КЛОНИРОВАНИЕ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ ВИРУСОВ ЯБЛОНИ ACLSV и ASGV СЕМЕЙСТВА BETAFLEXIVIRIDAE

Тип работы: Дипломная работа
Бесплатно: Антиплагиат
Объем: 40 страниц
В избранное:

Министерство образования и науки Республики Казахстан

Казахский национальный университет им. аль-Фараби

Допущена к защите
___________ Заведующей кафедрой
биотехнологии, биохимии, физиологии растений
д.б.н., профессор Т.А. Карпенюк

ВЫПУСКНАЯ РАБОТА

На тему: КЛОНИРОВАНИЕ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ ВИРУСОВ ЯБЛОНИ ACLSV и ASGV
СЕМЕЙСТВА BETAFLEXIVIRIDAE

по специальности 050701 – Биотехнология

Выполнила М.Е. Омашева
Научные руководители:

Зав.кафедрой, Т.А. Карпенюк
д.б.н., профессор
Зав. лаб. молекулярной
биологии НИИ ИББР,
Ph. D Н.Н. Галиакпаров

Нормоконтролер
к.б.н., преподаватель С.Б. Оразова

Алматы 2011

РЕФЕРАТ

Выпускная работа состоит из 41 страницы, 5 таблиц, 17 рисунков, 48
использованных источников литературы, 2 Приложений.
Ключевые слова: вирусы яблони ACLSV, ASGV, ASPV, клонирование,
секвенирование, амплификация.
Цель работы: Клонирование и секвенирование кДНК капсидных белков
вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV
Задачи:
1.Определить заражение вирусами яблони ACLSV, ASGV и ASPV в образцах
собранных в Казахстане.
2.Клонировать кДНК капсидного белка вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV.
3.Определить нуклеотидную последовательность клонированных кДНК
капсидных белков вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV.
Материалы исследования: тотальная РНК вирусов выделенная из образцов
листьев яблонь собранных в садах Казахстана Алматинской области города
Талгар.
Методы исследования: Детекция вирусов яблони методом иммуноферментного
анализа, выделение тотальной РНК из зараженных листьев яблони, с помощью
СТАВ буфера, синтез кДНК путем обратной транскрипции и амплификация данной
кДНК методом ПЦР, клонирование ПЦР продуктов, трансформация клеток E. coli
плазмидной ДНК методом теплого шока, выделение плазмидной ДНК из клеток E.
Coli,определение нуклеотидной последовательности полученных клонов методом
Сэнгера.
Основные полученные результаты:
1. Проведена детекция вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV в образцах
листьев яблони, собранных в Казахстане.
2. Клонированы кДНК капсидных белков вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV
в вектор Bluescript II SK(+) для последующего секвенирования.
3. Определена нуклеотидная последовательность клонированных кДНК
капсидных белков вирусов яблони, и проведено сравнение полученных данных с
известными последовательностями вирусов ACLSV, ASGV и ASPV, взятыми из базы
данных NCBI.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 5
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 7
1 Обзор литературы 7
1.1 Вирусные заболевания яблони. Общая характеристика 7
1.2 Вирус хлоритической пятнистости яблони 9
1.3 Вирус бороздчатости ствола яблони 11
1.4 Вирус растрескивания ствола яблони 13
1.5 Строение генома вирусов ACLSV,ASGV,ASPV 14
1.3 Детекция вирусов яблони иммуноферментным анализом 16
2 Материалы и методы 17
2.1 Материалы исследования 17
2.2 Методы исследования 17
2.2.1 Детекция вирусов яблони ACLSV,ASGV,ASPV методом
иммуноферментного анализа (DAS-ELISA) 17
2.2.2 Выделение тотальной РНК из зараженных листьев яблони, с помощью
СТАВ буфера 17
2.2.3 Синтез кДНК путем обратной транскрипции и амплификация данной
кДНК методом ПЦР 18
2.2.4 Клонирование ПЦР продуктов 20
2.2.5 Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК методом теплого
шока 22
2.2.6 Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli 22
2.2.7 Определение нуклеотидной последовательности полученных клонов
методом Сэнгера 23
3 Результаты и их обсуждение 24
3.1 Детекция вирусов в образцах листьев яблонь Казахстана методом
иммуноферментного анализа (DAS-ELISA) 24
3.2 Выделение тотальной РНК из образцов листьев яблонь собранных в
Казахстане 25
3.3 Клонирование амплифицированной кДНК капсидного белка вирусов
яблони в вектор Bluescript II SK(+) 26
3.4 Секвенирование полученных клонов кДНК капсидных белков вирусов
яблони ACLSV,ASGV, ASPV 30
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 36
ВЫВОДЫ 37
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 38
ПРИЛОЖЕНИЕ 41

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

ACLSV (ВХПЛЯ) вирус хлоритической пятнистости листьев яблони
ASGV (ВБСЯ) вирус бороздчатости ствола яблони
ASPV (ВРСЯ) вирус растрескивания ствола яблони
ПЦР (PCR) полимеразная цепная реакция
ОТ - ПЦР (RT - PCR) полимеразная цепная реакция с обратной
транскрипцией
РНК рибонуклеиновая кислота
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА иммуноферментный анализ
кДНК комплементарная ДНК
ОРС открытая рамка считывания
NCBI Национальный Центр Биотехнологической
Информации

ВВЕДЕНИЕ

На сегодняшний день вирусные заболевания приносят огромный
экономический ущерб во всем мире. Установлено, что возбудители вирусной
этиологии снижают устойчивость к стрессорам, ухудшают генеративную и
вегетативную продуктивность, фотосинтетическую активность, завязываемость
плодов, вызывают нарушение физиологических процессов, подавляют рост,
укореняемость, выход стандартных подвоев и черенков в маточниках,
приживаемость глазков в питомнике. Они способствуют фенотипическому
изменению признаков сортов, вплоть до их вырождения, ухудшают адаптивный
потенциал, зимостойкость и устойчивость к вторичным инфекциям, повышают
восприимчивость растений к бактериозам и грибным заболеваниям. Различные
полиинфекционные комбинации на отдельных чувствительных сортах способны
снизить урожайность до 80% и более. Все это приводит к значительным
экономическим потерям и обуславливает необходимость изучения вирусных
заболеваний.
Садоводство является одной из важнейших отраслей агропромышленного
комплекса Республики Казахстан. По данным FAO, общая площадь садов в
настоящее время составляет 120 тыс. га, из них 26 занято культурой яблони.
Среди факторов, снижающих урожайность плодовых культур, на первом месте
стоят вредители и болезни, включающие вирусные и микоплазменные. Из
мирового опыта известно, что современная высокоинтенсивные технологии
плодоводства всегда базируются на использовании качественного,
чистосортного посадочного материала, сертифицированного на чистоту от
вирусов и других хронических инфекций. В Казахстане не производится
масштабный скрининг растений яблонь на наличие вирусных инфекций в связи с
отсутствием доступной системы для их обнаружения. Одними из возбудителей
является вирус хлоротической пятнистости листьев яблони (ACLSV), вирус
бороздчатости древесины яблони (ASGV) и вирус растрескивания ствола яблони
(ASPV).Данные вирусы широко распространены во многих странах мира. В нашей
стране также являются одними из распространенных и вредоносных болезней.
ACLSV поражает более 50 видов растений, включая почти все виды яблони,
айву, грушу, персик, вишню, черешню, сливу, алычу и абрикос ACLSV подавляет
рост побегов, вызывает хлоротичную пятнистость и деформацию листьев яблони,
ленточный узор на них, точечную болезнь и отмирание саженцев, привитых на
сеянцах яблони. ASGV снижает приживаемость глазков в зависимости от подвоя
на 4,7%—62,5%, угнетает рост саженцев, что заметно уменьшает выход
стандартного посадочного материала. Поражение ACLSV совместно с другим
латентным вирусом бороздчатости древесины ASGV снижает урожайность яблони в
среднем на 20 % - 30%.
Отсутствие внешнего проявления и умеренная вредоносность вирусов
являются причиной массового заражения промышленных сортов и старых клоновых
подвоев. Во избежание таких потерь необходимо своевременное обнаружение
вирусов. Знание нуклеотидной последовательности генов капсидных белков
вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV позволит создать систему детекции данных
вирусов. А диагностировать вирусы ACLSV, ASGV, ASPV возможно с помощью
мультиплекс ПЦР, либо иммуноферментным анализом, основанным на наличии
антител к определенным компонентам вируса, таким как капсидный белок.
Создание доступной диагностической тест-системы, обеспечит раннее
определение зараженных растений и тем самым предотвратит дальнейшее
распространение вирусов.
Цель работы: Клонирование и секвенирование кДНК капсидных белков
вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV
Задачи: 1.Определить заражение вирусами яблони ACLSV, ASGV и ASPV в
образцах собранных в Казахстане.
2.Клонировать кДНК капсидного белка вирусов яблони
ACLSV, ASGV и ASPV.
3.Определить нуклеотидную последовательность
клонированных кДНК капсидных белков вирусов яблони ACLSV, ASGV и ASPV.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1 Обзор литературы

1.1 Вирусные заболевания яблони. Общая характеристика

Вирусные заболевания яблони - инфекционные болезни, возбудителями
которых являются вирусы или вирусоподобные, еще не изолированные патогенны.
Как и другие вирусы, вирусы растений являются облигатными паразитами и не
могут осуществлять репликацию вне организма хозяина. Вирусы растений
патогенны в основном для высших растений [1]. Но могут поражать
представителей различных семейств, хвойных, папоротников, водорослей и
грибов. Часто резко снижают урожай сельскохозяйственных культур и его
качество. Растительные вирусы включают 73 рода и 49 семейств [2].

Вирусы растений состоят чаще всего из простой нити РНК и белковой
оболочки. Отличительной особенностью многих вирусов растений является
разобщенный геном, фрагменты которого находятся в различных вирионах. Для
репликации таких вирусов необходимо, чтобы в клетке присутствовали вирионы,
несущие в сумме полный набор генома. Вирусы растений распространяются в
природе с помощью биологических и механических переносчиков, через семена
или контактным путем через почву и сок больных растений [3-4].

Oсобенностью вирусных инфекций является то, что они системные и
хронические, то есть ткани раз зараженного растения остаются больными в
течении всей жизни [3]. Вирусы зимуют в растениях, в их отмерших остатках,
в переносчиках, в посевном и посадочном материале. На скорость размножения
вирусов в растительных тканях и на проявление симптомов болезни большое
влияние оказывают возраст растений (наиболее восприимчивы молодые
растения), условия их питания и другие факторы внешней среды.

Вирусы яблони распространены повсеместно, снижая при этом устойчивость
к стрессорам, ухудшают продуктивность, завязываемость плодов, вызывают
нарушение физиологических процессов, подавляют рост, укореняемость, выход
стандартных подвоев и черенков, приживаемость их в питомнике. Повышая при
этом восприимчивость яблони к бактериозам и грибным заболеваниям,
привлекают насекомых вредителей и переносчиков. Различные полиинфекционные
комбинации вирусов яблони на отдельных чувствительных сортах способны
снизить урожайность до 60-80%.Все это приводит к значительным экономическим
потерям [4].

Одним из первых вирусных заболеваний яблони, описанных уже в 1825 г.
была мозаика яблони. Однако вирусная природа заболевания была доказана
почти только через 100 лет в 1923 г. Блодгетт, который перенес мозаику
яблони прививкой от больного растения на здоровое. Систематическое изучение
вирусных заболеваний яблони началось в 50-е годы [5]. Ведущая роль в
изучении наиболее распространенных вирусных заболеваний яблони и других
семечковых культур принадлежит английским ученым: Поснет 1985-86г.,
СгорГеу, 1963-69г.,Кэмбел 1961-86г.,Листер 1970-76г., 1965-69г., Сегуеира
1965-1969 года. Уже в 1963 году вышла в свет первая коллективная монография
под редакцией доктора Поснетта: Вирусные заболевания яблони и груши В
1963 году была выпущена монография Yirus diseases of apples and pears.
Затем свой вклад в изучение вирусных, а теперь и вироидных заболеваний
внесли вирусологи США, Канады, Дании, Голландии, ГДР, Франции, ФРГ, Японии,
Австралии и другие [6]. Японские ученые хотя приступили к изучению этой
проблемы только в 70-е годы, внесли большой вклад в исследование ряда
заболеваний и взаимосвязи между ними. В результате многолетних усилий
исследователей разных стран и континентов к началу 90-х годов на яблоне
были описаны 39 вирусных заболеваний плодов [7].

К наиболее распространенным вирусным заболеваниям яблони относятся
следующие:
Мозаика. Ранней весной на молодых отрастающих листьях яблонь может
появиться желто-зеленый или бледно- зеленый узор, который с повышением
температуры воздуха становится менее заметным. Иногда наблюдают дуги и
полукольца желтого цвета, которые в условиях жаркого лета становятся
белыми, и часть листовой пластинки отмирает. Пораженные листья жесткие,
хрупкие, если их согнуть, они легко ломаются. Сильное развитие болезни
часто вызывает раннее опадение листьев. Мозаика яблони, передается от
растения к растению при окулировке и прививке. В некоторой степени сортовой
материал может быть оздоровлен путем прогревания при 37°С в течение 27 дней
или при 60—70°С в течение 10 минут [8].
Плоскость веток яблони. На поперечном срезе одна половина побега
нормальная, а другая - суженная и выпуклая с недоразвитым камбием и
сосудистой системой. Это приводит к ухудшению питания растений и, как
следствие, к заметному понижению устойчивости деревьев к неблагоприятным
условиям внешней среды. Часто на коре появляются трещины, через которые во
внутренние ткани проникают паразитические грибы, что усугубляет болезнь.
Звездчатое растрескивание плодов яблони. Многие садоводы, вероятно,
отмечали растрескивание яблок в виде трехконечной звезды. Нередко
звездчатое растрескивание плодов яблони может приобретать несколько иную
форму. Заболевание начинается с появления на кожице плодов пятен,
напоминающих паршу. Вирус распространяется отводками, при прививке и
окулировке [9].
Размягчение древесины. У двух-трехлетних побегов ветви обладают
повышенной гибкостью. Иногда во время плодоношения больные деревья имеют
плакучий вид - ветви не выдерживают тяжести плодов. В зависимости от
сорта потери урожая достигают 70% [10].
Наиболее распространенные вирусные заболевания плодовых культур
вызываемые вирусами яблони представлены в таблице 1.

Таблица 1
Вирусные заболевания плодовых культур, вызываемые вирусами яблони [11]
Заболевание Вирус яблони
Хлоритическая пятнистость листьев яблони, род Trichovirus, Вирус
точечная болезнь саженцев яблони, кольцевая хлоритической пятнистости
пятнистость плодов яблони (Apple ring spot), листьев яблони (ACLSV)
бурая кольцевая пятнистость яблони(Apple russet
ring spot), у косточковых - псевдошарка и
линейная мозаика сливы, растрескивание коры
сливы, некротическое поражение плодов вишни и
черешни, розеточность абрикоса, зеленая
вдавленная пятнистость, листьев персика,
кольцевая мозаика груши
Бороздчатость древесины яблони, бороздчатость Род Capillovirus, вирус
древесины Virginia crab,отмирание V.crab, некроз бороздчатости древесины
в зоне спайки и отмирание груши яблони (ASGV)
Плоскость плодов яблони, деформация листьев Род Nepovirus,
черешни, скручивание листьев и отмирание вишни, Рашпилевидность листьев
прижилковая мозаика и розеточность черешни черешни (CRLV)
Мозаика яблони, ленточный узор сливы и персика Род Ilarvirus, вирус
мозаики яблони (ApMV)
Карликовость яблони (Malus platycarpa), Род Foveavirus Вирус
ямчатость древесины яблони растрескивания ствола
яблони (ASPV)
Некроз спайки и отмирание яблони, пожелтение Род Nepovirus, вирус
почек, персика, ямчатость древесины косточковых. кольцевой пятнистости
томата (ToRSV)
Мозаика яблони, эндемичный вирус США Род Ilarvirus Вирус
Туларе мозаики яблони
(ATMV)
Ямчатость древесины и каменистость плодов груши Латентный вирус кольцевой
пятнистости гвоздики
(CRSV)

1.2. Вирус хлоритической пятнистости листьев яблони
Заболевания, вызываемые, вирусом хлоритической пятнистости листьев
яблони в основном представлены тремя наиболее распространенными:
Точечная болезнь саженцев яблони. Плохая приживаемость и слабое
развитие саженцев. Привой плохо развивается, листья хлоротичные, на
древесине в зоне спайки наблюдаются точечные некрозы. Этот вирус вредоносен
также для саженцев в питомниках - ослабляется развитие, снижается
зимостойкость [12].
Кольцевая пятнистость плодов яблони (Apple ring spot). Симптомы
заболевания появляются почти на всех плодах дерева. Вначале это отдельные
светло - коричневые или оливковые пятна, вокруг них перед созреванием
плодов образуются концентрические кольца, полукруги или линии из огрубевшей
буроватой ткани. Местами кожица плодов трескается. При хранении симптомы
усиливаются, в результате чего плоды теряют всякую товарную ценность [13].
Бурая кольцевая пятнистость яблони (Apple russet ring spot). Симптомы
на плодах имеют вид поверхностных колец или полуколец буро-коричневатого
цвета и представляют собой опробковевшие участки кожицы. Поражение
распространяется в мякоть плода и заканчивается в сосудистом пучке, однако
вкусовые качества плодов существенно не меняются. На листьях зараженных
деревьев появляются бледно-желтые или светло - зеленые пятна, прилегающие к
жилкам. Листья морщинистые, как бы стянутые по жилкам, размер их меньше чем
у здоровых деревьев. Снижает товарное качество плодов [14].
Вирус хлоритической пятнистости яблони (ВХПЛЯ) был впервые описан на
яблоне в 1959 году в США Минком и Шеем. ACLSV типичный представитель рода
Trichovirus, семейства Betaflexiviridae [14-15]. Свое название вирус
получил благодаря хлоротичной пятнистости, которую он вызывает на листьях
подвоев - яблони лесной и широкоплодной.
Вирусные частицы имеют нитевидную форму, длину 600-700 нм, ширину 12 нм
которые представляют собой полиаденилированые одноцепочечные плюс нити РНК
и многократные копии последовательности капсидного белка весом 21 кДа
(Рисунок 2). При 200 С сохраняет инфекционность в течении одного-четырех
дней, в тканях пораженных растений образует веретеновидные включения [14].
Важность изучения ACLSV заключается в том, что он широко распространен
во многих странах мира, а также имеет широкий круг хозяев. Вирус
хлоритической пятнистости листьев яблони известен как вирус поражающий
плодовые деревья семейства Rosaceae [15]. ACLSV поражает около 80 - 90 %
коммерчески значимых видов яблони, при этом потери урожайности составляют
30-40 %.
Секвенирование нуклеотидной последовательности ACLSV было проделано из
изолятов яблони, вишни, персика, сливы. Знание этой последовательности
облегчило подробный анализ, сопоставление и обнаружение вируса [16].
Изоляты ACLSV имеют отличительные биологические, серологические,
физиологические, биохимические, а также молекулярные свойства. Симптомы в
большинстве случаев строго зависимы от видоспецифичности поражаемого
растения и штамма самого вируса [17].
В нашей стране также считается одной из распространенных и вредоносных
болезней. ACLSV естественно и экспериментально заражает 50 видов растений,
все виды яблони, встречается на персике, груше, сливе, вишне и абрикосе, а
также на многих декоративных растениях, широко распространен на
промышленных сортах и клоновых сортах подвоях яблони, где обычно
присутствует латентно [17-18].
Несмотря на это по большей части он проявляет себя бессимптомно на
растение хозяина. На большинстве сортов и подвоев яблони вирус является
латентным, отсутствие внешнего проявления, умеренная вредоносность и
бесконтрольное размножение привели к массовому заражению существующих
промышленных сортов и старых клоновых подвоев этим вирусом.
Существует большое разнообразие штаммов ACLSV, поскольку он
распространен повсеместно на яблоне и груше и достаточно широко на
косточковых.
Вирус, как сообщают, распространяется вегетативно, с посадочным
материалом, механически - соком зараженного растения, через прививки, либо
заражение происходит через поврежденные участки. Распространение ACLSV,
было обнаружено в садах, но естественный способ распространения все еще
неизвестен [18].

(A) слева показан нормальный размер плода и рядом инфицированные плоды
Malus domestica Borkh меньшего размера (B) Chenopodium quinoa зараженная
вирусом (C) фотография вирусных частиц с больного растения сделанная с
помощью электронного микроскопа.

Рисунок 1. Типичные симптомы, вызванные поражением ACLSV [18]

1.3 Вирус бороздчатости ствола яблони
Вирус бороздчатости ствола яблони (ВБСЯ) вызывает на древесине
индикатора Virginia crab широкие плоские борозды, ямчатость, некротическую
линию или отдельные бурые некротические пятна в зоне индикатора спайки с
подвоем.
Побеги, зараженные вирусом бороздчатости, часто обламываюся, а позже
начинают чахнуть и отмирать. Рост у зараженных растений слабый, листья
хлоротичные, рано краснеющие, плоды созревают преждевременно и ярко
окрашены (Рисунок 3). Растения прививаемые инфированным материалом
проявляли несовместимость с привоем, который плохо развивались и в
дальнейшем погибали в питомнике либо в саду. ASGV часто в ассоциации с
ACLSV наносит огромный ущерб плодовым деревьям. [19]

A) Возникновение черных точек на листьях Pyrus pyfolia Nakai (B)
Spy227пораженная ASGV (C) Chenopodium quinoa инфицированное ASGV (D)
Фотография вирусных частиц сделанная с помощью электронного микроскопа

Рисунок 2. Симптомы поражения ASGV [22]

Но, несмотря на вызываемые заболевания вирус проявляется бессимптомно
на большинстве коммерческих культур. Поражает повсеместно яблони, груши,
айву и 16 видов травянистых растений. В Корее ущерб от поражения вирусом
деревьев груши составил 50 % [20].
ASGV относится к роду Capillovirus семейства Betaflexiviridae,
представляющий собой извилистые нитевидные частицы приблизительно 620 x 12
нм ,составляющие одноцепочечную плюс нить РНК , геном в 6496 нуклеотида.
(Yoshikawa & Takahashi,1988; Yanase et al., 1990; Yoshikawa et al., 1992).
Температура инактивации 60-670 С, в соке сохраняет инфекционность 2-4 дня,
выдерживает промараживание [21].
Преждевременные отклонения и гибель растения вероятно зависит от штамма
вируса и поражаемого растения.
Распространяется вегетативно, с посадочным материалом, семенами [22].

1.4 Вирус растрескивания ствола яблони
Первоначально названный вирус каменистости плодов груши вирус ASPV
выделенный из зараженных деревьев яблони представлял собой частицы
диаметром 32 нм.Первые описания растрескивания ствола у яблони были сделаны
в США (Smith,1954). Вирусная порода заболевания доказана H.W.Guengerich,
D.F.Millikan (1956) [23].
Данный вирус поражает в основном коммерчески важные сорта яблок, при
этом нанося ущерб по всему миру. На древесине ствола яблони появляются
различной длины, формы и глубины ямки, которые в зависимости от штамма
вируса располагаются вблизи места прививки.
Коммерческие сорта яблонь не проявляют никаких симптомов после
заражения вирусом, но инфекция отражается в замедление роста и снижение
урожайности и развитии карликовости у яблони. Визуализировать поражения
можно лишь на индикаторных деревьях, на которых ASPV вызывает продолговатые
трещины в древесине, некроз коры и усыхание растения, отмирание верхушек
побегов, хлороз листьев, отмирание внутреннего слоя коры, образование
некротических пятен на листьях (Рисунок 3). Сильные штаммы вируса вызывают
деформацию и складчатость плодов яблони [24].

Рисунок 3. Ямчатость и растрескивание ствола у индикаторной яблони Malus
platicarpa [25]

На сегодняшний момент неизвестно, каких либо векторов перемещения
вируса растрескивания ствола яблони. Успешно было осуществлено механическое
распространение вируса посредством сока зараженного дерева и прививкой.
Перенос вируса не происходит посредством контакта между деревьями, семенами
либо с переносом пыльцы.
ASPV относится к роду Foveavirus семейства Betaflexiviridae,
представляет собой частицы в форме извилистых нитей приблизительно 800 нм.
Ширина частицы примерно 12 х 15 нм (Рисунок 5). Составляет одноцепочечную
плюс нить РНК, геном 9305 нуклеотида [26].

Рисунок 4. Микрофотография вирусных частиц вируса ASPV [27]

1.5 Геном вирусов ACLSV, ASGV и ASPV
Геном ACLSV состоит из 3 открытых рамок считывания (ОРС1,2 и 3),
кодирующие белки весом 216.5 кДа, 50 кДа и 28.3 кДа. Полипротеин весом
216.5 кДа, включает домены метилтрансферазы, полипротеина, хеликазы и
полимеразы. Из них 2 являются консервативными и связанны с РНК
полимеразой. ОРС2 кодирует протеин передвижения, необходимый при
передвижении вирусных частиц из клетки в клетку. Аминокислотная
последовательность ОРС 2 гомологичная транспортным белкам других вирусов
растений. ОРС3 кодирует протеин весом 28.3 кДа, представленный капсидным
белком. Последовательность полипептида гомологична аминокислотным
последовательностям капсидных протеинов различных групп [28]
Капсидный белок ACLSV играет ключевую роль в инфицирование и накоплении
вирусной РНК в клетках растения.
ASGV из рода Capillovirus морфологически схож с вирусами рода
Trichovirus, типичным представителем которого является ACLSV [29]. Геном
ASGV несет две перекрывающиеся ОРС. ОРС1 кодирует полипротеин весом 241 кДа
, включающий домены МТ, П-Про, ХЕЛ, ПОЛ, также регион кодирующий
последовательность капсидного белка. ОРС2 возможно кодирует транспортный
белок весом 36 кДа [30-31]. Экспрессия белков двух рамок считывания изучена
не достаточно[31]. Графическое представление организации генома всех трех
вирусов представлено на рисунке 5.

М- метилтрансфераза; R- РНК полимераза; H- хеликаза; Аn- поли А хвост

Рисунок 5. Графическое представление организации генома вирусов ACLSV
(Trichovirus), ASGV(Capillovirus) и ASPV(Foveavirus) [32]

ACLSV, ASGV и ASPV относятся к РНК содержащим вирусам, РНК вирусов
может быть позитивной (содержащей “+” цепь) и негативной (содержащей “-”
цепь). 75% растительных вирусов содержат одноцепочечную РНК, из них 65%
состоят из одноцепочечной плюс нити РНК [33]. В составе РНК - содержащих
вирусов с минус - цепью РНК находится РНК-полимераза , которая проникает в
клетку вместе с вирусным геномом.
Большинство вирусов этого типа полностью реплицируются в цитоплазме.
РНК полимераза осуществляет транскрипцию мРНК, а также полной
комплементарной РНК (плюс - цепи). На матрице последней синтезируется
вирусный геном (минус-цепь). В результате трансляции мРНК синтезируются РНК
полимераза и другие вирусные белки. ACLSV, ASGV, ASPV содержат РНК
позитивную (+РНК цепь). Плюс-цепь РНК может непосредственно служить
матрицей для синтеза белка, поэтому такие вирусы не имеют в своем составе
ферментов [34]. Продуктом транскрипции вирусного генома (плюс-цепи РНК)
является комплементарная цепь РНК (минус-цепь), на матрице которой при
участии вирусной РНК полимеразы синтезируются геномы (плюс-цепи РНК) и мРНК
[35].Сборка РНК - содержащих вирусов с плюс-цепью осуществляется в
цитоплазме.

1.6 Детекция вирусов яблони иммуноферментным анализом
Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked
immunosorbent assay, ELISA) - лабораторный иммунологический метод
качественного определения и количественного измерения антигенов и антител.
В основе метода иммуноферментного анализа (ИФА) лежит принцип
специфического взаимодействия между антигеном и соответствующим ему
антителом. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием
так называемого конъюгата, который представляет собой анти-антитело,
соединённое с ферментной меткой (обычно используют пероксидазу хрена либо
другие пероксидазы).
Существует несколько методов постановки реакции, однако, в настоящее
время, наиболее часто для выявления специфических антител используются
следующая схема (т.н. сэндвич метод ИФА).
На лунках тест-планшета зафиксирован испытуемый образец, который
инкубируется с антителами к определенному антигену, который может
присутствовать в испытуемом образце. При наличии антигенов происходит
специфическое связывание с антителами с образованием комплекса антиген-
антитело.
В дальнейшем, при инкубации этого комплекса с конъюгатом, происходит
присоединение анти-антител к имеющимся комплексам антиген-антитело.
Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси
водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в
процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции
на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания
зависит от количества выявленных специфических антител.
Результат оценивается спектрофотометрически или визуально. По такому
принципу построена большое количество тест-систем для иммуноферментной
диагностики различных вирусных заболеваний [36].
Для детекции вирусов яблони, также проводится ИФА, при этом используя
антитела к различным компонентам вируса, причем выбираются такие
компоненты, которые характерны для всех штаммов этого вируса, всегда
присутствуют в вирусе, ярко выражены, активно участвующие в
жизнедеятельности вирусов, и для которых легко получить антитела- способные
вызывать хороший иммунный ответ [37].
В данной работе проводится клонирование и определение нуклеотидной
последовательности генов капсидных белков вирусов ACLSV,ASGV,ASPV. Знание
данной нуклеотидной последовательности позволит создать тест – систему для
детекции вирусов на основе мультиплекс ПЦР. А также экспрессия
клонированных капсидных белков даст возможность созданию диагностической
тест-системы на основе иммуноферментного анализа, то есть используя
капсидные белки вирусов для получения антител. [37-38].

2 Материалы и методы
2.1 Материалы исследования
Материалом для работы послужила тотальная РНК вирусов выделенная из
образцов листьев яблонь, собранных в садах города Талгар, Алматинской
области.

2.2 Методы исследования
2.2.1 Детекция вирусов яблони ACLSV,ASGV,ASPV методом иммуноферментного
анализа (DAS-ELISA)
Для проведения иммуноферментного анализа DAS-ELISA использовали
полистироловые 96-ти луночные планшеты, вместительностью 200 мкл каждая
лунка. Специфические антитела lg G разбавляли в 1000 раз в буфере для
связывания (pH 9.6, NaN3 0.02%). 20 мкл антител разводили в 20 мл буфера. В
каждую лунку загрузили 200 мкл разбавленных антител. Закрытый пленкой
Parafilm планшет инкубировали при 4оС в течении ночи. На следующий день
планшет промывали буфером для промывки (10 мМ фосфатный буфер pH 7.4, 140
мМ NaCl ,3мМ KCl, 0.05% Tween 20).Для промывки использовали промывочную
установку фирмы BioRad PW40 Easy Wash 2000.Образцы листьев яблони
растирали экстрагирующем буфером (20 мМ TrisHCl, pH 7.4, 137мМ NaCl, 3мМ
KCl, 2 % PVP kD, 0.05% Tween 20, 0.02% NaN3) в соотношении 1:20. В каждую
лунку наносили 200 мкл гомогената с последующей инкубацией при 4С в течении
ночи.После инкубации снова промывали, далее в лунки добавили 200 мкл
конъюгата (вторичные антитела специфичные к вирусу,конъюгированные с
щелочной фосфотазой).Вторичный антитела разбавили в 1000 раз в
конъюгирующем буфере (20 мМ TrisHCl, pH 7.4, 137мМ NaCl, 3мМ KCl, 1мМ
MgCl2,2% PVP 24 kD, 0.05% Tween 20, 0.2% BSA, 0.02% NaN3). Плотно закрытый
планшет помещали в инкубатор, оставили при 30оС на 5 часов. После промывки
от несвязавшихся антител добавляли разведенный бесцветный субстрат (р-
нитрофенил фосфат в концентрации 1мгмл в субстратном буфере (1М
диэтаноламин, pH 9.8, 0,02% NaN3) Результат оценивали фотометрически при
длине волны 415 нм использую фотометр фирмы BioRad Microplate Reader.В
качестве контроля использовали позитивный и негативный контроль
содержащийся в наборе [39].

2.2.2 Выделение тотальной РНК из зараженных листьев яблони, с помощью
СТАВ буфера
100 мг листьев яблони, гомогенизировали в фарфоровой ступке и добавляли
1 мл буфера для экстракции (0.1M Tris-HCl; 25mM EDTA; 2M NaCl; 2% CTAB; 2%
PVP). 1 мл гомогената инкубировали при 65оС в течение 10 минут и
экстрагировали равным объемом хлороформа. После инкубации (10 мин)
центрифугировали при максимальной скорости в течение 10 минут в охлажденной
до +40С центрифуге, водную фазу переносили в чистую пробирку. РНК осаждали
0.6 объемом изопропанола. Осадок промывали 70% раствором этанола,
центрифугировали при максимальной скорости 10 минут. После сушки, осадок
растворяли в 40 мкл воды.
Для доочистки выделенной тотальной РНК из листьев яблони от больших
содержаний полифенолов и полисахаридов использовали осаждение литий
хлоридом. К 40 мкл растворенной в воде РНК добавляли 0,6 объема 8 M
LiCl,оставляли на ночь при +40С, далее центрифугировали при максимальной
скорости 30 минут, осадок промывали в 75 % этаноле, снова центрифугировали
и растворяли в 40 мкл воды [40].

2.2.3 Синтез кДНК путем обратной транскрипции и амплификация данной
кДНК методом ПЦР
Реакцию обратной транскрипции проводили с помощью РНК- зависимой ДНК -
полимеразы M-MuLV RT [41]. Изначально реакционная смесь содержала 5 мкг
тотальной РНК, 1 мкл 10 мМ соответствующего олигонуклеотида в конечной
концентрации 0,2 мМ. При помощи олигонуклеотида синтезируется к-ДНК
комплементарная к последовательности отвечающей за синтез капсидных белков
и остальной РНК в направлении 5’-3’.Для каждого вируса замешивалась
отдельно реакция для проведения обратной транскрипции содержащая
соответствующую РНК и олигонуклеотид (обратный праймер).Смесь доводили до
16.5 мкл деонизированной стерильной водой, прогревали при 70 оС 10 минут
для разворачивания вторичной структруры. Затем добавляли 2 мкл 5Х RT Буфера
(250мМ Tris HCl,pH 8.3, 250 мМ КСl, 20мМ MgCl2, 50 мМ DTT), 0.5 мкл 10 мМ
смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP) и 150-200 единиц M-MuLV
ревертазы. В таблице 2 представлена последовательность олигонуклеотидов,
используемые для получения кДНК и ее дальнейшей амплификации. Дизайн
праймеров был разработан в лаборатории молекулярной биологии ИББР МОН РК.

Таблица 2
Последовательности олигонуклеотидов использованные для клонирования
кДНК капсидных белков вирусов и ПЦР реакций

Размер ПЦР
Вирус № Последовательность нуклеотидов продукта
(пар
нуклеоти
дов)
1 2 3 4
ACLSV 040 5'-gAAggCATATggCAgCAgTTCTgAACCTgCA -3' 596
041 5'-ACAgACTCgAggCAAAgATCAgTTgAAAC-3 '

Продолжение таблицы 2

1 2 3 4
ASGV 043+ 5'-ggAACATATgAgTTTggAAgACgTgCTTCA -3' 727
044 5'-gACTCgTCgACCTCCAgTTCCAgATTACT -3'
ASPV1 123 5'-TCACggAggTAATTATCAggACgg -3' 1145
026 5'-TGATTgCTCgCCACAACTCCAg -3'
ASPV2 025 5'-gCTAgTgCTCCAACTgCCAgTg -3' 1084
048 5'-TCACTTCTCgAgggATAAAACAggTTTgggT -3'

Для получения в достаточном количестве кДНК использовали метод ПЦР. По
отдельности к 2 мкл реакционной смеси обратной транскрипции каждого вируса
добавляли соответствующие олигонуклеотиды, являющиеся прямым и обратным
праймерами (таблица 2), для участка кДНК отвечающего за капсидные белки, до
конечной концентрации 0,2 мМ. Также смесь содержала 2.5 мкл 10Х Taq Буфера
(750 мМ Tris HCl, pH 8.8, 200мМ (NH4)2SO4,0.1 % Tween 20), 2.5 мкл 25 мМ
MgCl2 до конечной концентрации 2.5 мМ,0.5 мкл 10 мМ смеси
дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP), 16 мкл деонизированной стерильной воды
и 1,25 единиц Taq полимеразы на 25 мкл реакции. Синтез проводили в
следующем температурном режиме:
Стадия 1: 2 мин.94оС
Стадия 2: 30 сек. 94оС
Стадия 3: 30 сек 56оС
Стадия 4: 1 мин. 30 сек. 72оС
Стадия 5: 10 мин.72оС
Продукты ПЦР анализировали в 1.5% агарозном геле и затем очищали
методом элюции из геля.Выделение ДНК из агарозного геля проводили двумя
методами.
Метод 1:
Препаративное выделение проводили после проведения электрофореза в 1.5%
агарозном геле. Полосу с фрагментам вырезали острым скальпелем под
ультрафиолетовым светом и замораживали при -20оС. Затем проводили очистку
с помощью центрифугирования при 12000g в течение 5 минут. Тщательно
собранный супернатант депротеинизировали дважды фенолом. Затем к нему
добавляли ацетат натрия до конечной концентрации 0,3 М и 2,5 объема
холодного этанола, помещали на -20оС. Через 1 час инкубации препарат
центрифугировали 15 минут при 10000 g. Осадок промывали 70 % этанолом,
высушивали и растворяли в 20 мкл воды [42].
Метод 2:
Для элюции ДНК из агарозного геля использовали набор для элюции Agarose
Gel DNA Extraction Kit [43]. Выделение ДНК из геля проводили после
электрофореза 1.5% агарозного геля. Участок с нужным фрагментом вырезали
острым скальпелем под ультрафиолетовым светом и помещали в пробирку типа
Эпендорф. Добавляли 300 мкл солюбилизирующего буфера, инвертировали
содержимое несколько раз и далее добавляли 10 мкл силика матрицы. Смесь
инкубировали при 60 0С 10 минут. После инкубации центрифугировали при
максимальной скорости 1 минуту, удаляли надосадочную жидкость и к осадку
добавляли ДНК связывающий буфер. Тщательно перемешивали смесь, осаждали, и
осадок дважды промывали 500 мкл Буфера для промывки (Washing buffer I),
содержащий спирт 70 %.После сушки осадок растворяли в 30 мкл воды,
инкубировали 10 минут при 60 0С, центрифугировали при максимальной
скорости 1 минуту. Отбирали надосадочную жидкость, содержащую нужную нам
ДНК. Концентрацию элюированной ДНК проверяли в 1.5% агарозном геле

2.2.4 Клонирование ПЦР продуктов
Вектор рBluescript II SK(+) обрабатывали рестриктазой Eco32I( EcoRV)
для образования тупых концов. Инкубацию вели в течение 2 часов при 370С.
Реакцию проводили в 1Х буфере для рестриктазы (10мМ Tris HCl pH 8.5, 10мМ
MgCl2, 100мМ KCl, 0.1 мгмл BSA), добавляли 5 мкг плазмидной ДНК, 20 единиц
реакции рестрикционного энзима на 100 мкл реакции. Большинство продуктов
ПЦР содержат на 3’конце дополнительный аденин. Поэтому для для клонирования
кДНК капсидного белка необходимо было создать линеаризованный вектор
содержащий на 3’конце дополнительный тимин. Поэтому к полученной смеси
порезанной по тупым концам плазмиды добавляли 10Х Taq Буфер,25 мМ MgCl2,
10 мМ ТТР, и фермент Taq полимеразу. Реакция инкубировалась при 720С в
течении трех часов.

Рисунок 6. Плазмида для клонирования Bluescript II SK(+) [44]
Лигирование элюированного фрагмента к-ДНК капсидного белка и вектора
проводили с помощью Т4 ДНК лигазы (10 едмкл) в 1Х лигазном Буфере (40 мМ
Tris НСl,рН 7,8, 10мМ MgCl2, 10мМ ДТТ,5 мМ АТР).При лигировании существует
оптимум концентраций вставки и вектора. Использование слишком низких
концентраций вызовет преимущественное самолигирование, слишком высоких -
преимущественное образование конкатамеров. Поэтому было использовано
соотношение вектора к вставке 13. Исходя из концентрации вектора и
вставки в 1.5 % агарозном геле, было взято необходимое количество в нужном
соотношении (Таблица 3).

Таблица 3
Состав лигазной смеси. Молярное соотношение вектор: клонируемый
фрагмент 13.

Реакционная смесь ACLSV ASGV ASPV1 ASPV2
10X Лигазный Буфер 1 мкл 1 мкл 1 мкл 1 мкл
Вектор Bluescript II 1 мкл 1 мкл 1 мкл 1 мкл
SK(+) ТА концы (80-90нг) (80-90нг) (80-90нг) (80-90нг)
Вставка (амплификант 6.5 мкл 4 мкл 5 3
кДНК) (200-250 нг) (200-250нг) мкл(200-250нмкл(200-250н
г) г)
Т4 ДНК лигаза 1 мкл (5ед.) 1 мкл(5ед.) 1 мкл (5ед.)1 мкл (5ед.)
PEG 4000 0.5 мкл 0.5 мкл 0.5 мкл 0.5 мкл
дд Н2О --- 2.5 мкл 1.5 мкл 3.5 мкл
Всего: 10мкл 10мкл 10мкл 10мкл

Для повышения эффективности лигирования в лигазную смесь был включен 5%
PEG 4000. Инкубацию проводили в течение ночи при 40С [45].

2.2.5 Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК методом теплового
шока
Смесь лигированной плазмиды со вставкой использовали использовали для
трансформации в компетентные клетки, бактерий E. coli штамма JM109.
Для приготовления компетентных клеток инокулировали 10 мл ЛБ (Среда
Лурия-Бертани: 1% бакто-триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl,
растворяют в воде, устанавливают рН 7,0 и стерилизуют 20 мин при 120 °С)
среды и инкубировали на качалке в течение ночи при 370С. Инокулировали ... продолжение

Вы можете абсолютно на бесплатной основе полностью просмотреть эту работу через наше приложение.