Поиск оптимальной среды для глубинного культивирования P. ostreatus, определение протеолитической, целлобиогидролазной и амилазной активности экстрацеллюлярных ферментов и способности ферментного комплекса

Тип работы: Курсовая работа
Бесплатно: Антиплагиат
Объем: 32 страниц
В избранное:

Аннотация

Стр. Илл. Табл
Библ

Фермент, галлофилы, кюветы, активатор, индукция, катализатор,
поверхностное культивирование, субстрат, микроорганизмы, активный центр,
экзопротеазы.

Целью данной работы является поиск оптимальной среды для глубинного
культивирования P. ostreatus, определение протеолитической,
целлобиогидролазной и амилазной активности экстрацеллюлярных ферментов и
способности ферментного комплекса P. ostreatus разрушать клеточные стенки
дрожжей Sacharomyces cerevisiae.
Данная работа состоит из трех разделов.
В первом разделе - аналитическом обзоре, рассматриваются общая
характеристика и физико-химические свойства ферментов, механизм действия
ферментов, методы
Во втором разделе - технологической части, мы рассматриваем подбор
оптимальной среды для глубинного культивирования P. ostreatus, определение
протеолитической, целлобиогидролазной и амилазной активности
экстрацеллюлярных ферментов и способности ферментного комплекса P.
ostreatus разрушать клеточные стенки дрожжей Sacharomyces cerevisiae. В
технологической части рассматривается технологическая схема глубинного
культивирования ферментов.
В третьем разделе - безопасность жизнедеятельности, изучается
безопасность работы в лабораториях при проведении эксперимента.

Содержание

Аннотация
Нормативные ссылки
Определение
Обозначения и сокращения
Введение
1 Аналитический обзор
1.1 Общая характеристика, физико-химические свойства ферментов
1.2 Получение и применение гидролитических ферментов
1.3 Способы культивирования продуцентов ферментов
2 Экспериментальная часть
2.1 Постановка задачи эксперимента
2.2 Методики эксперимента
2.3 Результаты и обсуждение
2.4 Выводы
2.5 Предложения по разработке технологической схемы
3 Безопасность жизнедеятельности
Заключение
Список литературы

Нормативные ссылки

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие
нормативные документы:
ГОСТ 2.102 –68 ЕСКД. Виды и комплектность конструкторских документов.
ГОСТ 2.104-68 ЕСКД. Основные надписи.
ГОСТ 2.201-80 ЕСКД. Обозначение изделий и конструкторских документов.
ГОСТ 2.301-68 ЕСКД. Форматы.
ГОСТ 2.601-95 ЕСКД. Эксплуатационная документация.
ГОСТ 2.304-81 ЕСКД. Шрифты чертежные.
ФС ЮКГУ 4.6-002-2004 СМК Правила оформления учебной документации.
Общие требования к графическим документам.
ГК РК 04-99 Классификатор продукции по видам экономической
деятельности (КПВЭД)

Определения

Фермент- биокатализатор белковой природы, сложного строения и состава,
обладающий высокой активностью и специфическим действием на субстрат.

Активатор-соединение, которое не будучи необходимым для роста
микроорганизма, может оказывать стимулирующее влияние на него.

Индукция – это универсальный контроль для катаболических путей.

Биосинтез- образование органических веществ из более простых соединений,
протекающих в живых организмах под действием биокатализаторов- ферментов.

Субстрат- вещество хим. превращение которого катализируется ферментом.

Ингибитор- вещество, вызывающее торможение или подавление какого-либо
процесса.

Обозначения и сокращения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК – рибонуклеиновая кислота
Мин - минуты
Сут - сутки
Мл - миллилитр
Мг - милиграммы
М.о - микроорганизм
Гл - граммлитр
ЖКТ - желудочно-кишечный тракт
ДФФ - диизопропилфторфосфатом

Введение

В своем послании Президент РК Н.Назарбаев поставил основной задачей
“КазАгро”- системно решать вопросы повышения уровня производительности
сельского хозяйства, предотвращение деградации земель, укрепление
эффективности использования водных и других природных ресурсов страны,
развития биотехнологии. Бурное развитие комплекса наук биологического
профиля с расширением практической сферы их применения обусловлено также
социально-экономическими потребностями общества.
Целью данной работы является поиск оптимальной среды для глубинного
культивирования P. ostreatus, определение протеолитической,
целлобиогидролазной и амилазной активности экстрацеллюларных ферментов и
способности ферментного комплекса P. ostreatus разрушать клеточные стенки
дрожжей Sacharomyces cerevisiae.
Перспективность и эффективность применения биотехнологических
процессов в различных сферах человеческой деятельности, от получения пищи и
напитков до воспроизводства экологически чистых энергоносителей и новых
материалов обусловлена их компактностью и одновременно крупномасштабностью,
высоким уровнем механизации и производительности труда. Эти процессы
поддаются контролю, регулированию и автоматизации. Биотехнологические
процессы, в отличие от химических, реализуются в мягких условиях, при
нормальном давлении, активной реакции и невысоких температурах среды; они в
меньшей степени загрязняют окружающую среду отходами и побочными
продуктами, мало зависят от климатических и погодных условий, не требуют
больших земельных площадей, не нуждаются в применении пестицидов,
гербицидов и других, чужеродных для окружающей среды агентов. Поэтому
биотехнология в целом и ее отдельные разделы находится в ряду наиболее
приоритетных направлений научно-технического прогресса и является ярким
примером высоких технологий, с которыми связывают перспективы развития
многих производств.
Одним из основных биотехнологических производств чвляется
производство ферментов. Ферменты - органические вещества белковой природы,
которые синтезируются в клетках и во много раз ускоряют протекающие в них
реакции, не подвергаясь при этом химическим превращениям. Вещества,
оказывающие подобное действие, существуют и в неживой природе и называются
катализаторами.
Ферменты, участвующие в фундаментальных процессах превращения
энергии, таких, как расщепление сахаров, образование и гидролиз
высокоэнергетического соединения аденозинтрифосфата (АТФ), присутствуют в
клетках всех типов – животных, растительных, бактериальных. Однако есть
ферменты, которые образуются только в тканях определенных организмов.
В последнее время необычно возрос интерес к микроорганизмам,
обитающим в экстремальных условиях. В этом плане существенный интерес
представляют засоленные почвы и обитающие в них бактерии. Доминантами в
гетеротрофном бактериальном сообществе засоленных почв, в частности
солончаков, являются в основном галофильные эубактерии p. Bacillus и
экстремально галофильные архебактерии рода Halobacterium. Ферменты данных
микроорганизмов представляют весьма специфическую группу белков,
функционирующих в экстремальных физиологических условиях. Их изучение
интересно не только с чисто научных позиций, но так же перспективно с точки
зрения использования этих ферментов, работающих при низкой активности воды,
в биотехнологии. Однако их изучение осложняется высокими концентрациями
солей в среде, которые мешают не только выделению и очистке ферментов, но и
изучению их физико-химических свойств.
В задачу данной работы входило исследование экскреторной активности
гидролитических ферментов P. ostreatus в глубинной культуре.

1 Аналитический обзор

1.1 Общая характеристика, физико-химические свойства ферментов.

Вещества белковой природы, способные каталитически ускорять химические
реакции, называют ферментами. Роль ферментов в жизнедеятельности животных,
растений и микроорганизмов колоссальна. В настоящее время в биологических
объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько
сотен из них выделено и изучено. Биологические катализаторы по ряду
признаков резко отличаются от неорганических катализаторов[1]. Будучи
белками, ферменты обладают всеми их свойствами. Сюда относятся
термолабильность ферментов, зависимость их действия от значения рН среды,
специфичность, подверженность влиянию активаторов и ингибиторов.
Термолабильность ферментов объясняется тем, что температура, с одной
стороны, воздействует на белковую часть фермента, приводя при слишком
высоком значении к денатурации белка и снижению каталитической функции, а с
другой стороны, оказывает влияние на скорость реакции образования фермент-
субстратного комплекса и на все последующие этапы преобразования субстрат.
Кроме того, для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды,
при котором он проявляет максимальную активность. Большинство ферментов
имеет максимальную активность в зоне рН поблизости от нейтральной точки.
Специфичность одно из наиболее выдающихся свойств ферментов. Данное
свойство ферментов объясняется в первую очередь совпадением
пространственных конфигураций субстрата и субстратного центра фермента.
Ферменты могут обладать абсолютной, относительной, стереохимической
специфичностью. Влияние на ферменты активаторов и ингибиторов впервые было
изучено А.Я.Данилевским. Ингибиторы тормозят действие ферментов. Механизм
ингибирующего действия сводится к двум типам торможения (необратимое и
обратимое). Обратимое ингибирование действия ферментов может быть
конкурентным и неконкурентным. Будучи выделены из организма, ферменты не
утрачивают способности осуществлять каталитическую функцию, на чем основано
их применение в различных областях промышленности. В хлебопекарной
промышленности применяют ферментные препараты, относящиеся к роду
Aspergillus. В пивоваренной и спиртовой промышленности применяют амилазы
ферменты, ускоряющие реакцию осахаривания крахмала. В кожевенном и меховом
производстве применяют препараты протеиназ. Ферменты находят большое
применение в медицине. Пепсин, трипсин, химотрипсин, липазу и амилазу
применяют для лечения заболеваний ЖКТ. Протеолитические ферменты плазмин и
активирующие его стрептокиназу и урокиназу для растворения тромбов в
кровеносных сосудах. Кроме того, специфическую область применения ферментов
в медицине составляет энзимодиагностика (заболевание может быть тестировано
по уровню содержания фермента или соотношения его множественных форм в
крови или реже в моче).
Физико-химические свойства ферментов.

Ферменты микробного происхождения составляют около половины производства
препаратов на мировом рынке. Их эффективность и мощность намного
превосходят синтетические катализаторы. Они высокоспецифичны по отношению к
своим субстратам и ускоряют строго определённые химические реакции без
образования побочных продуктов; ферменты функционируют в разбавленных
водных растворах при физиологических значениях рН и температуры[2].
Ферменты функциональные единицы клеточного метаболизма. Действуя в строго
определённой последовательности, они катализируют сотни многостадийных
реакций, в ходе которых расщепляются молекулы питательных веществ,
запасается и преобразуется химическая энергия, и из простых молекул-
предшественников строятся макромолекулы, входящие в состав клетки.
Ферментативный катализ происходит на расстоянии длины химической связи,
поэтому акт катализа совершается на определённом участке поверхности
макромолекулы, называемом активным центром. Современный уровень
экспериментальных исследований позволил доказать, что он представляет собой
набор небольшого числа функциональных групп, расположенных близко друг от
друга и имеет вид впадин, выемок на поверхности молекулы фермента.
Функциональные группы активного центра могут принадлежать звеньям
полипептидной цепи, весьма удалённым друг от друга. Сближение их связано с
формированием третичной структуры молекулы фермента. Вполне логично, что
активный центр не имеет автономного существования. Нельзя провести какую-
либо грань между активным центром фермента и остальной частью белковой
молекулы. Именно это и является одной из причин высокой чувствительности и
лабильности активного центра к различным воздействиям. К наиболее важным
характеристикам ферментных препаратов, которые определяют возможность их
применения на практике, относят рН, температурный оптимум, субстратную
специфичность. Кривые строятся на основе данных, полученных при измерении
скоростей реакции, протекающей в буферных растворах с разными значениями
рН. В 1964 году была получена в высокоочищенном состоянии нейтральная
протеиназа Bacillus subtilis. Фермент имеет довольно широкий оптимум рН 6,5
8,0. В щелочной области рН её активность снижается, достигая при рН 9,0 30%
максимальной величины. Таким образом, ферменты активны только в
определённом интервале рН. В большинстве случаев для каждого фермента
имеется определённый оптимум рН. Это объясняется несколькими причинами:-
истинное, обратимое влияние рН на скорость реакции (когда фермент насыщен
субстратом); влияние рН на сродство фермента к субстрату (в этом случае
падение активности по обе стороны от оптимума рН будет следствием понижения
насыщения фермента субстратом в силу понижения сродства);- влияние рН на
стабильность фермента, который может необратимо инактивироваться при рН по
одну или обе стороны от оптимума. Перечисленные факторы могут действовать и
в комбинации друг с другом. Например, падение активности по одну сторону от
оптимума рН может быть результатом уменьшения сродства фермента к
субстрату, а по другую результатом инактивации фермента. Итак, для всех
известных ферментов зависимость скорости реакции от рН графически
выражается в виде колоколообразной функции. Такие кривые строятся на
основе данных, полученных при измерении скоростей реакции, протекающей в
буферных растворах с разными значениями рН[3]. Форма кривых, описывающих
зависимость скорости ферментативной реакции от рН, отражает способность
важных для данного фермента протон - донорных связей или протон акцепторных
групп в его каталитическом центре переходить при определённых значениях рН
в состояние требуемой степени ионизации. Методы анализа температурных
зависимостей кинетических и равновесных параметров ферментативных реакций
основываются на классических принципах термодинамики и кинетики.
Ферментативные реакции характеризуются также наличием колоколообразной
зависимости скорости реакции от температуры в достаточно широком
температурном интервале, что приводит к температурному оптимуму реакции.
Эта способность влияния температуры на кинетику ферментативных реакций
объясняется наложением двух эффектов (возрастание скорости реакции при
увеличении температуры и ускорением тепловой денатурации белковой молекулы,
приводящей к инактивации фермента при высоких температурах). Многообразие
форм, в которых проявляется влияние температуры на скорость ферментативных
реакций, даёт основание ожидать, что анализ этого явления должен
представлять большие трудности[4]. В действительности, однако, влияние
температуры легко установить экспериментально. Влияние этого фактора на
стабильность фермента можно изучить, инкубируя фермент при различных
значениях температуры в течение определённого периода времени, а за тем
определяя его активность в той температурной зоне, в которой он остаётся
стабильным. Хорошо изученными являются протеиназа из Bacillus
amyloliguefarias и протеиназа из Bacillus thermoproteolyticus (термолизин).
Они довольно близки по своим свойствам. Однако термостабильность их
значительно различается, так термолизин теряет 50% максимальной активности
при температуре 84оС, за 15 минут при рН 7,2 , в то время как протеиназа
Bacillus amyloliguefarias теряет за то же время 50% активности при
температуре 59оС[5]. Ферментативная реакция в целом состоит, по крайней
мере, из трёх последовательных стадий: образование фермент-субстратного
комплекса, превращение этого комплекса в комплекс фермент-продукт и
диссоциация промежуточного продукта. Влияние температуры на реакцию в целом
является результатом её влияния на каждую из этих стадий. Известно много
ферментов, для которых естественные условия их действия не совпадают с
оптимальными параметрами рН и температуры. Таким образом, внешние факторы
позволяют с достаточным эффектом регулировать интересующие процессы,
особенно при технологической обработке биологических объектов, например
мяса и мясных продуктов. Специфичность ферментов объясняется в первую
очередь совпадением пространственных конфигураций субстрата и субстратного
центра фермента. По-видимому, только тогда, когда совпадение это достаточно
полно, может образоваться фермент-субстратный комплекс и, следовательно,
начаться процесс ферментативного катализа. Детальное изучение специфичности
ферментов показало, что пределы её у разных ферментов различны. Одни
ферменты обладают абсолютной специфичностью, т.е. каталитически ускоряют
одну единственную реакцию. Примером такого фермента может служить
уреаза[6]. Другие ферменты осуществляют катализ реакций определённого типа
независимо от того, какие конкретные вещества в них взаимодействуют или
распадаются. Основным признаком для ферментов этого типа является характер
связи. Такие ферменты характеризуются, следовательно, групповой
специфичностью. Наконец, некоторые ферменты отличаются стереохимической
специфичностью, т.е. действуют только на один из пространственных изомеров.
Примером могут служить ферменты, расщепляющие - и - метилглюкозиды.
Катализируемая химическая реакция представляет тот специфический признак,
по которому один фермент отличается от другого. Современная классификация
основана на этом признаке. Ферменты делят на группы в зависимости от типа
катализируемой реакции и на подгруппы, более точно характеризующие эту
реакцию. Часто на практике протеолитические ферменты, известные и тем более
мало изученные, подразделяются на группы в зависимости от оптимального
значения рН действия на субстраты. Как правило, выделяют три группы:1.
Щелочные протеиназы, стабильные и активно действующие в области рН 5- 10.
Максимальная их активность обнаруживается при рН 9,5 - 10,5. Установлено,
что это главным образом сериновые протеиназы (для акта катализа важную роль
играют функциональные группы серина); они активно ингибируются
диизопропилфторфосфатом (ДФФ)[7]. Нейтральные протеиназы с оптимумом рН для
протеолиза около 7,0. В эту группу объединяют большинство металлоферментов,
чувствительных к таким аддентам, как ЭДТА и о-фенантролин. Они не
ингибируются ДФФ и тиоловыми реагентами, устойчивы при рН 6 9.3. Кислые
протеиназы, активные при рН 2 5, не чувствительные к сульфгидрильным
реагентам, металлохелатным агентам, тяжёлым металлам и к ДФФ. Для акта
катализа этой группы ферментов важны остатки карбоксильных групп
глутаминовой и аспарагиновой кислот. Вместе с тем отметим, что зависимость
активность рН носит подчинительный характер и связана со структурой
активного центра, определяющего механизм действия.

1.2 Получение и применение гидролитических ферментов

Гидролитические ферменты находят применение в различных областях
биотехнологии, в частности, для удаления клеточных стенок растений и
микроорганизмов, гидролиза белков, целлюлозы и других макромолекул, а также
в научных исследованиях[8].
Получение ферментов из животных и растительных клеток предполагает
разрушение последних, что требует выполнения достаточно сложных и
длительных процедур очистки и стабилизации. Экономически обоснованным
является получение грибных гидролитических ферментов. Это связано с тем,
что мицелиальные грибы экскретируют ферменты в среду, где и осуществляется
гидролиз субстратов.
При подборе продуцента гидролитических ферментов исходят из
интенсивности его роста в культуре, экскреторной активности и спектра
экскретируемых ферментов. Наилучшими продуцентами гидролитических
ферментов, которые удовлетворяют этим требованиям, являются
микроскопические грибы рода Trichoderma, Aspergillus и Penicillium. Однако
среди экскретируемых этими грибами веществ обнаружены и микотоксины,
поэтому ферментные комплексы этих продуцентов без предварительной очистки
не могут использоваться, например, в пищевых технологиях[9].
В качестве продуцентов гидролитических ферментов изучали также
базидиальные грибы рода Pleurotus, в частности P. оstreatus. Показано, что
грибы P.оstreatus экскретируют протеазы, оксидазы, лакказы, пероксидазы,
ксиланазы, фитазы и липазы. Из субстрата культивирования P.оstreatus были
выделены также гидролитические ферменты амилаза, целлюлаза и гликозидиаза.
Показано, что грибы рода Pleurotus продуцируют ферменты в условиях, как
твёрдофазной ферментации, так и глубинной культуры. Можно предположить, что
интенсивность роста и экскреции белков зависят от генотипа продуцента,
среды культивирования и других условий. Однако всё ещё не ясно, какие среды
обеспечивают высокую продуктивность P. оstreatus, существует ли корреляция
между интенсивностью экскреции гидролитических ферментов в среду
культивирования и какие ферменты экскретируются в различных условиях[10].
Значительный интерес представляет изучение активности ферментов P.
оstreatus по отношению к компонентам клеточной стенки дрожжей, в
частности, возможности её удаления с помощью этих ферментов. Дрожжи находят
достаточно широкое применение в качестве пищевых добавок, а наличие
клеточной стенки снижает эффективность их использования. Микроорганизмы,
являющиеся источником для получения разнообразных ферментов, существенно
различаются между собой по способности синтезировать данные биологически
активные соединения. Эти различия проявляются как в ассортименте
синтезируемых ферментов тем или иным микробным видом, так и в их активности
и исходных свойствах.
Ферменты – вещества белковой природы, поэтому в смеси с другими белками
определить их не представляется возможным. Наличие фермента устанавливают
по протеканию той реакции, которую катализирует фермент; количественное
определение фермента проводят по величине образовавшегося продукта реакции
либо по расходу исходного субстрата. Принята так называемая стандартная
единица активности (E или U) – это количество фермента, которое
катализирует превращение 1 микромоля субстрата в минуту при заданных
стандартных условиях[11].
Выбор продуцента необходимого фермента сопряжен с проверкой
активности огромного количества культур, приводящей к отбору наиболее
активного продуцента. Природные штаммы обычно не синтезируют ферменты в
избыточных количествах, так как процесс их синтеза находится под строгим
генетическим контролем. Исключение составляют конститутивные ферменты,
например ферменты гексозомонофосфатного пути, которые синтезируются в
больших количествах в любых условиях роста. Наряду с отбором наиболее
активных штаммов-продуцентов ферментов из микробных коллекций или
выделенных из природных источников, продуцирующих конститутивные ферменты,
широко используют индуцибельные и репрессибельные ферменты, которые
синтезируются клетками в результате изменения условий ферментации или
генетического аппарата клетки. К индуцибельным относятся многие ферменты,
имеющие коммерческую ценность[12].
Индукция – это универсальный контроль для катаболических путей.
Процесс ферментации с целью получения индуцибельных ферментов ведут в
присутствии субстрата-индуктора. Так, для получения амилаз в среду вносят
крахмал, рибонуклеазы – РНК, липаз – жиры, инвертазы – сахарозу и т.д. В
результате способности синтезироваться индуцировано в ответ на заданный
субстрат, возможно использование одной культуры для получения различных
ферментов. Это свойство широко используется в промышленности для получения
различных ферментов[13].
Репрессии синтеза фермента конечным продуктом можно избежать, не
допуская накопления последнего. При выращивании ауксотрофных штаммов на
средах с дефицитом факторов роста накопления конечного продукта не
происходит, и фермент дерепрессируется. В результате этого активность
целевого фермента удается повысить многократно. Дерепрессии синтеза
ферментов можно добиться, выращивая частичный ауксотрофный организм,
который медленно растет на минимальной среде. Но стимулируется ростовым
фактором. Возможно получение конститутивных мутантов, которые не
репрессируются конечным продуктом. Такие мутанты получают, адаптируя
организмы к токсическому аналогу конечного продукта с последующей селекцией
на устойчивость. Многие ферменты, в основном катаболического индуцибельного
типа, репрессируются при быстром росте клеток на легко утилизируемом
субстрате. Для того чтобы избежать катаболитной репрессии, в среду не
вносят репрессирующий субстрат, и применяют мутанты, устойчивые к
катаболитной репрессии[14].
Выход ферментов можно увеличить также с помощью новейших методов
биотехнологии. С помощью плазмид или трансдуцирующих фагов можно увеличить
копийность генов, кодирующих синтез целевых ферментов. Усиление экспрессии
генов возможно также в результате включения сильных промоторов в ДНК[15].
Помимо генетического фактора, огромное влияние на продукцию ферментов
оказывают состав среды и условия культивирования микроорганизмов. При этом
не только наличие индуктора в среде способно увеличить выход фермента.
Чрезвычайно важным является качественный и количественный состав
питательных сред. Например, большинство видов плесневых грибов рода
Aspergillus хорошо растут на достаточно простой синтетической среде Чапека
с сахарозой и нитратом. Для синтеза амилазы, однако, сахарозу следует
заменить крахмалом и увеличить концентрацию углерода и азота в среде. После
этого активность фермента возрастает в 3 раза. Добавление аминокислот в
виде экстракта солодовых ростков выход фермента повышает дополнительно в
4–5 раз. Оптимизируя состав питательной среды, можно повысить активность
амилазы более чем в 500 раз[16].
При подборе состава среды учитывают все факторы: вид и концентрацию
источника углерода и энергии, факторы роста, минеральные элементы,
индуцирующие субстраты. В качестве источников углерода и азота чаще всего
применяют различное природное органическое сырье: крахмал, кукурузный
экстракт, соевую муку, гидролизаты дрожжевых биомасс. Помимо источника
углерода, азота и факторов роста, большое влияние на синтез ферментов
оказывают минеральные соли магния, марганца, кальция, железа, цинка, меди и
др., многие из которых входят в состав ферментов[17].

1.3 Способы культивирования продуцентов ферментов

При поверхностной ферментации для получения инокулята споровый материал
размножают поверхностным способом или выращивают музейную культуру в
условиях глубинной жидкой культуры. Далее посевной материал направляют на
стадию ферментации, которая осуществляется на поверхности сыпучей среды в
металлических лотках или вертикальных перфорированных с обеих сторон
кюветах. Культура развивается на поверхности твердой рыхлой среды, основу
которой составляют пшеничные отруби, зерновая шелуха, являющиеся источником
ростовых веществ. Для разрыхления среды в отруби добавляют древесные опилки
(5–10 %), овсяную шелуху. Смесь перед автоклавированием увлажняют до
20–40 % влажности и подкисляют для улучшения условий стерилизации. Прогрев
сыпучей среды осуществляют острым паром в специальных стерилизаторах при
непрерывном перемешивании среды; длительность процесса – 60–90 минут при
105–140°С. В охлажденную до 30°С среду вносят стерильные термолабильные
компоненты, инокулят (0.02–0.1 % от массы среды), быстро перемешивают
ручным способом и раскладывают в лотки слоем 2–3 см, которые устанавливают
в герметичные аэрируемые камеры, предварительно простерилизованные.
Исходная влажность среды – 58–60 %, температура культивирования 28–32°,
длительность ферментации около 36–48 ч[18].
В течение первых 10–12 ч происходит прорастание конидий при 28°. В
последующие 14–18 ч реализуется быстрый рост мицелия, в этот период
потребляется основное количество питательных веществ из среды при
максимальном термогенезе. Аэрация становится максимальной (до 60 объемов
стерильного воздуха на объем камерыч). Для предотвращения высыхания
конидий в результате повышения температуры влажность воздуха повышают
практически до 100 %. Вследствие больших расходов воздуха принята его
рециркуляция. Циркулирующий воздух проходит через систему охлаждения и
используется повторно; отработанная часть после очистки на волокнистых
фильтрах выбрасывается в атмосферу. В этот период скорость образования
фермента достигает максимальных значений. В последующие 12–18 ч процессы
метаболизма ослабевают, но синтез ферментов еще продолжается. Мицелий
обволакивает и прочно скрепляет твердые частицы среды, поэтому для
нормального транспорта и окисления веществ среда должна быть достаточно
рыхлой и влажной. Эффективный транспорт кислорода из газовой фазы и
растворение в среде происходит при условии хорошей аэрируемости довольно
тонкого слоя твердой сыпучей среды. Это приводит к необходимости
использования больших объемов производственных площадей. Поверхностный
метод ферментации является экстенсивным методом с большой долей ручного
труда. При этом, однако, он не энергоемок и обеспечивает более высокий
выход продукта на единицу массы среды по сравнению с глубинной
ферментацией[19].
Поверхностная ферментация с использованием вместо лотков кювет более
совершенна. Конструкция обеспечивает более эффективную аэрацию и позволяет
частично механизировать процесс. Применяемые в промышленности колонные
аппараты объемной аэрации еще более улучшают процесс твердофазной
ферментации. Такой аппарат разделен на секции перфорированными пластинами,
закрепленными на поворотных осях. Среда в ходе ферментации разрыхляется с
помощью вращающихся перемешивающих устройств. Это позволяет увеличить
высоту слоя до 30 см. Режим перегрузки среды на тарелках задается
автоматически. Производительность аппарата достигает 1 т культуры в
сутки[20].
После завершения стадии ферментации выросшая культура представляет собой
корж (пек) из набухших частиц среды, плотно связанных разросшимся мицелием.
Данную массу измельчают с помощью дробилок различного типа (барабанно-
зубчатых, шнековых, молотковых) до частиц размером 5–6 мм. Для
предотвращения инактивации ферментов массу подсушивают до остаточной
влажности около 10–12 %. Технические препараты ферментов, используемые к
текстильной, кожевенной промышленности, упаковывают в бумажные многослойные
крафт-мешки и отправляют потребителю. Процедура получения очищенных
активных препаратов ферментов сложна и многоэтапна.
Важнейшим нормируемым показателем выпускаемых ферментных препаратов
является активность, которая выражается в микромолях субстрата,
прореагировавшего под действием 1 мл ферментного раствора или 1 г препарата
в оптимальных для протекания ферментативной реакции условиях за 1 минуту.
Существует также понятие активности условного ферментного препарата. Данная
единица рассчитывается по активности основного фермента в стандартном
условном препарате. За активность условного стандартного препарата
принимают его среднюю устойчивую активность, достигаемую в производственных
условиях.
Глубинный способ микробиологического получения ферментов имеет
преимущества по сравнению с поверхностным, так как проходит в
контролируемых условиях ферментации, исключает ручной труд, позволяет
автоматизировать процесс. Питательная среда для ферментации готовится,
исходя из физиологических потребностей используемой микробной культуры, а
также из типа целевого фермента. Основным углеродным сырьем служат
различные сорта крахмала (кукурузный, пшеничный, картофельный), кукурузный
экстракт, свекловичный жом, а также глюкоза, мальтоза, декстрины. В
качестве источника азота применяют органические соединения (гидролизаты
казеина или микробных биомасс), а также минеральные соли (NaNO3, NH4NO3,
NH4HPO4, (NH4)2SO4). Для биосинтеза целлюлолитических ферментов источником
углерода служит хлопок, солома, целлюлоза; липолитических – липиды.
На предферментационной стадии технологическое оборудование и питательная
среда подвергаются стерилизации. После охлаждения среды до 30° в нее вносят
выращенный инокулят (2–5 % от объема производственной культуры). Процесс
проводят в цилиндрических аппаратах объемом до 100 м3. Синтез фермента в
глубинной культуре протекает в течение 3–4 суток при непрерывной подаче
стерильного воздуха, стабилизации рН и температуры среды на строго
определенных уровнях. Незначительные изменения значений данных параметров
могут вызвать многократное снижение ферментативной активности.
Динамика образования биомассы и выхода фермента α-амилазы на основе
культуры Aspergillus показаны на рис. 3.1. В течение первого ... продолжение

Вы можете абсолютно на бесплатной основе полностью просмотреть эту работу через наше приложение.