстанавливается
исходный). Мутации возникают лишь тогда, когда репарационный механизм по
каким-то причинам не работает или не справляется с устранением повреждений.
Мутации, возникающие в генах белков, ответственных за репарацию, могут
приводить к многократному повышению (мутаторный эффект) или понижению
(антимутаторный эффект) частоты мутирования других генов. Так, мутации
генов многих ферментов системы эксцизионной репарации приводят к резкому
повышению частоты соматических мутаций у человека, а это, в свою очередь,
приводит к развитию пигментной ксеродермы и злокачественных опухолей
покровов [17].
При хромосомных мутациях происходят как изменение числа отдельных
хромосом в геноме (анеуплоидия), так и крупные перестройки структуры
отдельных хромосом. Последние получили название хромосомных аберраций. В
этом случае наблюдаются:
1. Делеция
а) интерстициальная - выпадение участка хромосомы в средней ее части б)
дефишенская - потеря концевых участков хромосомы;
в) появление кольцквых хромосом
2. Дупликация — двух- или многократное повторение генов, локализованных в
определенном участке хромосомы
3. Изохромосомы – плечи одной хромосомы разрываются в центромерном районе;
при делении клетки образуются хромосомы с равными плечами (метоцентрик),
при этом количество генов удваивается (Рисунок 1(б)).
4. Инверсия — поворот участка хромосомы на 180°, в результате чего в этом
участке гены расположены в последовательности, обратной по сравнению с
обычной;
а) парацентрическая (Рисунок 2(5)).
б) перицентрическая (Рисунок 2(4)).
5. Транслокация - изменение положения какого-либо участка хромосомы в
хромосомном наборе, т.е. перенос генетического материала от одной хромосомы
к другой.
а) реципрокная - наиболее распространенная, при которых происходит
обмен участками между двумя негомологичными хромосомами.
б) нерецепрокная - участок хромосомы может изменить свое положение и
без реципрокного обмена, оставаясь в той же хромосоме или включаясь в какую-
то другую.
в) робертсоновской транслокация - чаще всего вступают акроцентрики
(Рисунок 1(а)) [18].

Рисунок 1. Схема образования робертсоновской транслокации (а), изохромосом
(б) и кольцевой хромосомы (в)
Примечание: A и В - плечи хромосом

Рисунок 2. Виды внутрихромосомных перестроек
Примечание: 1 - исходная пара гомологичных хромосом; 2 - потеря участка
DEFH хромосомы (делеция); 3 - удвоение участка С в хромосоме (дупликация);
4 - инверсия участка BCD в хромосоме; 5 - инверсия участка DE в хромосоме.

1.3 Генные мутации

На генном уровне изменения первичной структуры ДНК генов под действием
мутаций менее значительны, чем при хромосомных мутациях, однако генные
мутации встречаются более часто. В результате генных мутаций происходят
замены, делеции и вставки одного или нескольких нуклеотидов, транслокации,
дупликации и инверсии различных частей гена. В том случае, когда под
действием мутации изменяется лишь один нуклеотид, говорят о точковых
мутациях (рисунок 3). Поскольку в состав ДНК входят азотистые основания
только двух типов - пурины и пиримидины, все точковые мутации с заменой
оснований разделяют на два класса: транзиции (замена пурина на пурин или
пиримидина на пиримидин) и трансверсии (замена пурина на пиримидин или
наоборот).

Возможны четыре генетических последствия точковых мутаций:

1) сохранение смысла кодона из-за вырожденности генетического кода
(синонимическая замена нуклеотида),

2) изменение смысла кодона, приводящее к замене аминокислоты в
соответствующем месте полипептидной цепи (миссенс-мутация),

3) образование бессмысленного кодона с преждевременной терминацией
(нонсенс-мутация). В генетическом коде имеются три бессмысленных кодона:
амбер - UAG, охр - UAA и опал - UGA (в соответствии с этим получают
название и мутации, приводящие к образованию бессмысленных триплетов -
например, амбер-мутация),

4) обратная замена (стоп-кодона на смысловой кодон) [19].

По влиянию на экспрессию генов мутации разделяют на две категории:
мутации типа замен пар оснований и типа сдвига рамки считывания
(frameshift). Последние представляют собой делеции или вставки нуклеотидов,
число которых не кратно трем, что связано с триплетностью генетического
кода.

Первичную мутацию иногда называют прямой мутацией, а мутацию,
восстанавливающую исходную структуру гена, - обратной мутацией, или
реверсией. Возврат к исходному фенотипу у мутантного организма вследствие
восстановления функции мутантного гена нередко происходит не за счет
истинной реверсии, а вследствие мутации в другой части того же самого гена
или даже другого неаллельного гена. В этом случае возвратную мутацию
называют супрессорной. Генетические механизмы, благодаря которым происходит
супрессия мутантного фенотипа, весьма разнообразны [20].

Рисунок 3. Изменение последовательности нуклеотидов в ДНК

1.4 Репарация
Репарация — особая функция клеток, заключающаяся в способности
исправлять химические повреждения и разрывы в молекулах ДНК, повреждённой
при нормальном биосинтезе ДНК в клетке или в результате воздействия
физическими или химическими агентами. Осуществляется специальными
ферментными системами клетки. Ряд наследственных болезней (например,
пигментная ксеродерма) связан с нарушениями систем репарации [17].
Клетки обладают способностью исправлять и устранять различные
повреждения структуры ДНК. Вследствие этого лишь небольшое число мутаций
сохраняется в процессе репликации. Репарация повреждений в молекуле ДНК (по
классической схеме) идет в несколько этапов: первый этап – это
идентификация повреждения и определение его типа; второй этап – это
активация ферментов, которые или напрямую преобразуют повреждение до
исходного состояния, или (если прямое восстановление невозможно) вырезают
поврежденный участок, формируя брешь. В последнем случае прибавляются еще 2
этапа: третий этап - синтез нового участка молекулы ДНК (взамен
поврежденного) и четвертый этап - его встраивание в брешь [21]. При
исследовании механизмов репарации ДНК важные результаты были получены на
клетках, облученных УФ-светом с длинами волн 240-280 нм. УФ-облучение
клеток часто сопровождается их гибелью, образованием мутаций и
злокачественной трансформацией. Среди первичных повреждений наиболее часто
встречаются биспиримидиновые фотопродукты: пиримидиновые димеры
циклобутанового типа, соединенные связью 6-4. Как про-, так и эукариоты
имеют несколько ферментных систем, которые разделяют пиримидиновые димеры
или восстанавливают исходную структуру азотистых оснований. К таким
репаративным системам относится, прежде всего, система эксцизионной
репарации ДНК (NER) ,осуществляющая вырезание поврежденных нуклеотидов (NER
- nucleotide excision repair) или азотистых оснований (BER - base excision
repair).
Данная система обеспечивает защиту клетки от негативного воздействия
агентов, модифицирующих азотистые основания ДНК и разрушающих ее
сахарофосфатный остов. К таковым относятся разнообразные экзогенные
(ионизирующая радиация, рентгеновские лучи, окисляющие, алкилиру-ющие и
дезаминирующие вещества) и эндогенные генотоксические факторы (побочные
продукты внутриклеточного метаболизма, содержащие активные формы кислорода
— ОН–, О2–, Н2О2 и азота — NO–, NO2–, ONOO–; продукты окисления липидов,
алкилирующие реагенты). Различные модификации оснований представляют собой
наиболее распространенный тип повреждений ДНК и в зависимости от тканевой
принадлежности клеток происходят с частотой 2000–8000 событий в сутки [22].
Система ферментативной фотореактивации ДНК (PHR - photoreactivation),
основным компонентом которой является ДНК - фотолиаза, разделяет
пиримидиновые димеры, превращая их в нормальные пиримидиновые основания.
Кроме того, поврежденные УФ-светом молекулы ДНК могут репарироваться с
участием систем рекомбинации и в процессе пострепликативного синтеза ДНК.
Действие систем репарации поврежденной ДНК распространяется не только
на фотопродукты, но и на другие модифицированные основания, образующиеся
под действием химических мутагенов. Отдельно следует упомянуть систему,
распознающую неправильно спаренные основания в двойной спирали ДНК,
возникающие в результате ошибок репликации (SOS-репарация).
Большинство исследованных организмов обладают системами репарации ДНК в
различных комбинациях. Так, клетки E. coli для удаления фотопродуктов
используют системы NER и PHR, тогда как у человека пиримидиновые димеры
циклобутанового типа удаляются исключительно системой NER [23].

1.5 Гены репарации как система защиты
В исследованиях, проведённых в последнее время, была установлена роль
некоторых генов репарации (их “нормальных” полиморфных вариантов) в
формировании индивидуальной радиочувствительности человека [24]. Интересные
результаты были получены при изучении гена XRCC1 и XRCC3, включённую в
транскрипцию и эксцизионную репарацию. Редкие мутации этих генов определяют
дефекты эксцизионной репарации, обусловливающие гиперчувствительность к
повышенному риску возникновению рака [25; 26].

1.5.1 Ген XRCC1
Ген XRCC1 был обнаружен при изучении репарации ДНК в клетках яичника
ЕМ9 у японского хомячка. Белок, кодируемый геном XRCC1 (X-ray cross-
complementing group I, локус 19q13.2) (Рисунок 4), является интегральным
регулятором эксцизионной репарации оснований (ЭРО) [27]. Этот ген имеет
длину 633 аминокислотных остатка (Приложение А) и массу 69,526 (Дa) [28].

Рисунок 4. Локализация гена XRCC1: полосы располагаются в соответствии с
Ensembl, GeneLoc и Entrez Gene

Изменения первичной структуры регуляторного белка XRCC1 неравнозначны
по своим функциональным проявлениям. Аминокислотные замены в консервативных
коровых доменах обычно имеют катастрофические последствия вплоть до
внутриутробной гибели. Периферические вариации, относимые к категории
полиморфизмов, могут оказывать менее выраженное влияние на активность
координатора ЭРО, обусловливая межиндивидуальные различия эффективности
репарации ДНК на последующих этапах онтогенеза [29; 30].
Транзиция G28152A в экзоне 10 гена XRCC1 кодирует замещение
аминокислотного остатка Arg399 на Gln в домене BRCT-I (break repair
carboxyl terminal domain I), взаимодействующем с сенсорным белком PARP-1.
Белок-фермент PARP или поли-АДФ-рибоза-полимераза относится к одному из
ядерных факторов, первым распознающим повреждение ДНК.
Этот фактор управляет запуском механизма репарации ДНК в живых клетках
с места повреждения ДНК и входит в мультипротеиновый комплекс (МР-
комплекс), включающий, кроме него, еще фактор XRCC1, ДНК-лигазу III и бета-
ДНК-полимеразу.
Присутствие PARP в этом комплексе обеспечивает направление всех
участников репарации ДНК к сайтам повреждения ДНК in vivo, что облегчает
восстановление молекулы ДНК.
Входящий в состав МР-комплекса фактор XRCC1 относится к так называемым
строительным лесам, индивидуально взаимодействующим с каждым компонентом
комплекса как опорная молекулярная структура.
С тех пор, как для XRCC1-белка обнаружено поли-АДФ-рибозилирование in
vitro, было выдвинуто предположение о том, что PARP способен регулировать
активность МР-комплекса путем модифицирования XRCC1-белка in vivo, что
нарушает его взаимодействие с другими компонентами комплекса.
В пользу этого предположения свидетельствовали данные о том, что
сверхэкспрессия фактора XRCC1 подавляет активность PARP in vivo.
В свою очередь, было установлено, что входящая в МП-комплекс ДНК-лигаза
III ингибирует активность PARP in vitro, когда ее количество превышает
количество PARP. Соответственное изменение конфигурации данной области
предположительно понижает сродство XRCC1 к PARP-1, что в свою очередь
может замедлить сборку репарационного комплекса [29].

1.5.2 Ген XRCC3
У китайского хомячка был обнаружен ген irs1SF, который функционально
комплиментарен гену XRCC3 (X-ray cross-complementing group 3, локус 14q)
(Рисунок 5) у человека. Этот ген имеет длину 346 аминокислотных остатков
(Приложение Б) и массу 37,850 (Дa). Редкий микросателитный полиморфизм в
этом гене связан с раком у пациентов с различной радиочувствительностью.
Этот ген кодирует представитель семейства белков RecARad51, которые
участвуют в гомологичной рекомбинации для поддержания стабильности хромосом
и восстановления ДНК при повреждении. Белок, кодируемый этим геном, входит
в комплекс, состоящий из 5 белков (Rad51B, Rad51C, XRCC2, XRCC3) [28; 31].

Рисунок 5. Локализация гена XRCC3: полосы располагаются в соответствии с
Ensembl, GeneLoc и Entrez Gene

Наиболее частый полиморфизм в гене XRCC3 это XRCC3 C18067T, который
приводит к аминокислотной замене Thr на Met в кодоне 241. Носители T-
аллельного варианта XRCC3 T241M имеют более высокое содержание ДНК аддуктов
в лимфоцитарной ДНК по сравнению с носителями гомозиготного варианта по С-
аллели, указывая на то, что полиморфизм связан со сниженной способностью
ДНК к восстановлению. Аллель XRCC3 A4541G не была связана с возникновением
рака груди или легких, однако, ее гомозиготные носители имели пониженный
риск возникновения рака яичников. Было также показано, что варианты XRCC3
A4541G и XRCC3 A17897G не приводят к изменениям в аминокислотной
последовательности. Вариант аллели A17897G был связан с пониженным риском
возникновения рака груди и яичников. Сходная тенденция, но, в меньшей
степени наблюдалась для рака легких [24; 32].
Было проведено исследование на 51 больном и 100 здоровых пациентах для
изучения связи между двумя полиморфизмами: Arg399Gln у гена XRCC1 и
Thr241Met на риск возникновения рака толстой кишки. Генотипы были
определены в образцах опухолевой ткани с помощью ПЦР с использованием
рестриктазы NciI для XRCC1 и NcoI для XRCC3. Встречаемость рака была прямо
пропорциональна полиморфному варианту XRCC3 MetMet OR = 9.45; 95% CI 8.77-
11.65), тогда как варианты ThrThr и ThrMet были связаны со значительным
уменьшением риска возникновения рака толстой кишки (OR=0.16; 95%CI, 0-0.26
и OR=0.26; 95% CI 0.25-0.27, соответственно). Слабая зависимость была
обнаружена между вариантами XRCC1 ArgArg и GlnGln и риском возникновения
рака толстой кишки (OR=1.28; 95% CI 1.00-1.84 и OR=1.13; 95% CI, 0.85-2.34,
соответственно). Межгенное взаимодействие между гомозиготными вариантами
XRCC1 ArgArg и XRCC3 MetMet слегка увеличивало риск (OR=10.50; 95% CI
5.67-14.79) [26].

1.6 Индивидуальная радиочувствительность
Одним из наиболее перспективных направлений радиационной генетики
является изучение индивидуальной радиочувствительности человека.
Функционирование предприятий ядерно-топливного цикла, химических
производств увеличивает техногенную нагрузку на среду и организм человека.
Возрастание частоты онкологических, сердечно-сосудистых и других
мультифакторных заболеваний, развитие которых зависит как от генетических,
так и от внешне средовых факторов, ставит вопрос о выделении групп
повышенного риска, имеющих наибольшую чувствительность к воздействию
генотоксических агентов, и поэтому – противопоказания к работе с
радиоактивными и химическими элементами.
Индивидуальная радиочувствительность – это способность биологического
объекта определённым образом реагировать на действие ИИ.
Радиочувствительность определяется многими факторами, среди которых
выделяют: способность к репарации после радиационного воздействия, степень
активности метаболических процессов, скорость окислительно-
восстановительных реакций, физико-химических и биохимических процессов в
клетке.
Накопленный обширный материал свидетельствует о неодинаковой
чувствительности к воздействию ИИ, как на клеточном, так и на организменном
уровне. Первое было показано на различных стадиях клеточного цикла (MS)
[33]; разных типах клеток (сперматоциты клетки костного мозга); разных
стадиях клеточной дифференцировки [3]; клеточных линиях, полученных от
разных видов млекопитающих, или клетках человеческого происхождения,
полученных от здоровых доноров и пациентов с генетическими нарушениями [10;
14]; клеточных органеллах [7]. Второе было показано на разных видах и
линиях животных (морская свинкамышькролик), а также на животных,
находящихся на разных стадиях онтогенеза [12].
Кроме этого, радиочувствительность является индивидуальным признаком,
варьирующим от индивидуума к индивидууму в пределах одного вида. Например,
для человека показано, что при воздействии ИИ, в среднем, частота
хромосомных аберраций лимфоцитов периферической крови зависит от дозы
облучения. Однако существует значительная дисперсия по данному показателю в
пределах одних и тех же дозовых нагрузок [7].
Радиочувствительность варьирует в пределах одного вида в зависимости от
возраста - возрастная радиочувствительность (так, наиболее
радиочувствительными являются молодые и старые экспериментальные животные,
наиболее радиорезистентными - половозрелые и новорожденные), от пола -
половая радиочувствительность (как правило, самцы более радиочувствительны)
и индивидуальная радиочувствительность, у разных особей одной или той же
популяции. Менее изучены сезонные и суточные колебания
радиочувствительности.
Индивидуальная радиочувствительность, по-видимому, является сложным
признаком, который обусловлен действием как генетических, так и средовых
факторов. Число генов, определяющих радиочувствительность, возможно,
невелико: сегрегационный анализ 20 родословных показал чёткий
наследственный характер этого признака, 82% вариации которого объясняется
одним главным диаллельным кодоминантным геном [1]. К группе кандидатных
генов индивидуальной радиочувствительности можно отнести гены репарации
радиационно-индуцированных повреждений ДНК, контроля клеточного цикла,
индукции механизмов радиозащиты и другие.
Изучение механизмов поврежденного действия ионизирующего излучения и
механизмов восстановления организмов от лучевых повреждений имеет большое
значение для разработки методов противолучевой защиты и повышения
эффективности лучевой терапии опухолей.
Альтернативой радиочувствительности служит понятие радио-устойчивости,
или радиорезистентности. Радиобиологи Н. В. Тимофеев-Ресовский,
А. В. Яблоков и Н. В. Глотов в 1973 году утверждали, что для каждой
популяции, как самостоятельной и уникальной эволюционно-генетической
системы, характерен собственный опасный уровень дозы ионизирующего
излучения. Он будет тем ниже, чем выше показатели индивидуальной
изменчивости радиочувствительности популяции. В последние годы получены
результаты исследований, которые свидетельствуют о том, что в нормальной
человеческой популяции встречается 14-20 % радиорезистентных
(радиоустойчивых) особей, 10-20% характеризуются повышенной
радиочувствительностью и 7-10% - сверхрадиочувствительностью. Крайние
варианты чувствительности к действию ионизирующего излучения у взрослых и
детей могут многократно различаться. Этот важный факт делает нежелательным
анализ обнаруживаемых радиационных эффектов у населения, основанный на
усреднении показателей радиочувствительности [7].
Ионизирующая радиация способна убить любой объект. Удобной мерой
радиочувствительности является доза излучения, вызывающая гибель 50 %
исследуемых объектов за 30 суток - полулетальная доза - LD5030
Весьма важен правильный выбор адекватных методов и критериев оценки
радиочувствительности. Многие реакции на облучение специфичны для
определенных тканей и систем. Например, такая универсальная реакция клеток
на облучение, как ... продолжение

Вы можете абсолютно на бесплатной основе полностью просмотреть эту работу через наше приложение.