КЛОНИРОВАНИЕ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ ВИРУСОВ ЯБЛОНИ ACLSV и ASGV СЕМЕЙСТВА BETAFLEXIVIRIDAE

Министерство образования и науки Республики Казахстан

Казахский национальный университет им. аль-Фараби

«Допущена к защите»

Заведующей кафедрой

биотехнологии, биохимии, физиологии растений

д. б. н., профессор Т. А. Карпенюк

ВЫПУСКНАЯ РАБОТА

На тему: «КЛОНИРОВАНИЕ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ ВИРУСОВ ЯБЛОНИ ACLSV и ASGV СЕМЕЙСТВА BETAFLEXIVIRIDAE»

по специальности 050701 - «Биотехнология»

Алматы 2011

РЕФЕРАТ

Выпускная работа состоит из 41 страницы, 5 таблиц, 17 рисунков, 48 использованных источников литературы, 2 Приложений.

Ключевые слова: вирусы яблони ACLSV, ASGV, ASPV, клонирование, секвенирование, амплификация.

Цель работы: Клонирование и секвенирование кДНК капсидных белков вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV

Задачи:

1. Определить заражение вирусами яблони ACLSV, ASGV и ASPV в образцах собранных в Казахстане.

2. Клонировать кДНК капсидного белка вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV.

3. Определить нуклеотидную последовательность клонированных кДНК капсидных белков вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV.

Материалы исследования: тотальная РНК вирусов выделенная из образцов листьев яблонь собранных в садах Казахстана Алматинской области города Талгар.

Методы исследования: Детекция вирусов яблони методом иммуноферментного анализа, выделение тотальной РНК из зараженных листьев яблони, с помощью СТАВ буфера, синтез кДНК путем обратной транскрипции и амплификация данной кДНК методом ПЦР, клонирование ПЦР продуктов, трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК методом теплого шока, выделение плазмидной ДНК из клеток E. Coli, определение нуклеотидной последовательности полученных клонов методом Сэнгера.

Основные полученные результаты:

1. Проведена детекция вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV в образцах листьев яблони, собранных в Казахстане.

2. Клонированы кДНК капсидных белков вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV в вектор Bluescript II SK(+) для последующего секвенирования.

3. Определена нуклеотидная последовательность клонированных кДНК капсидных белков вирусов яблони, и проведено сравнение полученных данных с известными последовательностями вирусов ACLSV, ASGV и ASPV, взятыми из базы данных NCBI.

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

На сегодняшний день вирусные заболевания приносят огромный экономический ущерб во всем мире. Установлено, что возбудители вирусной этиологии снижают устойчивость к стрессорам, ухудшают генеративную и вегетативную продуктивность, фотосинтетическую активность, завязываемость плодов, вызывают нарушение физиологических процессов, подавляют рост, укореняемость, выход стандартных подвоев и черенков в маточниках, приживаемость глазков в питомнике. Они способствуют фенотипическому изменению признаков сортов, вплоть до их вырождения, ухудшают адаптивный потенциал, зимостойкость и устойчивость к вторичным инфекциям, повышают восприимчивость растений к бактериозам и грибным заболеваниям. Различные полиинфекционные комбинации на отдельных чувствительных сортах способны снизить урожайность до 80% и более. Все это приводит к значительным экономическим потерям и обуславливает необходимость изучения вирусных заболеваний.

Садоводство является одной из важнейших отраслей агропромышленного комплекса Республики Казахстан. По данным FAO, общая площадь садов в настоящее время составляет 120 тыс. га, из них 26 занято культурой яблони. Среди факторов, снижающих урожайность плодовых культур, на первом месте стоят вредители и болезни, включающие вирусные и микоплазменные. Из мирового опыта известно, что современная высокоинтенсивные технологии плодоводства всегда базируются на использовании качественного, чистосортного посадочного материала, сертифицированного на чистоту от вирусов и других хронических инфекций. В Казахстане не производится масштабный скрининг растений яблонь на наличие вирусных инфекций в связи с отсутствием доступной системы для их обнаружения. Одними из возбудителей является вирус хлоротической пятнистости листьев яблони (ACLSV), вирус бороздчатости древесины яблони (ASGV) и вирус растрескивания ствола яблони (ASPV) . Данные вирусы широко распространены во многих странах мира. В нашей стране также являются одними из распространенных и вредоносных болезней. ACLSV поражает более 50 видов растений, включая почти все виды яблони, айву, грушу, персик, вишню, черешню, сливу, алычу и абрикос ACLSV подавляет рост побегов, вызывает хлоротичную пятнистость и деформацию листьев яблони, ленточный узор на них, «точечную болезнь» и отмирание саженцев, привитых на сеянцах яблони. ASGV снижает приживаемость глазков в зависимости от подвоя на 4, 7%-62, 5%, угнетает рост саженцев, что заметно уменьшает выход стандартного посадочного материала. Поражение ACLSV совместно с другим латентным вирусом бороздчатости древесины ASGV снижает урожайность яблони в среднем на 20 % - 30%.

Отсутствие внешнего проявления и умеренная вредоносность вирусов являются причиной массового заражения промышленных сортов и старых клоновых подвоев. Во избежание таких потерь необходимо своевременное обнаружение вирусов. Знание нуклеотидной последовательности генов капсидных белков вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV позволит создать систему детекции данных вирусов. А диагностировать вирусы ACLSV, ASGV, ASPV возможно с помощью мультиплекс ПЦР, либо иммуноферментным анализом, основанным на наличии антител к определенным компонентам вируса, таким как капсидный белок. Создание доступной диагностической тест-системы, обеспечит раннее определение зараженных растений и тем самым предотвратит дальнейшее распространение вирусов.

Цель работы: Клонирование и секвенирование кДНК капсидных белков вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV

Задачи: 1. Определить заражение вирусами яблони ACLSV, ASGV и ASPV в образцах собранных в Казахстане.

2. Клонировать кДНК капсидного белка вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV.

3. Определить нуклеотидную последовательность клонированных кДНК капсидных белков вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1 Обзор литературы

1. 1 Вирусные заболевания яблони. Общая характеристика

Вирусные заболевания яблони - инфекционные болезни, возбудителями которых являются вирусы или вирусоподобные, еще не изолированные патогенны. Как и другие вирусы, вирусы растений являются облигатными паразитами и не могут осуществлять репликацию вне организма хозяина. Вирусы растений патогенны в основном для высших растений [1] . Но могут поражать представителей различных семейств, хвойных, папоротников, водорослей и грибов. Часто резко снижают урожай сельскохозяйственных культур и его качество. Растительные вирусы включают 73 рода и 49 семейств [2] .

Вирусы растений состоят чаще всего из простой нити РНК и белковой оболочки. Отличительной особенностью многих вирусов растений является разобщенный геном, фрагменты которого находятся в различных вирионах. Для репликации таких вирусов необходимо, чтобы в клетке присутствовали вирионы, несущие в сумме полный набор генома. Вирусы растений распространяются в природе с помощью биологических и механических переносчиков, через семена или контактным путем через почву и сок больных растений [3-4] .

Oсобенностью вирусных инфекций является то, что они системные и хронические, то есть ткани раз зараженного растения остаются больными в течении всей жизни [3] . Вирусы зимуют в растениях, в их отмерших остатках, в переносчиках, в посевном и посадочном материале. На скорость размножения вирусов в растительных тканях и на проявление симптомов болезни большое влияние оказывают возраст растений (наиболее восприимчивы молодые растения), условия их питания и другие факторы внешней среды.

Вирусы яблони распространены повсеместно, снижая при этом устойчивость к стрессорам, ухудшают продуктивность, завязываемость плодов, вызывают нарушение физиологических процессов, подавляют рост, укореняемость, выход стандартных подвоев и черенков, приживаемость их в питомнике. Повышая при этом восприимчивость яблони к бактериозам и грибным заболеваниям, привлекают насекомых вредителей и переносчиков. Различные полиинфекционные комбинации вирусов яблони на отдельных чувствительных сортах способны снизить урожайность до 60-80%. Все это приводит к значительным экономическим потерям [4] .

Одним из первых вирусных заболеваний яблони, описанных уже в 1825 г. была мозаика яблони. Однако вирусная природа заболевания была доказана почти только через 100 лет в 1923 г. Блодгетт, который перенес мозаику яблони прививкой от больного растения на здоровое. Систематическое изучение вирусных заболеваний яблони началось в 50-е годы [5] . Ведущая роль в изучении наиболее распространенных вирусных заболеваний яблони и других семечковых культур принадлежит английским ученым: Поснет 1985-86г., СгорГеу, 1963-69г., Кэмбел 1961-86г., Листер 1970-76г., 1965-69г., Сегуеира 1965-1969 года. Уже в 1963 году вышла в свет первая коллективная монография под редакцией доктора Поснетта: «Вирусные заболевания яблони и груши» В 1963 году была выпущена монография «Yirus diseases of apples and pears». Затем свой вклад в изучение вирусных, а теперь и вироидных заболеваний внесли вирусологи США, Канады, Дании, Голландии, ГДР, Франции, ФРГ, Японии, Австралии и другие [6] . Японские ученые хотя приступили к изучению этой проблемы только в 70-е годы, внесли большой вклад в исследование ряда заболеваний и взаимосвязи между ними. В результате многолетних усилий исследователей разных стран и континентов к началу 90-х годов на яблоне были описаны 39 вирусных заболеваний плодов [7] .

К наиболее распространенным вирусным заболеваниям яблони относятся следующие:

Мозаика . Ранней весной на молодых отрастающих листьях яблонь может появиться желто-зеленый или бледно- зеленый узор, который с повышением температуры воздуха становится менее заметным. Иногда наблюдают дуги и полукольца желтого цвета, которые в условиях жаркого лета становятся белыми, и часть листовой пластинки отмирает. Пораженные листья жесткие, хрупкие, если их согнуть, они легко ломаются. Сильное развитие болезни часто вызывает раннее опадение листьев. Мозаика яблони, передается от растения к растению при окулировке и прививке. В некоторой степени сортовой материал может быть оздоровлен путем прогревания при 37°С в течение 27 дней или при 60-70°С в течение 10 минут [8] .

Плоскость веток яблони. На поперечном срезе одна половина побега нормальная, а другая - суженная и выпуклая с недоразвитым камбием и сосудистой системой. Это приводит к ухудшению питания растений и, как следствие, к заметному понижению устойчивости деревьев к неблагоприятным условиям внешней среды. Часто на коре появляются трещины, через которые во внутренние ткани проникают паразитические грибы, что усугубляет болезнь.

Звездчатое растрескивание плодов яблони. Многие садоводы, вероятно, отмечали растрескивание яблок в виде трехконечной звезды. Нередко звездчатое растрескивание плодов яблони может приобретать несколько иную форму. Заболевание начинается с появления на кожице плодов пятен, напоминающих паршу. Вирус распространяется отводками, при прививке и окулировке [9] .

Размягчение древесины. У двух-трехлетних побегов ветви обладают повышенной гибкостью. Иногда во время плодоношения больные деревья имеют «плакучий» вид - ветви не выдерживают тяжести плодов. В зависимости от сорта потери урожая достигают 70% [10] .

Наиболее распространенные вирусные заболевания плодовых культур вызываемые вирусами яблони представлены в таблице 1.

Таблица 1

Вирусные заболевания плодовых культур, вызываемые вирусами яблони [11]

1. 2. Вирус хлоритической пятнистости листьев яблони

Заболевания, вызываемые, вирусом хлоритической пятнистости листьев яблони в основном представлены тремя наиболее распространенными:

«Точечная» болезнь саженцев яблони. Плохая приживаемость и слабое развитие саженцев. Привой плохо развивается, листья хлоротичные, на древесине в зоне спайки наблюдаются точечные некрозы. Этот вирус вредоносен также для саженцев в питомниках - ослабляется развитие, снижается зимостойкость [12] .

Кольцевая пятнистость плодов яблони (Apple ring spot) . Симптомы заболевания появляются почти на всех плодах дерева. Вначале это отдельные светло - коричневые или оливковые пятна, вокруг них перед созреванием плодов образуются концентрические кольца, полукруги или линии из огрубевшей буроватой ткани. Местами кожица плодов трескается. При хранении симптомы усиливаются, в результате чего плоды теряют всякую товарную ценность [13] .

Бурая кольцевая пятнистость яблони (Apple russet ring spot) . Симптомы на плодах имеют вид поверхностных колец или полуколец буро-коричневатого цвета и представляют собой опробковевшие участки кожицы. Поражение распространяется в мякоть плода и заканчивается в сосудистом пучке, однако вкусовые качества плодов существенно не меняются. На листьях зараженных деревьев появляются бледно-желтые или светло - зеленые пятна, прилегающие к жилкам. Листья морщинистые, как бы стянутые по жилкам, размер их меньше чем у здоровых деревьев. Снижает товарное качество плодов [14] .

Вирус хлоритической пятнистости яблони (ВХПЛЯ) был впервые описан на яблоне в 1959 году в США Минком и Шеем. ACLSV типичный представитель рода Trichovirus , семейства Betaflexiviridae [14-15] . Свое название вирус получил благодаря хлоротичной пятнистости, которую он вызывает на листьях подвоев - яблони лесной и широкоплодной.

Вирусные частицы имеют нитевидную форму, длину 600-700 нм, ширину 12 нм которые представляют собой полиаденилированые одноцепочечные плюс нити РНК и многократные копии последовательности капсидного белка весом 21 кДа (Рисунок 2) . При 20 ⁰ С сохраняет инфекционность в течении одного-четырех дней, в тканях пораженных растений образует веретеновидные включения [14] .

Важность изучения ACLSV заключается в том, что он широко распространен во многих странах мира, а также имеет широкий круг хозяев. Вирус хлоритической пятнистости листьев яблони известен как вирус поражающий плодовые деревья семейства Rosaceae [15] . ACLSV поражает около 80 - 90 % коммерчески значимых видов яблони, при этом потери урожайности составляют 30-40 %.

Секвенирование нуклеотидной последовательности ACLSV было проделано из изолятов яблони, вишни, персика, сливы. Знание этой последовательности облегчило подробный анализ, сопоставление и обнаружение вируса [16] .

Изоляты ACLSV имеют отличительные биологические, серологические, физиологические, биохимические, а также молекулярные свойства. Симптомы в большинстве случаев строго зависимы от видоспецифичности поражаемого растения и штамма самого вируса [17] .

В нашей стране также считается одной из распространенных и вредоносных болезней. ACLSV естественно и экспериментально заражает 50 видов растений, все виды яблони, встречается на персике, груше, сливе, вишне и абрикосе, а также на многих декоративных растениях, широко распространен на промышленных сортах и клоновых сортах подвоях яблони, где обычно присутствует латентно [17-18] .

Несмотря на это по большей части он проявляет себя бессимптомно на растение хозяина. На большинстве сортов и подвоев яблони вирус является латентным, отсутствие внешнего проявления, умеренная вредоносность и бесконтрольное размножение привели к массовому заражению существующих промышленных сортов и старых клоновых подвоев этим вирусом.

Существует большое разнообразие штаммов ACLSV, поскольку он распространен повсеместно на яблоне и груше и достаточно широко на косточковых .

Вирус, как сообщают, распространяется вегетативно, с посадочным материалом, механически - соком зараженного растения, через прививки, либо заражение происходит через поврежденные участки. Распространение ACLSV, было обнаружено в садах, но естественный способ распространения все еще неизвестен [18] .

(A) слева показан нормальный размер плода и рядом инфицированные плоды Malus domestica Borkh меньшего размера (B) Chenopodium quinoa зараженная вирусом (C) фотография вирусных частиц с больного растения сделанная с помощью электронного микроскопа.

Рисунок 1. Типичные симптомы, вызванные поражением ACLSV [18]

1. 3 Вирус бороздчатости ствола яблони

---

Вы можете абсолютно на бесплатной основе полностью просмотреть эту работу через наше приложение.

• Информатика
• Банковское дело
• Оценка бизнеса
• Бухгалтерское дело
• Валеология
• География
• Геология, Геофизика, Геодезия
• Религия
• Общая история
• Журналистика
• Таможенное дело
• История Казахстана
• Финансы
• Законодательство и Право, Криминалистика
• Маркетинг
• Культурология
• Медицина
• Менеджмент
• Нефть, Газ
• Искуство, музыка
• Педагогика
• Психология
• Страхование
• Налоги
• Политология
• Сертификация, стандартизация
• Социология, Демография
• Статистика
• Туризм
• Физика
• Философия
• Химия
• Делопроизводсто
• Экология, Охрана природы, Природопользование
• Экономика
• Литература
• Биология
• Мясо, молочно, вино-водочные продукты
• Земельный кадастр, Недвижимость
• Математика, Геометрия
• Государственное управление
• Архивное дело
• Полиграфия
• Горное дело
• Языковедение, Филология
• Исторические личности
• Автоматизация, Техника
• Экономическая география
• Международные отношения
• ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности), Защита труда