Иммунокоррекция инфекционного гепатита у собак

Министерство образования и науки Республики Казахстан

Казахский национальный аграрный университет

УДК 619:61:33-002:636. 7 На правах рукописи

Амиргалиева Светлана Садуахасовна

ИММУНОКОРРЕКЦИЯ ИНФЕКЦИОННОГО ГЕПАТИТА У СОБАК

16. 00. 02 - Патология, онкология и морфология животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель: Доктор ветеринарных наук,

профессор Муралинов К. К.

Алматы, 2007

СОДЕРЖАНИЕ

Нормативные ссылки

В настоящей диссертации используются ссылки на следующие стандарты

МРТУ 6-09 3177-66 Хлорамин х. ч.

ТУ 480-11-10-73 Карандаши по стеклу

ГОСТ 12. 1. 008-76 ССБТ Биологическая безопасность. Общие требования

ТУ ОСЧ 25-6 Вода дистиллированная или деминерализованная

МРТУ 42-102-63 Ножницы разные

ГОСТ 64-2-485-86 Ампулы стеклянные для лекарственных средств

ГОСТ 64-7-88-81 Быстроукрепляющиеся краски для печатания на стеклянных изделиях методом глубокой печати

ГОСТ 123-81 Коробки из картона, бумага из комбинированных материалов

ГОСТ 1530-65 Бумага пергаментная

ГОСТ 2918-64 Сода кальцинированная

ГОСТ 4233-77 Натрий хлористый

ГОСТ 5962-67 Спирт этиловый ректификат 96%-ный

ГОСТ 6417-72 Фенол

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная

ГОСТ 7852-65 Пробки резиновые №№ от 11 до 45

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные

ГОСТ 10551-754 Пробирки стеклянные

ГОСТ 10652-73 Версен (Трилон Б) - динатриевая соль этилен-диамин тетрауксусной кислоты

ГОСТ 11773-76 Натрий фосфорнокислый двузамещенный

ГОСТ 12026-66 Бумага фильтровальная

ГОСТ 13805-76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических исследований

ГОСТ 16280-70 Агар - агар

ГОСТ 20292-74 Е Пипетки стеклянные

ГОСТ 20292-74 Колбы мерные вместимостью 100, 200 и 1000 мл.

ГОСТ 20730-75 Питательные среды

ГОСТ 22 967 Шприцы инъекционные вместимостью 2 и 5см ³

ГОСТ 25336-821 Посуда и оборудование лабораторная стеклянная пипетки разномерные

ГОСТ 28085-89 Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В настоящей диссертации применяют следующие термины с соответствующими определениями

Авидность - мера прочности связывания антител с антигеном, определяемая как афинностью взаимодействия между эпитопами и паратопами, так и валентностью антител и антигена.

Адсорбция (от лат. Ad на, при+sorbeo поглощаю) - поглощение какого-либо вещества из газовой среды или раствора поверхностным слоем жидкости или твердого тела. Вещество, на поверхности которого происходит адсорбция, называют адсорбентом, а поглощаемое из объемной фазы - адсорбатом. В иммунологии А. применяют для удаления из антисывороток всех антител, реагирующих с гетерологическими антителами.

Адъюванты (лат. Adiuvans, adiuvantis помогающий, способствующий) - вещества (ланолин, сапонин, минеральные масла, гидроокись алюминия), оказывающие неспецифическое стимулирующее влияние на иммуногенез. При введении их в организм вместе с антигеном они вызывают воспалительную реакцию, замедление всасывания антигена и повышение синтеза антител. А. применяют при изготовлении эффективных вакцин и анатоксинов, а также при гипериммунизации животных.

Адъювант Фрейнда - вводно-масляная эмульсия, которую используют для повышения иммуногенности вносимого в него антигена. Полный адъювант Фрейнда, в отличие от неполного, дополнительно содержит убитые клетки туберкулезных микобактерии.

Антигены - (анти+гр. genes порождающий) - вещества способные при поступлении в организм вызывать иммунный ответ.

Антитела (иммунные тела, иммуноглобулины) - специфические белки (иммуноглобулины), синтезируемые плазматическими клетками в ответ на поступившие в организм антигенов. Антитела являются строго специфичными, т. е. вступают в реакцию только с антигеном индуцирующим их синтез.

Аллерген - агент, вызывающий опосредованные Ig Е - антителами реакции гиперчувствительности.

Аллергия - (allos гр. - другой, чужой + ergon - действие) - состояние повышенной или извращенной реактивности организма по отношению к определенным веществам (аллергенам), развивающееся при повторном воздействии этих веществ.

Артюса реакция - воспаление, развивающееся в коже спустя несколько часов после введение антигена, - реакция гиперчувствительности III типа.

Гаптены - небольшая молекула, которая может действовать как эпитоп, но сама по себе не способна вызывать образование антител.

Изменение культуры - устойчивое изменение свойств или поведения культуры, т. е. изменение морфологии, хромосомного состава, чувствительности к вирусам; пищевых потребностей, пролиферативной способности, характеристик злокачественности и т. д. Термин всегда должен быть квалифицирован точным описанием изменения, которое претерпела культура.

Иммунитет - комплекс реакций, направленных на поддержание гомеостаза при встрече организма с агентами, которые расцениваются как чужеродные, независимо от того, образуются ли они в самом организме или поступают в него извне.

Иммунокоррекция - применение препаратов химической или биологической природы, способные модулировать (стимулировать или подавлять) реакции иммунитета в результате воздействия на иммунокомпетентные клетки, на процессы их миграции или на взаимодействие таких клеток или их продуктов.

Иммунодепрессанты - (лат. immunis, невосприимчивый + depression, угнетение) химические соединения или физические факторы, тормозящие процессы иммуногенеза. Образуются в ответ на введение антигена в лимфоидной ткани организма. Под влиянием иммунодепрессантов, организм теряет способность различать эндогенно возникающие или экзогенно проникающие чужеродные для него вещества. Иммунодепрессанты используют в клинике для лечения некоторых аутоиммунных болезней, а так же для искусственного создания иммунотолерантности по отношениям к чужеродным трансплантантам.

Иммунная система организма. Состоит из дифференцированных лимфоидных органов (тимус, клоакальная сумка у птиц, лимфоузлы, селезенка), агрегированных скоплений лимфоидной ткани (пейеровы бляшки, аппендикс и др. ), диффузных лимфоидных скоплений, а также лимфоидных клеток, циркулирующих и разбросанных по всему организму. Клеточным субстратом всех иммунных реакций служит лимфоидная ткань. Различают первичные, или центральные (тимус, клоакальная сумка у птиц), и вторичные, или периферические (селезенка, лимфоузлы) - лимфоидные органы. Иммунная система организма состоит из тимусзависимой и тимуснезависимой частей. Клетки первой части, Т-лимфоциты, происходят из тимуса (отсюда и название), участвуют в реакциях клеточного типа и играют вспомогательную роль в реакциях гуморального иммунитета. Клетки второй системы, В-лимфоциты происходят из костного мозга (англ. bone marrow) и называются по первой букве этого термина, дифференцируются под воздействием антигена в антителообразующие плазматические клетки. Кроме Т- и В-лимфоцитов в иммунных реакциях участвуют еще макрофаги;

Иммунная сыворотка , serum immune (лат. serum, сыворотка + immunis, невосприимчивый) - сыворотка, содержащая специфические антитела, полученная от иммунизированного (вакцинированного) или переболевшего животного. Применяется для лечения или профилактики (пассивная иммунизация) при определенных инфекционных болезнях;

Иммунные комплексы - комплексы антиген-антитело. Как правило, этот термин применяют в отношении растворимых комплексов антиген-антитело, а не, например, к комплексам антител с антигенами клеточной поверхности;

Иммунный ответ - в норме защитная реакция организма в отношении проникающих из внешней среды патогенов, в первую очередь инфекционных. Эта реакция заключается в распознавании антигена лимфоцитами , синтезе лимфоцитами специальных эффекторных молекул и деструкции и элиминации поврежденных патогеном клеток с привлечением общевоспалительных механизмов, в первую очередь клеток крови и белков сыворотки кров; .

Иммуноглобулины , immunoglobulin, (Ig) (лат. immunis+globulinum, глобулин) - антитела, гаммаглобулины, сывороточные белки, глобулины фракций, которые являются носителями антител. Иммуноглобулины подразделяются на пять основных классов: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. По структуре все иммуноглобулины состоят из двух идентичных легких и тяжелых цепей, соединенных между собой бисульфидными связями. В крови главным образом содержатся иммуноглобулины класса G, М, А; они находятся как в сыворотке, так и в секретах (сывороточные и секреторные) и являются важным защитным фактором при алиментарных инфекциях. IgE-фракция участвует в реакциях гиперчувствительности немедленного типа . После вакцинации сначала начинается синтез IgM-фракции иммуноглобулинов, а затем и других. Иммуноглобулины используют как иммунологические препараты в терапии и профилактике инфекционных болезней;

Клеточная трансформация - изменения, вызванные в клетках введением нового генетического материала. Природа и источник генетического материала, вызвавшего изменения, должны быть определены.

Клон - популяция клеток, происходящая от одной клетки путем митозов. Клон не обязательно является гомогенным, и поэтому термины «клон» или «клонирование» не должны использоваться для обозначения гомогенности клеточной популяции.

Клонированный штамм или линия означает их происхождение непосредственно от клона.

Комплемент - (от лат. complementum - дополнение) дополняет действие антител, направленное на уничтожение внедрившихся в организм посторонних клеток.

Культура клеток - клетки, растущие in vitro без образования ткани.

Культура ткани или органов - поддержание или рост тканей или целого органа, или его кусочков in vitro с обеспечением дифференциации или сохранением структуры и функции.

Линия клеток - первичная культура со времени получения субкультуры; состоит из разнотипных клеток, первоначально присутствующих в первичной культуре.

Линия диплоидных клеток - клеточная линия, в которой, по крайней мере 75% клеток обладают кариотипом нормальных клеток исходного вида. Следует отметить, что диплоидный набор хромосом необязательно эквивалентен диплоидному кариотипу, так как существуют ситуации, при которых клетка может терять один тип хромосом и приобретать другой. Следовательно, кариотип клетки изменился, а диплоидный набор хромосом сохранился. Такие клетки следует считать псевдодиплоидными.

При описании диплоидной клеточной линии указывают число исследованных клеток, процент диплоидных клеток и их кариотип.

Линия гетероплоидных клеток - представляет собой популяцию, в которой менее 75. % клеток с диплоидным набором хромосом. Этот термин не указывает на злокачественность клеток и их способность расти до бесконечности in vitro. Характеризуя гетероплоидную линию клеток, указывают кариотип и процент клеток с измененным кариотипом.

Моделирование - воспроизведение в лабораторных условиях какого-либо патологического процесса или болезни.

Митогены - вещества, вызывающие деление клеток, в частности В-лимфоцитов.

Монослой -клетки, растущие на поверхности в один слой.

Онкогенность - Методы определения онкогенности клеток in vitro отсутствуют, ее можно определить только по поведению клеток в животном организме.

Первичная культура - культура, происходящая от клеток тканей или органов, взятых непосредственно из организма. Культура считается первичной до тex пор, пока она не субкультивируется. Культуры, происходящие от эксплантатов опухолей, развившихся в организме животных после введения культивированных клеток, являются продолжением клеточной линии или штамма.

Плазматическая клетка - антителопродуцирующая В-клетка на конечной стадии дифференцировки.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) - метод иммунологической диагностики вирусных и бактериальных инфекции. При этом эритроциты на которых адсорбированы антигены (антитела), приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антигенов) . Эритроциты выполняют действие носителей антигенов со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген-антитело.

Реакция диффузной преципитации - простая, ускоренная серологическая реакция для выявления антител, отличающаяся высокой специфичностью;

Реакция связывания комплемента - серологическая реакция, основанная на взаимодействии антител и антигена с обязательным участием комплемента, который приводит к растворению (лизису) клеток-мишеней, являющихся антигеном, либо клеточным носителем антигена, либо индикаторами реакции;

Резистентность (лат. resistentia сопротивляемость) - естественная неспецифическая устойчивость к действию раздражителя, в т. ч. и патогенных микробов. Р. связывают с защитными реакциями общего характера.

Рецептор - молекула клеточной мембраны, специфически связывающая определенные внеклеточные молекулы

Сенсибилизация - (лат. sensibilis - чувствительный) - повышение чувствительности организма животного, включая человека (или отдельных органов, напр. органов чувств) к воздействию раздражителей при повторном их действии

Серологические реакции - взаимодействие антигена с гомологичным антителом в опытах in vitro. Она основана на видимых проявлениях реакции антиген-антитело.

Стабильная клеточная линия - клетки, способные субкультивироваться in vitro до бесконечности,

Примечание. На уровне современных знаний о поведении клеток невозможно определить точку, когда культура становится стабильной, т. е. приобретает способность, расти до бесконечности. На основании опыта, с фибробластоподобными клетками человека культура должна субкультивироваться, по крайней мере, 70 раз с интервалами 3 дня, прежде чем ее следует считать стабильной.

Субштамм - специфическая популяция клеток, выделенная из штамма путам изолирования отдельной клетки или групп клеток.

Суспензионная культура - культура, в которой клетки сохраняют жизнеспособность или размножаются, будучи взвешенными в питательной среде.

Сыворотка крови - жидкая составляющая крови без фибриногена/фибрина/.

Титр - наименьшее количество компонента реакции, достаточное для получения ожидаемого феномена.

Тканевая культура - клетки, ткани или органы, эксплантированные из организма животного, сохраняющие жизнеспособность или растущие in vitro более чем 24 ч.

Толерантность - отсутствие активации лимфоцитов к продуктивному иммунному ответу при наличии в доступном им пространстве специфических антигенов.

Штамм клеток - популяция однородных клеток (по одному или нескольким маркерам), сохраняющая специфические свойства в процессе последующего культивирования. Штамм клеток может происходить из первичной культуры или от линии клеток путем селекции, или клонирования клеток, имеющих специфические свойства или маркеры. При описании клеточного штамма следует указать его специфические свойства (набор хромосом, чувствительность или резистентность к определенному вирусу, наличие специфического антигена и т. д. ) .

Экономическая эффективность ветеринарных мероприятий - размеры предотвращенного ветеринарной службой ущерба в животноводстве, выраженные количеством предохраненных от болезней животных и объемом полученной от них продукции, оцененной в действующих закупочных ценах.

Эксплантат - изолированный кусочек ткани или органа, используемый для культивирования.

Эффективность посева - процент клеток, дающих начало колониям. При этом необходимо указывать общее число клеток в инокуляте, тип культурального сосуда «условия (среда, открытая или закрытая система, газовая фаза и т. д. ) .

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

В настоящей диссертации применяют следующие обозначения и сокращения

АТ - антитела

АГ - антигены

АЦГ - антицеллюлярный иммуноглобулин

ИБН - иммунобиологический надзор

КББ - карбонат-бикарбонатный буфер

ИК - иммунные комплексы

КК - культуры клеток

РГЗТ - реакция гиперчувствительности замедленного типа

РГНТ - реакция гиперчувствительности немедленного типа

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации;

РДП - реакция диффузной преципитации

РСК - реакция связывания комплемента

СИ - среда Игла

ТЕ - титровые единицы

ФСБ - фосфорно- солевой буфер

ЦПД - цитопатическое действие

ЦФБ - цитратно-фосфатный буфер

мкг - микрограмм

мкл - микролитр

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Инфекционный гепатит собак - острая контагиозная болезнь, протекающая с лихорадкой, воспалительными процессами слизистых оболочек глаз, катаром дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, а также с поражением печени и ЦНС. Болезнь регистрируется во многих странах мира, в Республике Казахстан инфекционный гепатит регистрируется во всех регионах и проявляется в виде спорадических случаев при частном содержании у населения и энзоотии среди собак в питомниках [1, 2, ] .

По статистическим данным органов ветеринарного надзора, численность ценных породных собак, которые более подверженных инфекционным болезням в России и Казахстане возросла до миллиона. Одним из актуальных задач ветеринарной науки в области кинологии, которой в Казахстане мало уделено внимания является разработка методов диагностики и создание эффективных лечебно- профилактических мероприятии.

Современная эпизоотическая обстановка по заболеваниям плотоядных животных является весьма сложной. Многочисленные такие инфекций как чума плотоядных, парвовирусный энтерит и аденовирусные инфекции, бартонеллез, инфекционный гепатит собак и др., представляют серьезную угрозу и наносят значительный ущерб собаководству и звероводству [3, 4, 5] .

Экономический ущерб, наносимый инфекционным гепатитом в кинологии, определяется высокой летальностью заболевших животных, большим количеством пропустований, массовыми абортами и рождением нежизнеспособного молодняка. В естественных условиях при не осложненном течении болезни гибель среди животных достигает 10 - 15%, а при осложненных формах может составлять 70 - 80% [6, 7] .

В настоящее время решением ВОЗ в гуманитарной медицинской практике запрещены специфические противовирусные сыворотки, применение которых вызывает образование иммунных комплексов и развитие тяжелых иммунопатологических осложнении. В ветеринарной практике это явление, описывается как «сывороточная болезнь», но как показали многочисленные исследования, это мнение является ошибочным, т. к. основным фактором развития этой патологии, являются аллергические и аутоиммунные реакции. Вопросы возникновения и развития сывороточной болезни и болезней иммунных комплексов у животных еще мало изучены [8, 9] .

Применение специфических гипериммунных сывороток для лечения вирусного гепатита плотоядных животных представляет серьезную угрозу для здоровья и жизни больного животного, следовательно, является не допустимым. Применяемые в настоящее время методы лечения в основном являются викарными и не направлены на устранение этиологического фактора. Исходя из сложившейся ситуации, лечение больных вирусным гепатитом животных становится проблематичным, возникает необходимость разработки новых эффективных методов иммунокоррекции [10, 12] .

Диагностика аденовирусных инфекций плотоядных затруднена из-за изменчивых и малохарактерных признаков заболеваний. В практических условиях предварительный диагноз на инфекционный гепатит ставят на основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных. Предложенные в настоящее время такие методы лабораторной диагностики инфекционного гепатита собак, как РСК, ИФА и РДП требуют длительного времени, а также особых условий постановки. Поэтому проблема разработки новых и совершенствование существующих средств и методов лабораторной диагностики этого заболевания остаётся актуальной [13, 14] .

Одним из важных проблем в борьбе с инфекционным гепатитом является своевременная достоверная диагностика. С этой целью применяются РДП и РСК. Для постановки этих реакций необходим вируссодержащий материал, получение которого на культуре клеток является труднодоступным, весьма трудоемким процессом и требует больших материальных затрат.

Возникает необходимость изыскания новых более совершенных средств и методов выявления инфекционного гепатита у животных, доступных по стоимости, простоте техники постановки в условиях лаборатории и лечебниц и быстроте получения результатов.

Цель исследований. Целью настоящей работы является изыскание высокоэффективных средств, обладающих вирусингибирующим и иммунокоррегирующим действием на больных инфекционным гепатитом собак.

Задачи исследований. Для достижения указанной цели на разрешение поставлены следующие задачи:

- изучить вирусингибирующее действие антицеллюлярного иммуноглобулина на культурах клеток;

- изучить иммунокоррегирующее действие антицеллюлярного иммуноглобулина на больных инфекционным гепатитом собаках;

- разработка эритроцитарного диагностикума для обнаружения инфекционного гепатита у собак.

Научная новизна результатов исследований.

- изучено вирусингибирующее действие антицеллюлярного иммуноглобулина;

... продолжение

Инфекционные болезни сельскохозяйственных животных: эпизоотология, диагностика и иммунитет к вирусам Бабеш-Негри, Шмалленберга и Афтэпизоотической болезни

Вирусы животных: Минмаленберга (Schmallenberg virus), история, свойства и диагностика

Инфекционный гепатит у животных: клинические признаки, диагностика и лечение

Инфекционный гепатит у животных: клинические проявления, диагностика и эпидемиология

Инфекционный гепатит собак: клинические проявления, диагностика, лечение и профилактика вирусного заболевания, вызванного Mastadenovirus

Роль фосфолипидов в поддержании здоровья печени и организма животных

Энтериты у животных: многофакториальные заболевания кишечника, вызванные вирусами и другими патогенами, характеризующиеся сложной симптоматикой и требующие срочного лечения

Клеточные вакцины и их применение в иммунной терапии онкологических и аутоиммунных заболеваний

Септический шок у новорождённых: этиология, патогенез, диагностика и лечение

Иммунная профилактика и терапия: принципы, методы и безопасность применения вакцин и иммунобиологических препаратов

• Информатика
• Банковское дело
• Оценка бизнеса
• Бухгалтерское дело
• Валеология
• География
• Геология, Геофизика, Геодезия
• Религия
• Общая история
• Журналистика
• Таможенное дело
• История Казахстана
• Финансы
• Законодательство и Право, Криминалистика
• Маркетинг
• Культурология
• Медицина
• Менеджмент
• Нефть, Газ
• Искуство, музыка
• Педагогика
• Психология
• Страхование
• Налоги
• Политология
• Сертификация, стандартизация
• Социология, Демография
• Статистика
• Туризм
• Физика
• Философия
• Химия
• Делопроизводсто
• Экология, Охрана природы, Природопользование
• Экономика
• Литература
• Биология
• Мясо, молочно, вино-водочные продукты
• Земельный кадастр, Недвижимость
• Математика, Геометрия
• Государственное управление
• Архивное дело
• Полиграфия
• Горное дело
• Языковедение, Филология
• Исторические личности
• Автоматизация, Техника
• Экономическая география
• Международные отношения
• ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности), Защита труда