БИОПОЛИМЕРЛЕРДІ ЗЕРДЕЛЕУДІҢ ӘДІСТЕРІ

    МОДУЛЬ 1. БИОТЕХНОЛОГИЯДАҒЫ ҚОЛДАНЫЛАТЫН ФИЗИКАЛЫҚ ЖӘНЕ БИОФИЗИКАЛЫҚ
                                  ӘДІСТЕР.


                             ДӘРІС № 1. КІРІСПЕ


      Биотехнология обьектілеріне  вирустар,  бактериялар,  саңырауқұлақтар,
өсімдіктердің, жануарлардың, адамдардың жасушалары, биогенді заттар  жатады.
Кеңею өрісі вирустардан адамдарға дейін.  Биотехнологиялық  биообьектілердің
процестерінің басты параметрлеріне: тазалау, жасушалардың  көбею  жылдамдығы
мен вирустық бөлшектердің репродукциясы, биомолекулалардың  активтілігі  мен
тұрақтылығы жатады. Таңдалып алынған биотехнологиялық  биообьектіге  жағымды
жағдай туғыза отырып, осы жағымды  жағдайлардың  микроб  –  контаминанттарға
немесе  ластануға  да   жағымды   екенін   ескеру   қажет.   Контаминирлеуші
микрофлораға өсімдік және жануар культураларының  жасушаларындағы  вирустар,
бактериялар,  саңырауқұлақтар  жатады.   Мұнда   микроб   –   контаминанттар
биотехнологиялық  өндірістің  зиянкестері   болып   табылады.   Ферменттерді
биокатализаторлар ретінде  қолданғанда,  оларды  биотехнологиялық  процестің
ортасына сапрофитті микрофлора  енуін  болдырмау  үшін  изолирленген  күйден
сақтандыру  қажеттілігі  туындайды.  Биообьектінің   систематикалық   күйіне
тәуелсіз, практикада табиғи ұйымдастырылған бөлшектер мен нағыз  генетикалық
ақпараты  бар  жасушалар  немесе  жасанды   генетикалық   ақпараттандырылған
жасушаларды қолданады.
      Биотехнологияда өзіндік спецификалық әдістер бар:
    • Периодты үздіксіз режимде биообьектілердің  үлкен  масштабты  тереңдік
      культивирлеу;
    • Өсімдік және жануар ұлпаларының жасушаларын арнайы ортада өсіру.
      Биотехнологиялық биообьектілерді культивирлеу әдістері арнайы
      жабдық – ферментаторларда жүзеге асырылады.
      Биотехнологиялық  процестердің   химиялық   процестерден   ерекшелігі:
біріншіден, басты компонент қандай да бір биообьект болып  табылады.  Мұндай
обьектілер химиялың технологияда  болмайды.  Жоғары  температура  мен  қысым
биотехнологияда    тиімсіз.    Биотехнологиялық    процестер    биологиялық,
биохимиялық,  биоаналогты  болып  бөлінеді.  Біріншісінде  -   акариот   пен
прокариоттарды  қолдануға,  екіншісінде  –   ферменттерді,   үшіншісінде   –
химиялық синтезді қолдануға бейімделген.
      Биологиялық технологиялардың көптеген процестері ортақ болып табылады.
      Арнайы - өзіндік спецификалық  ерекшеліктері  бар  (пенициллин  өсіру,
тұмау  вирустарын  тауық  эмбриондарында  культивирлеу).  Осыған  байланысты
биотехнологиялық  процестер  микробиологиялық,  фито  –  зообиотехнологиялық
болады.
      Биотехнологиялық  процестер  шартты  түрде  биологиялық,  биохимиялық,
биоаналогты болып бөлінеді.
      Биологиялық   процестер   прокариот   пен   эукариоттарды    қолдануға
бейімделген.
      Биохимиялық процестер ферменттерді қолданса, биоаналогты процесте тірі
ағзаларға функционалды  жақын  химиялық  синтез  немесе  заттардың  жартылай
синтезі жатады.
      Процестерді 3 режимнің біреуін қолдану арқылы жүргізеді:
      - периодты
      - жартылай үздіксіз
      - үздіксіз
      Периодтық режимде процестерді басынан аяғына дейін  регламент  бойынша
жүргізеді, барлық операциялар аяқталған соң оны қайталайды.
      Жартылай үздіксіз режимде алымды – құйылымды процесс жүзеге асырылады,
биосинтез шыңында қандай да бір антибиотиктің культуралды сұйықтығының 30  –
70% алады да, бір мезгілде балғын қоректік ортаны қосады.
      Үздіксіз режимде культуралды сұйықтықтың алынуы  мен  балғын  қоректік
ортаны қосу үздіксіз  жүреді.  Фазалық  күйіне  байланысты  биотехнологиялық
өндірісте ингридиенттерді қатты фазалы, газды фазалы деп бөледі. Олар  газды
пайдалануға бейімделген.
      Процестердің орындалу шарттарына қарай:
   1. Бір сатылы
   2. Екі сатылы
   3. Көп сатылы.
      Бір  сатылы  процестер  бір  фазалы  күйдегі   жасушаларды   қолдануға
арналған.
      Екі сатылы процесте әр түрлі фазадағы жасушалар  қолданылады,  ал  көп
сатылы процеске генетикалық инженерия тән.
      Биотехнология  тірі  системада  өтіп   жатқан   физико   –   химиялық,
биохимиялық,  физиологиялық  процестерге  негізделеді,  нәтижесінде  энергия
бөлінуі,  өнімдердің  синтезі  мен  деградациясы,  ұйымдасқан  құрылымдардың
пайда  болуы  жүреді.  Осыдан,  биотехнологияда   ғылыми   және   өндірістік
мәселелерді шешуге арналған дайын үлкен материалды база болады.  Бұл  базаны
қолдануға шектеу жасайтын  мәселе  тірі  обьектілерде  жүретін  процестердің
толық меңгерілмеуі, техниканың жетіспеушілігі мен рентабелділікке  қойылатын
қатаң талаптардың қажеттілігі. Сондықтан тірі ағзалардың  ір  түрлі  түрлері
мен  топтары  және  олардың  жасушалары  биотехнология  ортасына   біртіндеп
енгізеді.
      Биотехнология  тек  қана  ғылыми  және  өндірістік  мәселелерді   ғана
шешпейді. Биотехнологияда үлкен методологиялық міндет  бар  –  ол  ғылыми  –
техникалық прогрестің көмегімен адамның тірі  табиғатқа  әсерінің  масштабын
үлкейтуін,  тірі  системалардың  адамның  тіршілік  шарттарына   қалыптасуын
жылдамдатады. Бұрын адамның тірі ағзаға әсер етуі  жасанды  іріктеумен  ғана
шектелген. Қазіргі кезде жасанды  іріктеу  биотехнологияда  тарихи  алғышарт
ретінде  қолданылады.  Олар  жоғарғы  деңгейде  эволюциямен  қабысатын   бір
құрылымдық жүйені көрсетеді.
      Биотехнология экологиялық таза және жоғары үнемді өнімдерді  өндіруші.
Бірақ  үлкен  прогресске  аяқ   басу   үшін   биотехнология   фундаментальді
ғылымдардың жетістігіне мұқтаж.




      ДӘРІС № 2. БИОТЕХНОЛОГИЯДА МЕМБРАНАЛЫҚ ҚҰРЫЛЫМДАРДЫ ЗЕРДЕЛЕУ ЖӘНЕ
                              ҚОЛДАНУ ӘДІСТЕРІ.


      Мембраналық бөлу әдістеріне жатады:
   1. Диализ және электродиализ.
   2. Қайтымды осмос.
   3. Микрофильтрация.
   4. Ультрафильтрация.
      Бұл әдістердің негізінде  осмос  құбылысы  жатыр  –  еріген  заттардың
диффузиясы көп мөлшердегі (1010 – 1011 1 м2) ұсақ саңылаулы – шел,  диаметрі
0,5 мкм аспайтын мембраналы жартылай өткізгішті айдау арқылы жүреді.
      Мембарана   түсінігіне   әдетте   полимерлі    немесе    неорганикалық
материалдардан жасалған және қоспа немесе ерітіндідегі әр түрлі  бөлшектерді
бөлуге қабілетті, көп қуысты  және  қуыссыз  тегіс  немесе  түтікті  айдауды
жатқызамыз.  Мембраналарды  қолдану  экономикалық  жоғары  үнемді  және   аз
қалдықты технологияларды жасап шығаруға мүмкіндік туғызады.
      Мембраналық процестердің ішінен интенсивті дамып келетін баромембаналы
процестер. Егер қайтымды осмос айтарлықтай дамыса, бұл  микрофильтрация  мен
ультрафильтрацияға  қатысты.  Баромембараналық  бөлу  әдістерінің   шекарасы
белгіленбеген және белгіленуі мүмкін емес деп есептеледі, себебі микро  және
ультрафильтрация  мен  қайтымды  осмос  кең  көлемде   физико   –   химиялық
сипаттамалар сияқты асып түседі.  Айтылған  әр  әдістің  ерекшеліктері  бар,
осыған байланысты олардың бірнеше классификациясы ұсынылған.
      Микрофильтрация     негізінен     қарапайым     фильтрацияға     жақын
гидродинамикалық  процесс  болып  табылады.   Микрофильтрация   спецификалық
ерекшелігі қатты фазаның  ұсақ  бөлшектерін  бөліп  алу  үшін  шел  диаметрі
0,1/10 мкм дейін мембраналарды сонымен  қатар  микроағзаларды  қолдану,  бұл
жағдайда  оны  стерилді  фильтрация   деп   атайды.   Сондықтан   фильтрация
процессіне  қарағанда  микрофильтрациядағы  диффузия   белгілі   бір   рөлді
атқарады.
      Ультрафильтрация  негізінде шелдерінің диаметрі 0,001 – 0,01 мкм дейін
мембраналарды қолдану жатыр. Ультрафильтрация  жасушалар  мен  молекулаларды
бөліп алу үшін қолданылады.
      Бөлудің мембраналық  әдістері  биологиялық  суспензияларға  қолданады,
бірқатар артықшылыұтары бар:
    1. Концентрлеу  мен  тазалау  агрегаттық  күйімен  фазалық  айналуларсыз
       жүзеге асырылады.
    2. Өндірілетін өнім жылулық және химиялық өндеулерден өтпейді.
    3. Биологиялық материалға  механикалық  және  аэродинамикалық  әсер  ету
       маңызды емес.
    4. Герметикалық және асептикалық шарттар оңай қамтамасыз етіледі.
    5. Аппаратуралық жаюдықталуы конструкцияға сәйкес,
    6.  Процесс   жоғары   энергияны   қажет   етпейді,   көбінесе   энергия
       ерітінділерге жұмсалады.
      Әр түрлі заттардың молекулаларын, атомдарын немесе  иондарын  жартылай
өткізгіш мембрана арқылы тасымалдау механизмі келесі теориялардың  біреуімен
сипатталады.
      Себу  теориясы  жартылай  өткізгіш  мембранада  еріткіштерді  өткізуге
жеткілікті  шелдер  бар  екенін  көрсетеді.  Бірақ  олар  еріген   заттардың
молекулалары мен иондарын өткізуге кішкентай.
      Молекулалық  диффузия  теориясы   полимерлі   мембранадағы   бөлінетін
компоненттердің  бірдей  емес  ерігіштігі  мен  диффузия  коэфицентінің   әр
түрлілігіне негізделген.
      Капиллярлы – фильтрациялық теория  мембрана  бетіндегі  және  ерітінді
көлеміндегі сұйықтық қабатының физико – химиялық құрылымына негізделген.
      Ұсынылған теориялардың ішінен кең тарағаны капиллярлы –  фильтрациялық
моделі.
      Мембраналық аппараттардың негізгі жұмыс  органы  –  жартылай  өткізгіш
мембраналары болып табылады.
      Мембраналар жоғары бөлгіш қабілетке ие, селективті, химиялық  тұрақты,
механикалық мықты, қымбат  емес  болуы  қажет.  Селективтігі  –  мембраналық
аппараттың басты технологиялық көрсеткіші.
      Мембрананың  селективтігі  еріген  заттың  молекуласының  өлшемі   мен
формасына  байланысты.  Мембраналарды  әр  түрлі   материалдардан   жасайды:
полимерлі пленкалардан, шыныдан, керамикадан т.с.с.
      Жартылай өткізгіш мембраналар ұсақ тесіктері бар  және  тесіктері  жоқ
түрлерге бөлінеді. Тесіктері  жоқ  мембраналар  арқылы  процесс  молекулярлы
диффузия есебінен  жүзеге  асырылады.  Мұндай  мембраналар  диффузионды  деп
аталып, компоненттері бір – біріне ұқсас  заттарды  бөлу  үшін  қолданылады.
Тесіктері  бар  мембраналар  негізінен  полимерлі  материалдардан  жасалады,
анизотропты және изотропты болып бөлінеді.
      Тесіктері бар мембраналарды әдетте  еріткіштерді  жою  жолымен  немесе
алдын – ала қосылған  полимерлі  еріткіштерден  түзілген  қосылғыштарды  жуу
арқылы алады.
      Мұндай әдіспен алынған мембраналардың жұқа беттік қабаты  бар  0,25  –
0,5 мкм. Мембраналық бөлу процесі беттің активті қабатында жүзеге асады.
      Кең таралған ядерлі мембраналар немесе нуклеопоралар. Бұл  мембраналар
жұқа  полимерлі  қабықшаны  зарядталған  альфа  –  бөлшектерді  сәулелендіру
арқылы алады.
      Ядролы мембрананың басты ерекшеліктері:
      - тесіктердің дұрыс домалақ формасы;
      - мембраналарды тесіктердің мөлшері мен санын алдын  –  ала  белгілеп
        алу;
      - тесіктердің бірдей мөлшері;
      - химиялық тұрақтылығы.
        Ядролы  мембараналар  карбонарлы  қабықшалардың   негізінде   алады,
тесіктерінің диаметрі 01, - 0,8 мкм дейін.
      Полимерлі мембраналармен қатар қатты  құрылымды  мембраналар  да  бар:
металды, кеуекті шыныдан жасалған, керамикалық.
      Металды мембраналар фольганың балқытылғаннан  алынған  компоненттердің
біреуін сілтісіздендіру немесе айдау  арқылы  жасалады.  Нәтижесінде  бірдей
мөлшерлі 5 – 0,1 мкм жоғары сапалы кеуекті мембраналар алады.
      Металды мембраналарды  алудың  келесі  әдісі  –  жоғары  температурада
ұнтақты металлургия тәсілімен алу.
      Мембраналық бөлу әдістерінің кемшіліктері:
     1. Мембраналарды дайындайтын кейбір материалдар тез тозады.
     2. Қатты фазада ерітінділерді өңдеуде қиындықтар туындайды.
      Борпылдақ  мембранадағы  биологиялық   ерітінділер   мен   суспензияны
селективті бөлудің басты заңдылықтары.
      Сұйықтары бөлудің негізгі мембраналық әдістеріне кері осмос, ультра  –
микрофильтрация жатады. Бұл әдістердің ортақ  сипаттамалары  –   ерітінділер
мен суспензиялардың компонеттерін  әр  түрлі  өткізгіштігі,  қозғалтқыш  күш
ретінде артық қысымды қолдануы, концентрлі поляризациямен күресу әдістері.
      Микрофильтрацияны  бөлінуші  жүйенің  фазалық  күйіне  байланысты,  ал
ультрафильтрация мен  кері  осмосты  өткізгіштік  механизмі  бойынша  шектеу
керек.
      Кері осмостық мембраналар 1  - 10 – 4 мкм артық  бөлшектерді  ұстауға,
ал ультрафильтрация мөлшері 1 – 10 – 3 мкм  бөлшектерді  ұстауға,  яғни  бұл
мембраналар  органикалық  иондар  мен   молекулаларды   ұстауға   қабілетті.
Сәйкесінше микрофильтрация 5 – 10 – 2  –  ден  10  мкм  дейінгі  бөлшектерді
ұстайды.
      Дегенмен әр түрллі мембраналық әдістердің шегін табу мүмкін емес.
      Микрофильтрацияның физикалық негіздері
      Ерітінділер мен суспензияларды микрофильтрация әдісімен бөлу бөлінетін
молекулалар мен бөлшектердің гидродинамикалық  мөлшеріне  негізделген.  Бөлу
процесі жартылай өткізгіштік теория мен  механизмі  мембрана  арқылы  өтетін
бөлшектердің  физико  –  химиялық,  молекулааралық  факторларына  байланысты
сипатталады.
      Процестің анализі мен есептеулері бірыңғай позицияда жүргізіледі.  Бұл
процестердің барысында мембаранада әдетте  тұнба  қабаты  түзіледі  де  бөлу
кезінде қиындықтар туғызады.
      Ерітіндінің және  еріген  заттың  құрылымы  ультра  –  микрофильтрация
процесіне маңызды әсер етеді.
      Микрофильтрацияның  қолдану  обьектісі  –  дисперсиялық   ортасы   мен
дисперсті фазасы  бар  коллоидты  жүйелер.  Бұл  фазаларды  бөлуде  көбінесе
сұйықтықты микрофильтрациялау мақсаты тұрады.
      Бөлудің барлық процестерінде басты рөлді бөлшектердің адгезиялық  және
электростатикалық әрекеттестігі алады.
      Биологиялық жасушалық обьектілер лиофильді жүйені көрсетеді. Олар үшін
лиофобты жүйеге қарағанда дисперсті  фазаның  заттарының  дисперсті  ортамен
молеклааралық   әрекеттесуі   тән.   Мұндай   әрекеттесу   дисперсті    фаза
бөлшектерінің айналасына  гидратты  қабықшаның  түзілуіне  әкеледі.  Сонымен
қатар микроағзалар жасушасының  заряды  болады.  Зарядтың  көлемі  әр  түрлі
болады. Бір түрлі  микроағза  үшін  ортаның  жағдайына  байланысты  зарядтың
көлемі өзгеріп отырады.  Жасушада  зарядтың  болуы  биологиялық  суспензияны
электролиттердің ерітіндісі ретінде қарастыруға мүмкіндік береді.
      Концентрлі поляризация
      Ерітінділер мен суспензияны жартылай өткізгіш мембрана  арқылы  бөлген
кезде еріткіш жақсы  өтеді.  Осыған  байланысты  мембрнан  бетіндегі  еріген
заттың концентрациясы өседі.
      Мембрана бетінде еріген заттың концентрациясы жалпы  көлемінен  жоғары
қабаттың пайда болуы,  концентрлі  поляризация  атауын  иеленді.  Концентрлі
поляризацияның фильтрацияға әсерінің теріс жақтары бар, олар:
      - Ерітіндінің осмостық қысымының  өсуіне  байланысты  тиімді  қысымның
төмендеуі. Бұл процестің және селективтіліктің  төмендеуіне  әкеліп  соғады,
сонымен қатар мембраналардың жұмыс істеу мерзімі қысқарады,  ал  бұл  еріген
заттың концентрациясына байланысты.
      - Концентрлі поляризация  мембрана  бетін  ерітіндіден  бөліп  тұратын
шекаралық қабаттың түзілуіне байланысты. Бұл  қабаттың  қалыңдығы  орнатудың
гидродинамикалық  шарттарымен  анықталады.   Бұл   қабаттың   концентрациясы
ерітіндінің қозғалу режиміне байланысты.
      Концентрлі поляризацияның екі режимі ажыратылады:
      -  гел  түзілмей  тұрып,  мембрана  бетіндегі  концентрация  Cw   гел
        түзілгендегі Cg концентрациядан төмен;
      - гелді поляризация режимі, Cw – Cg мембранада гель қабаты түзіледі.
      Мембрананың  жоғары  бөлігінде   гельдің   бөлінуі   микрофильтрациялы
мембрананың өсуіне және өтімділігінің төмендеуіне әкеледі.  Бірақ  жорамалға
сәйкес,   мембрананың   шоғырлану   поляризациясы   кезіндегі   өтімділіктің
төмендеуі  гель  қабатымен  емес  модификациясымен  жүреді,  осылайша   оның
мөлшері R  шамасына  дейін  азаяды.  Осыдан  динамикалық,  гельдік  мембрана
түзіледі.  Осы  кезде  мембранада   ажыратудың   классикалық,   капиллярлық-
фильтрациялық механизмі жүзеге асады.
      Концентрациялы поляризацияның микрофильтрация процесіне зиянды  әсерін
төмендету  үшін   бірнеше   тәсілдерді   қолдануға   болады:   температураны
жоғарылату  (нәтижесінде  тұтқырлық  төмендеп,  гель  жасау   концентрациясы
жоғарылайды), электр өрісі қолданылады, тангенс ағынының  жоғары  жылдамдығы
және фильтрацияның пульсациялық режимі қолданылады.
      АЖЫРАТУ СИПАТЫНА СЫРТҚЫ ФАКТОРЛАРДЫҢ ӘСЕРІ
      Жұмыс қысымын таңдау процес түріне, бөлінетін ерітіндінің табиғаты мен
концентрациясына,       мембрананы       қолдану       типіне,       аппарат
нұсқасына,гидравликалық кедергіге  және  т.с.с  байланысты.  Микрофильтрация
үшін  жұмыс  қысымы  0,003-0,1  МПа  құрайды  және   әрбір   ерітінді   үшін
экспериментальды жолмен анықталады.
      Жұмыс қысымының жоғарылауы фильтрация жылдамдығының ұлғаюына әкеледі.
      Мембранаға жоғары  қысымның  түсуі  нәтижесінде  қалдық  деформациялар
түзіледі: қысымды төмендеткен жағдайда мембрана құрылымы  бастапқы  жағдайға
оралмайды.
      Микрофильтрация кезіндегі температураның  мембрананың  өтімділігі  мен
сұрыпталуына  әсері   туралы   талдау   мынаны   көрсетеді:   температураның
жоғарылауы өтімділіктің де, сұрыпталудың  да  жоғарылауына  әкеледі.  Осыдан
пермеата    тұтқырлығы,    сонымен    қатар    мембрананың    концентрациялы
поляризациясының әсері төмендейді.
      Еріген  заттардың  шоғырлануын  төмендету  кезінде  мембрананың  жұмыс
сипаты меншікті өнімділігі және таңдаулылығы өзгереді


     № 3 ДӘРІС. БИОТЕХНОЛОГИЯДА ҚОЛДАНЫЛАТЫН ФИЗИКАЛЫҚ ЖӘНЕ БИОФИЗИКАЛЫҚ
                                  ӘДІСТЕР.


      Ферментация  процесінің  аяқталуынан  кейін  культуральды   сұйықтықта
олардың тіршілік әрекеттерінің  өнімдері,  қоректену  ортасының  қалдықтары,
көбікті өшіргіш, еритін және ерімейтін заттар болады.  Биосинтездің  негізгі
өнімі ретінде микроорганизмдердің өзі  немесе  культуральды  сұйықта  еріген
немесе микроорганизмдердің торындағы метаболиттер болуы мүмкін.
      Тұтас өнімді алу үшін  барлық  жағдайда  микроорганизмдердің  мөлшерін
культуральды сұйықтықтан алып тастау керек.
      Культуральды сұйықтық әдетте өте күрделі  қоспа  болып  табылады  және
олардың  құрамында  физика-химиялық  қасиеттері  бар  компоненттері  болады.
Еріген  минералды  тұздарға,  көмірсуларға,   ақуыздарға   және   басқа   да
органикалық  заттарға  қарағанда   культуральды   сұйықтықтардың   құрамында
полидисперлі  коллоидті  бөлшектер  көп  кездеседі.   Олар   осыған   сәйкес
көпқұрамды ерітінді ғана емес, сонымен қатар  суспензиялар  болып  табылады.
Осы суспензиялардың  дисперлі  фазасы  микроорганизмдердің  торларынан  және
құрамында ұн, жүгері қоспалары бар қатты бөлшектерден  тұрады.   Культуралды
сұйықтықтың құрамындағы микроорганизмдердің мөлшері  өте  төмен.  Әдетте,  1
литрде 5-10 г құрғақ биомасса болады.
      Өндіріс жағдайында күрделі фильтрленетін суспензиялардың көп  мөлшерін
өңдеу үшін көп энергия жұмсау қажет.
      Микроорганизмдердің торлы биомассасын культуральды сұйықтықтан ажырату
тәсілдерін былайша бөлуге болады:
      - механикалық (қорғау, фильтрлеу, центрифугалау)
      - жылытехникалық (сушка).
      Микробиологиялық синтездің көптеген тұтас өнімдері тұрақты  емес  және
оларға көптеген факторлар әсер етуі мүмкін. Мысалы, ақуыздар  қыздыруға  өте
рН   ортасының  өзгеруіне,  көптеген  физикалық  және   химиялық   әсерлерге
сезімтал болып келеді.
      Көп жағдайда тұтас өнімді бір ғана тәсіл арқылы анықтау  мүмкін  емес.
Сол себептен бірнеше тәсілдер қолданылады.
      МИКРОБИОЛОГИЯЛЫҚ  СИНТЕЗДЕГІ  ӨНІМДЕРДІ  ШОҒЫРЛАНДЫРУ   ЖӘНЕ   АНЫҚТАУ
ТӘСІЛДЕРІ.
      Бұл тәсілдерді таңдауда келесі факторларды ескеру қажет:
      1. Культуральды сұйықтықтың физикалық-химиялық қасиеттері.
      2.  Өнімнің  қасиеттері  (термолабильді,  әртүрлі  химиялық  әсерлерге
тұрақтылығы және т.б.).
      3.  Өнімнің  соңғы  формасына  талаптар  (тазалық  және   шоғырландыру
деңгейі).
      4. Технологиялық және  технико-экономикалық  көрсеткіштері  показатели
(өнімнің шығуы, выход продукта,  жабдықтар  өнімділігі,  одан  әрі  өңдеудің
қажеттілігі және т.б.).
      Культуральды  сұйықтықтан  микробиологиялық  синтез  өнімдерін   бөліп
алудың барлық тәсілдерін екі топқа бөлуге болады:
      1. Экстракция, ионды  алмасу,  адсорбция,  кристаллизация  –егер  өнім
ерітіндіде болса.
      2. Тұндыру, фильтрлеу,  центрифугалау,  сепарирлеу–  егер  өнім  қатты
болса.
      Көп жағдайда тұтас өнімді бір ғана тәсіл арқылы анықтау  мүмкін  емес,
сол кезде бірнеше тәсілдер қолданылады, нәтижесінде өнімді  еритін  формадан
ерімейтін формаға ауыстырады (немесе  керісінше).  Бұл  жағдайда  осаждение,
фильтрлеу,    центрифугалау,    сепарирлеу    және    мембрана     тәсілдері
(электродиализ, ультра және микрофильтрация)арқылы  өңдеуге  және  тазартуға
болады.
      Тұндыру (седиментация) –ауырлық күші әсері арқылы дисперлік жүйелердің
қабыршақтану және дисперлік фазаны тұнба ретінде бөліп алу процесі.
      Седиментацияның   қарапайым   тәсілін–қорғауды   келесі    жағдайларда
қолданады:
      1. Диаметрі 3 мкм астам болғанда және броун қозғалысы қорғау  тәсіліне
әсер етпеген жағдайда.
      2. Тұрақты өнімдер болған жағдайда.
      3. Басқа тәсілдерге қарағанда, шығынның аз болуы.
      4. Бөлшектерді мөлшері бойынша фракцияларға бөлген жағдайда.
      5.  Егер  суспензияны  екі  фракцияға  бөлген  жағдайда  –тұнба   және
тұнбаасты сұйыққа.
      Биомасса тұндырудың  жылдамдығы  секундына  10-6  –  10-7  м  құрайды.
Процесті жылдамдату үшін мыналарды қолданады:
      1. Коагулянты – бөлшектерді  агрегатты-тұрақсыз  жағдайға  ауыстыратын
заттар.
      2. Флокулянты – коллоидты  құрылымдарды  жоюға  және  ірі  қауыздардың
тұзілуіне әкелетін заттар.
      Коагулянттар орнына әдетте  желатинді,  балық  желімін,  казеинді,  ал
флокуляттар орнына   -  метилцеллюлозаны,  пектинді,  натрийальгинатын  және
т.б. қолданады.
      ЦЕНТРИФУГАЛАУ
      Центрифугалау–орталық күштің  әсері  арқылы  біртекті  емес  жүйелерді
бөлу. Ол үшін әртүрлі конструкциялардың центрофугасы қолданылады.
      Бөлуге жоғары әсері бар және тарельчатты  барабаны  бар  центрофугалар
сепаратор  деп  аталады.  Микробиологиялық  өндірісте  сепараторлар  кеңінен
таралған. Сепараторлар тұнбаның 60-90% дейін ылғалдылығын ұстап тұра  алады.

      Соңғы  жылдары  сепаратордың  сепарирлеу  процесін  автоматты  режимде
жүргізетін арнайы герметикалық түрлері шыққан.
      Центрифугалауды қолдану салалары:
      1.  Биомассаны  культуральды   сұйықтықтан   бөліп   алу   (ашытқылар,
бактериялар, саңырауқұлақтар).
      2.  Микробиологиялық  синтездегі  кейбір  тұтас  өнімдерді  бөліп  алу
(антибиотиктер, ферменттер, витаминдер және т.б.),
      3. Экстракция кезінде түзілетін эмульсияны бөлу.
      Центрифугалаудың кемшіліктері:
      1. конструкция күрделілігі,  энергия  сыйымдылығының  жоғарылығы  және
құны.
      2. Пайдалану күрделілігі (тұрақсыздық, вибрация, шу, үнемі  тазалаудың
қажеттілігі).
      3. Орталық күштің торына әсер ету, Воздействие на клетку  центробежной
силы, қыздыру.
      Центрифугалаудың  және  сперирлеудің  басты  артықшылықтары  –  жоғары
өнімділік және шоғырлану.
      ФИЛЬТРЛЕУ
      Фильтрлеу–кеуекті қалқа арқылы суспензияның қатты және  сұйық  фазасын
өткізу арқылы бөлу.
      Фильтрлеудің соңғы мақсаты–қатты және сұйық фазаны  алу  (оның  біреуі
қалдық зат).
      Фильтрлеу -  фильтрлі  қабырғаның  екі  жағынан  құрылатын  жылдамдығы
қысымға пропорционал болып келетін гидродинамикалық процесс.
      Фильтрлеу процесіне әсер ететін факторларды екі топқа бөлуге болады:
      1. Макрофакторлар–қысым  айырымы,  тұнба  қабығының  қалыңдығы,  сұйық
фазаның тұтқырлығы және т.б. Бұл  факторлар  танымал  және  құралдар  арқылы
бақыланып отырады.
      2. Микрофакторлар–фильтрлі  қабырғаның,  тұнба  бөлшектерінің  мөлшері
және формасы, бөлшектердің жоғарғы жағындағы электрлік  қабаттың  қалыңдығы.
Бұл факторлар көп  зерттелмеген  және  оларды  тек  қосымша  әдістер  арқылы
сипаттайды. Дәл осы микрофакторлар фильтрлеу  процесіне  әсер  етіп,  оларды
масштабтауды қиындатады.
      Культуральды сұйықтықты фильтрлеу  кезінде  қарсылық  көрсете  білетін
қауыз тәрізді сілікпелер немесе майда дәнді тұнбалар түзіледі.  Фильтрлеудің
орташа жылдамдығы сағатына 50 л/м2 құрайды.
      Фильтрлеу жылдамдығын арттыру үшін әдетте мына екі тәсілді  қолданады.

      1. Суспензияларды алдын-ала өңдеу.
      2. Қосымша фильтрлі материалды қолдану. Культуральды сұйықтықты алдын-
ала өңдеу тұтас өнімді сұйық немесе қатты фазаға аударуға, фазаларды  бөлуге
және одан әрі тазартуға жарамды өнімді  алуға  мүмкіндік  береді.  Алдын-ала
өңдеудің нәтижесінде бөлшектердің коагуляциясы жүреді.
      Алдын-ала өңдеудің келесі тәсілдері кеңінен дамыған:
      1. Қышқыл коагуляция (төмен рН-қа тұрақты антибиотиктерді анықтау үшін
қолданылады).
      2. Электролиттермен өңдеу.
      3. Жылы коагуляция (өнімді 70-80°С дейін қыздырған жағдайда ықтимал).
      4.  Химиялық  агенттердің  қысымы  кезіндегі  толықтырғыштардың  пайда
толуы. Қосымша фильтрлі материал ретінде фильтрлі сұйыққа толықтырғыш  болып
келетін немесе жерасты  қабат  ретінде  фильтрдің  жоғары  жағына  қойылатын
фильтрлі ұнтақ қолданылады.
      ЭКСТРАКЦИЯ
      Экстракция  —  қатты  және  сұйық   қоспаларды   таңдау   (селективті)
еріткіштері (экстрагенттер) арқылы бөлу процессі.
      Экстракцияның   физикалық    мәнібайланысқан    кезінде    бір    фаза
компоненттерінің (сұйық немес қатты) сұйық экстрагент фазасына  ауысу  болып
табылады.
      Экстракцияпроцессі әдетте екі фазалы жүйеде жүреді:
      «қатты дене-сұйық» немесе «сұйық-сұйық».
      Экстракцияның қолданылу  саласы:  антибиотиктерді,  витаминдерді  және
аминқышқылдарын анықтап тазарту.
      Әдістің артықшылығы:
      1. шығынның аз болуы.
      2. экстракциялы процесстердің жоғары жылдамдығы.
      Әдістің кемшілігі: зиянды, жарылғыш органикалық ерітінділерді қолдану
      ИОН АЛМАСУ
      Ион алмасу өз алды сорбционды процесс болып табылады.
      Адсорбция –газ қоспасынан  немесе  ерітіндіден  адсорбент  қатты  заты
арқылы тұтас өнімнің бір немесе бірнеше компоненттерін жою процесі.
      Адсорбция процестері  (масса тапсырудың басқа  да  процестері  сияқты)
таңдаулы  болып  келеді.   Осының  негізінде  десорбция  процесін  жүргізуге
болады.
      Алғаш биологиялық  белсенді  заттар  мен  антибиотиктердің  сорбционды
әдістері  молекулярлық  сорбенттерді  (белсендірілген   көмірлер,   алюминий
тотығы және т.б.)қолдануға негізделген.
      Қазіргі таңда таңдаулығымен  және  жоғары  ерекшелігімен  сипатталатын
ионалмасу сорбенттері (иониттер) жасалған.
      Иониттер–құрамында   белсенді   иондары   бар   және   осы    иондарды
электролиттердің иондарымен алмастыруға қабілетті, суда немесе  еріткіштерде
ерімейтін органикалық және органикалық емес заттар.
      Көбінесе синтетикалық ионалмасу смолдары (КУ-2, КБ-4, КБ-ЧП-2, КМД, АВ-
17, ЭДЭ-10 және т.б.)
      Ионогенді топтардың болуына байланысты  иониттерді  2  негізгі  класқа
бөлуге болады:
      1.Құрамында – катиониттер (ерімейтін  қышқылдар)  қышқыл  топтары  бар
ионалмасу сорбенттері.
      2. Құрамында  аниониттер  (ерімейтін  негіздер)  негізгі  топтары  бар
ионалмасу сорбенттері.
      Иониттер антибиотиктерді өңдеу технологиясында кеңінен қолданылады.


      КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ
      Кристаллизация – ерітінділер мен балқытпалардан қатты фазаны  крисстал
түрінде шығару.
      Антибиотиктердің  және  басқа  да   биологиялық   белсенді   заттардың
кристализациясы ерітінді температурасын өзгерту  нәтижесінде  немесе  оларды
аз  еритін  химиялық  формаға   ауыстыру   негізінде   ерітіндіні   азайтуға
негізделген.   Соңғысы  рН  ерітіндісінің  өзгеруімен  немесе  соған  сәйкес
реагенттің қосылуымен жүреді.
      Кристаллизация антибиотиктерді қатты күйінде алу  ғана  емес,  сонымен
қатар қоспаларды тазартудың маңызды құралы болып табылады.
      Кристаллизация әдісі антибиотиктерді  (тетрациклин,  эритромицин  және
т.б.), витаминдерді, полисахаридтерді өнім алу технологиясында  қолданылады.





      БУЛАНУ
      Булану–сұйықтықты  жылыту  кезде  еріткішті  буландыру  арқылы   сұйық
ерітіндіні   шоғырландыру   процесі.   Көп   жағдайда   булану    ерітіндісі
кристализацияға ұшырап жатады.
      Булану нәтижесінде алынатын қоюланған ерітінділер мен қатты заттар тез
өңделіп, сақтауға және көшіруге ыңғайлы болып келеді.
      Әдетте антибиотиктерді өндірістерде буландыру  вакуум  ішінде  60-70°С
температурада  жүзеге  асады,  сол  себептен   бұл   әдіспен   термолабильді
биологиялық белсенді заттарды өңдеуге болмайды.




      ДӘРІС № 4. БИОПОЛИМЕРЛЕРДІ ЗЕРДЕЛЕУДІҢ ӘДІСТЕРІ.


      Биополимерлер    —    бұл    тірі     организмдермен     синтезделетін
жоғарымолекулярлы қоспалар. Олардың  кейбіреуінің  физикалық  және  химиялық
қасиеттері  бар  және   азық-түлік,  қайта  өңдейтін  және   фармацевтикалық
өнеркәсіпте қолданылады. Рекомбинатты ДНК технологияларының  пайда  болуынан
жаңа  биополимерлер  құруға,  синтетикалық  өнімдерді  олардың   биологиялық
заттарымен  ауыстыруға,   физикалық   және   құрылымдық   сипатын   жақсарту
мақсатында    биополимерлерді    түрлендіруге,    өнеркәсіп    процестерінің
тиімділігін жоғарылатуға, олардың бағасын төмендетуге мүмкіндік туды.
      Кстантты шырышты алу  мақсатында  Xanthomonascampestris  рекомбинантты
бактерияларды жасау.
      Xanthomonascampestris — құнды коммерциялық биополимер, ксант  шырышын,
жоғары   молекулярлы   экзополисахаридті   синтездейтін   грамотеріс   ауалы
топырақты бактерия.  Оның құрылымдық қаңқасы глюкоза молекуласынан  құралған
сызықтық полимерлі шынжырдан тұрады. Әрбір екінші  глюкоза  қалдығынаглюкоза
қышқылының  бір  қалдығынан   және   маннозаның   екі   қалдығынан   тұратын
үшсахаридті бүйірлі шынжыр қосылған.  Ксантты шырыш жабысқақ  болып  келеді,
агрессивті  физикалық  және  химиялық  ортада  бұзылмайды  және   физикалық,
химиялық қасиеттері бойынша пластикке ұқсайды.  Оны  негізінде  тұрақтанған,
эмульгивті, суспендиялы агент ретінде  қолдануға  болады.  Ксантты  шырыштың
жақсы  коммерциялық  өндірісі  үшін  X.  campestris  арзан  және  қолжетімді
көміртекте  өсіру  керек.  X.   campestris   лактозадан   басқа   глюкозаны,
сахарозаны және крахмалды пайдаға асырып  жатыр.  Ірімшікті  өндірген  кезде
сарысу көп бөлінеді. Оның құрамында су (94—95%),  лактоза  (3,5—4%),  ақуыз,
минералды заттар және төменмолекулярлы органикалық қоспалар  бар.  Сарысудың
көп мөлшерін сүт өнімі береді, ал оның утилизациясы бұл  үлкен  мәселе.  Көп
жағдайда сарысуды өзен мен көлдерге  құяды,  соның  салдарынан  қажетті  ауа
азаяды және көптеген су организмдері жойылып кетеді. Қоқыс  тастайтын  жерге
сарысуды апарып төгу  өте  қымбатқа  түседі  және  грунт  суларының  ластауы
мүмкін.  Қаржының  көбі  сарысудың  қатты  компоненттерін  жоюға  жұмсалады.
Осының барлығы сарысуды тиімді өңдеудің тәсілдерін табуға мәжбүрледі.
      Сарысуды құнды өндірістік микроорганизмдерді өсіргенде  көміртек  көзі
ретінде қолдануға болады. X. campestris  сарысуда  өсу  қабілетіне  ие  болу
үшін келесі тәсіл жүргізілген. lacZY E.  Coli  гендерін,  галактозидаза  мен
лактозопермеазаны,   X.   Campestris   бір   бактериофагасының   бақылауында
болатындай плазмидаға енгізген. Бұл конструкцияныE.  Coli,  содан  кейін  X.
Campestris ауыстырған. Плазмидасы бар трансформанттарды көміртектің  негізгі
көзі  ретінде  глактозаны  қолдана   отырып   синтездеген,   сонымен   қатар
көміртекті, глюкозаны, лактозаны және сарысуды қолдана отырып, көп  мөлшерде
ксант шырын шығарған.  X.  Campestris  глюкозада  өскен  жағдайда  ғана  көп
мөлшерде ксант шырын шығаратынын атап өту керек.
      Меланин биосинтезінің гендерін шығару
      Меланиндерсорып алатын  биополимерлердің  көптеген  түрлерін  жасайды,
оларды жануарлар, өсімдіктер, бактериялар және саңырауқұлақтар  синтездейді.
Бұл  пигменттерді  күннен  қорғайтын   экран   мен   жамылғыларды   жасауда,
косметикалық құралдарға қосымша ретінде қолдануға болар еді.  Қазіргі  таңда
меланиндерді табиғи көздердің экстракциясынан немесе химиялық синтез  арқылы
алады. Рекомбинантты ДНҚ технологиялары арқылы әртүрлі физикалық  қасиеттері
бар арзан ірі масштабты меланин өндірісін жасауға болады.
      Меланиндер — бл индол, бензотиазол және аминқышқылы қалдығынан тұратын
жүйесіз  жүйелер.   Олардың  биосинтезінің  бірінші   кезеңі   мыс   құрамды
ферментмонооксигеназойтирозиназбен          катализденіп,          тирозинді
дигидроксифенилаланинхинонға дейін қышқылдандырады.  Полимеризацияның  соңғы
кезеңі каталитикалық реакция емес, нехинонды қоспалардың химиялы  табиғатына
сәйкес әр түсті өнімдер береді: қара, қоңыр, сары, қызыл және  күлгін.
      Streptomycesantibioticus     бактериалды     клеткаларында     меланин
биосинтезінің гендері табылған. Оның құрамында екі ашық санау шеңбері  (ORF)
бар, оның біріншісі тирозиназаны (мол.массасы 30 600), ал екіншісі  белгісіз
функциялар арқылы ақуызды (мол.массасы 14  800)  кодтайды.  Осы  екі  геннің
меланин синтезіне қажет екендігін анықтау  үшін  гендерді  алдымен  Е.  соli
векторына ауыстырады, мұнда бір конструкцияда тек қана тирозиназдың  гендері
ғана, ал екіншісінде тирозиназ және ORF43  гендері  бар.  Тирозиназ  деңгейі
маңызды емсе, ал меланин биосинтезі үшін   екі  геннің  де  өнімдері  қажет.
Табиғи  жағдайда  дигидроксифенилаланинхинон  түзілгеннен  кейін   полимерге
әртүрлі  төмен  молекулярлы  қоспалар  (нехинондар)  кіреді.  Осыны   ескере
отырып, әртүрлі көлемде төменмолекулярлы қоспаларды қоса отырып,  меланиннің
физикалық және химиялық қасиеттерін өзгертуге болады.
      Адгезивті қасиеттері  бар  жануар  биополимерлерінің  микробиологиялық
синтезі.
      Mytilusedulis алғаш көрсетілген ақуызды алу әдісі анықталды.  Бұл суға
төзімді ақуыз өте мықты желілерді түзеді,  сол  арқылы  моллюскалар  әртүрлі
жоғарғы қабатқа бекиді. Биополимер секрециясынан кейін полимерлік  шынжырлар
арасында көптеген көлденең сшивкалар  түзіледі.  Бұл  гендердің  нуклеотидті
тізбегін құруға және гибридизациялы зондтарды жүйелеуге мүмкіндік  бермейді.
Осының  негізінде  адгезивті  ақуыздың   клетка   ішіндегі   негізгі   көзін
анықталды.  Биохимиялық  зерттеулер  көрсеткендей  ол  серинге,   треонинге,
лизинге, пролинге және тирозинге  бай  болып  келеді.  60-тан  70%-ға  дейін
аминқышқылдарының құрамында  гилроксильді  топтары  бар,  бірақ  пролин  мен
тирозиннің көпшілігі 3 немесе  4  гидроксипролинге,  3,4  дигидроксипролинге
гидроксилденген. Аминқышқылдарының тізбегі анықталғаннан кейін, оның  негізі
Ala-Lys-(Pro   немесе   Hyp)-Ser-(Tyr   немесе    DOPA)-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys
декапептидтерінен тұратындығы анықталды.
      Биссалды  темір  негізінде  мРНК-н  алынған  кДНК  қорынан   адгезивті
ақуыздың  кДНК  130  кДа  оқшауланған.  Адгезивті  ақуыз  және  кДНҚ  ерекше
қасиеттерге  ие.  Біріншіден,  кДНК  құрамында  гомологинді   рекомбинацияны
көтеретін және тізбек бөліктерін  жоғалтатын  көптеген  қайталаудан  тұрады.
Екіншіден, ақуыздың аминқышқылдарының 70%-ға жуығы пролиннің, лизиннің  және
тирозиннің еншісінде, сол себептен  тРНК  аминоацилдің  көп  мөлшерін  алуға
мүмкіндік жок.
      Осы қиындықтарды жеңу үшін адгезивті ақуыздың немесе оның фрагменттері
ашытқылы экспрессивті  қатарға  тұрып,  осы  векторларды  ашытқылы  клеткаға
енгізген. Экспрессиядан  кейін  мол.массасы  20-100  кДа  болатын  адгезивті
ақуыздың белсенді формалары алынған, бірақ  олардың  еншісінде  2-н  5  %-ға
дейін клеткалы  ақуыздың  мөлшері  бар.  Адгезивті  ақуыздың  гені  химиялық
жүйеленгеннен кейін, экспрессия жоғары деңгейге  жетті.  Адгезивті  ақуыздың
декапептиді ДНҚ түрін қолдана отырып, ақуызды 25 кДа кодтаған  ұзындығы  600
п.н. жететін синтетикалық генді жасады. Оның негізгі  қайталанатын  ұзындығы
30  п.н.  болып  келетін  бірлігі  Е.  coli  экспрессиясы  үшін  кодондардан
құралған,  ал  маңыздысы   Т7   фагасының   бақылауында   болған.   Көптеген
микроорганизмдер  тек  посттрансляциялықегидроксилирді  аминқышқылды  жүзеге
асыруға қабілетті, сол себептен ақуыз  соңына  дейін  гидроксилді  болмайды.
Оның кейбір тирозинді қалдықтары DOPAкөшірілмейді. Осы  мәселені  шешу  үшін
invitro гидроксилді  жүйе  құрылған,  онда  бактериалды  тирозиназ  аскорбин
қышқылының  негізінде  тирозиннің  қалдығын  гидроксилдендірді.   Охинондағы
DOPAқалдығының  қышқылдануын  тоқтату  үшін  аскорбин  қышқылын   реакциялық
қоспаға қосқан. Бұл процесс қатаң  қадағалну  керек,  өйткені  ол  адгезивті
ақуыздың бірліктерін қосуға  әкеледі.  Көптеген  басқа  да  желімдер  немесе
адгезивтер сияқты, адгезивті ақуызды қолданар алдында активтендіру қажет.
      Қышқылдану  кезінде  адгезивті  ақуыз  шынының,   полистиролдың   және
коллагеннің  жоғары   қабатымен   байланысты.   Байланыс   беріктілігі   мен
ерекшелігі адгезивті ақуыздың қоспасына  басқа  ақуыздарды  қосып  өзгертуге
болады. Бұл ерекше қасиеті  бар  желімдерді  және  медицинада  соның  ішінде
стоматологияда қолдануға болатын түрлерін шығаруға мүмкіндік береді.
      Каучуктың микробиологиялық синтезі
      Цис-1,4-полиизопрен табиғи каучугі –  әртүрлі  өсімдіктерден  алынатын
кеңінен  қолданылатын  биополимер.   Оның   биосинтезі   қарапайым   қанттың
айналуынан басталады және құрамында 17 ферментативті реакциялары бар.  Соның
соңғысында      аллилпирофосфат      түзілетін      изопентенилпирофосфаттың
полимеризациясы жүреді. ORF438 кодтайтын белок мыс  иондарын  белсенді  емес
негізін салушы тирозиназыапотирозиназаға жеткізуі  мүмкін.  Ол  мыс  иондары
болған      жағдайда      активтенеді.      Табиғи      шарттар      бойынша
дигидроксифенилаланинхинонның   тирозиназа   қатысымен    түзілуінен   кейін
полимерге әртүрлі төменмолекулалы қосылыстар (незинондар)  қосылады.  Осының
есебінен осы  полимер  биосинтезінің  негізгі  гендері  енгізілген  Е.  coli
жасушаларында синтезделетін меланиннің химиялық және  физикалық  қасиеттерін
өзгертуге болады.
      Адгезивті  қасиеттері  бар  жануар   биополимерінің   микробиологиялық
синтезі.
      Алғаш рет Mytilusedulis мидийден бөлініп алынған адгезивті  қасиеттері
бар ақуыз алудың қымбат  емес  тәсілдерін  жобалау   әлдеқайда  перспективті
болып  саналады.  Бұл  суда  ерімейтін  ақуыз  өте  мықты  жіпшелер  түзеді.
Солардың көмегімен малюскалар әртүрлі беттергі жабысады.  Бірден  биополимер
секрециясынан кейін  биссаловоя  железа  деп  аталатын  полимерлі  тізбектің
арасында  көптеген  көлденең  тігістер  түзіледі.   Сол   тігістер   олардың
аминқышқылдарының  реттілігін  анықтауды  қиындатады.   Бұл   өз   кезегінде
гибридизационды  зондтарды  синтездеуге  және  олардың  гендерін   кодтайтын
нуклеотидті  реттілікті  орнатуға  мүмкіндік  бермейді.  Адгезивті  ақуыздың
жасушаішілік    негізін     салушыны     (130     кДа-     негіз      салушы
(предшественник))бөліп  алуға   мүмкіндік   туды.   Биохимиялық   зерттеулер
көрсеткендей, оның құрамында  бағалы  серин,  треонин,  лизин,  пролин  және
тирозин бар. Осы  аминқышқылдарының  60-70%-ын  гидроксильдік  топ  құрайды,
сонымен қатар  көптеген  пролин  мен  тирозиннің  қалдықтары  3-  немесе  4-
гидроксипролинге (Hyp) және  сәйкесінше  3,4-дигидроксифенилаланинге  (DOPA)
гидроксилденген. Одан  басқа  аминқышқылдарының  реттілігі  анықталған  соң,
негіз салушы көбінесе  қайталанатын декапептидтерден тұратыны белгілі  болды
( Ala-Lys-(Pro немесе Hyp)-Ser-(Tyr немесе DOPA)-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys )
      Биссальді темірден бөлініп шығарылған,  мРНК  негізінде  алынған  кДНК
кітапханасынан  адгезивті  ақуыздың  негізін   салушы   -   кДНК   130   кДа
изолирленді, және оның кДНК-сы клондауды күрделендіретін,  сәйкес  гендерлің
экспрессиясы  және  функционалды   адгезивті   ақуыз   алу   сияқты   ерекше
қасиеттерге ие. Біріншіден, кДНК-да қайталаудың саны көп,  ол  өз  кезегінде
гомологы рекомбинация мен клондалған реттілік бөлігінің  жоғалу  мүмкіндігін
жиілетеді. Екіншіден,  ақуыз  аминқышқылдарының  70%-ы  пролин,  лизин  және
тирозиннің үлесіне тиетіндіктен, көп  мөлшерде  жасушаішілік  аминоацил-тРНК
пулын алу екіталай.
      Осы қиындықтарды өткеру үшін адгезивті ақуыздың толықөлшемді  кДНК-сын
немесе оның фрагментін ашытқылы экспрессирлеуші векторларға құрастырды  және
осы  векторларды   ашытқылы   жасушаларға   енгізді.   Экспрессиядан   кейін
мол.массасы  20-дан  100кДа  болатын  адгезивті   ақуыздың   жаңа   белсенді
формалары  алынды,  жасушалық  ақуыздардың  суммарлы  мөлшерінің  2-ден   5%
дейінгі үлесі олардың еншісінде  болды.  Адгезивті  ақуыз  генінің  химиялық
синтезінен  кейін  ғана  экспрессия  өзінің  айтарлықтай  жоғарғы  деңгейіне
жетті.
      Адгезивті ақуыздың декапептидті  кодтайтын  ДНК  қайтамаларын  қолдана
отырып,  мол.массасы  шамамен  25кДа  болатын  ақуызды  кодтайтын,  ұзындығы
600п.н. болатын синтетикалық генді шығарды. Оның 30п.н. ұзындықтағы  негізгі
қайталанатын  бірлігі  Е.  coli   экспрессиясында   оптимальды   кодондардан
тұратын, ал эффективті экспрессия ол Т7 фаг промоторының бақылауында  болған
кезде жүзеге  асқан.  Микроорганизмдердің  басым  көпшілігі  аминқышқылдарын
посттрансляционноегидроксилдеуді жүзеге асыру қасиеті  шектелген,  сондықтан
түзілетін ақуыз соңына дейін гидроксилденбеген болады. Осылай  оның  тирозин
қалдықтарының   кейбірі   DOPA-ға   айналмайды,   бұл   түзілетін   көлденең
тігістердің түзілу мөлшерін азайтады.  Бұл  мәселені  шешу  үшін,  құрамында
аскорбин қышқылы болғанда тирозин  қалдықтарын  гидроксилдейтін  бактериалды
тирозиназасы бар  invitroгидроксилдеу  жүйесі  құрылған.  Аскорбин  қышқылын
DOPA қалдықтарын охинонға дейін тотығуын алдын алу үшін қосады. Бұл  процесс
адгезивті        ақуыздардың         суббірліктерінің         құрастырылуына
әкелетіндіктен(сшивание) қатаң бақылауда болуы керек. Өзге  желімдер  немесе
адгезивтер  сияқты  адгезивті  ақуыздарды  қолданар  алдыда  міндетті  түрде
активтендіру қажет.
      Адгезивті ақуыздың негізін салушы тотыққан кезде және тігістер  түзілу
барысында ақуыз әртүрлі беттік аудандармен байланысуы мүмкін (мысалы,  шыны,
полистирол,  коллаген  және  т.б.).  Байланысу  мықтылығы  мен   ерекшелігін
қоспаға тотығуға  дейін  және  басқа  ақуыздардың  тігісі  түзілгенге  дейін
адгезивті  ақуыздарды  қосу  арқылы  өзгертуге  болады.  Бұл  әрекет  арқылы
медицинада,  стоматологияда  қолдануға  болатын,  бірегей   қасиеттерге   ие
желімдерді шығаруға мүмкіндік береді.
      Каучуктың микробиологиялық  синтезі.
      Табиғи  каучук,  цис-1,4-полиизопрен,  -  бұл  әртүрлі   өсімдіктерден
алынатын, кең қолданылатын биополимер. Оның биосинтезі қарапайым  қанттардың
 түзілуінен басталады, сондай-ақ  17  ферментативтік  реакциялардан  тұрады.
Соңғы   реакциялар    жүзеге    асу    барысында    изопентенилпирофосфаттың
аллилпирофосфат түзуімен жүретін полимеризация реакциясы жүреді.
      Каучуктың үлкен коммерциялық құндылығына орай зерттеулер  жүргізілген.
Бұл зерттеулер каучукты алу үшін рекомбинантты микроорганизмдерді  қолдануға
болатынын немесе болмайтындығын анықтауға  бағытталған.  Ең  алдымен  каучук
синтезделетін Heveabrasiliensis өсімдігінен  алынған  мРНК  көмегімен  кДНК-
кітапханасы шығарылды.  Сосын  қысқа  ДНК-зондпен  гибридизация  жүргізілді.
Клондалған  кДНК  шынымен  де  осы  ферментті  кодтайтынын  дәлелдеу   үшін,
тазаланған ферментке антиденелер қолданылған. Сонымен, осы кДНК клонын  және
мүмкіндігінше каучук биосинтезінің өзге гендерін қолданып,  микробиологиялық
әдістермен табиғи каучук синтездеуге тырысып  көруге  болады.  Бір  жағынан,
осы   кДНК   көмегімен   каучук   полимеразасын   алуға   және   invitro-ның
каталитикалық жүйесін құрастыруға мүмкіндік болар еді. Каучук  биосинтезінің
жаңа жолдарын  жобалауға  әкелетін  кез  келген  зерттеулерді  жалғастырудың
мағынасы зор, басқаша айтқанда жақсы нәтижеге жетуге болады.
      Полигидроксиалканоаттардың микробиологиялық синтезі.
      Полигидроксиалканоаттар    —    бұл    көптеген    микроорганизмдермен
синтезделетін (әсіресе, Alcaligeneseutphus) және жасушаішілік  көміртек  пен
энергия көзі ретінде қолданылатын,   биодеградацияланатын  полимерлер.  Олар
құрамына  байланысты  әртүрлі  қасиеттерге  ие  және  қаптама  материалдарын
жасауда  қолданылатын  биодеградацияланған  пластмасс  алу  үшін  қолданылуы
мүмкін. Бағалау бойынша  биодеградацияланған  пластмассалардың  жылдық  сату
көлемі шамамен 1,3 млрд. долларды құрайды.
      Барлық   полигидроксиалканоаттардың   ішінде    толық    қарастырылып,
сипатталғаны поли (3-гидроксимайлы қышқыл) болып  табылады.  Бұл  полимердің
өзіне де, оынң синтезін кодтайтын A. eutrophus  гендеріне де  қатысты  болып
келеді.  Полиді  (3-гидроксимайлы  қышқылды),  оның  сополимерін  поли   (3-
гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат) және басқа полиоксиалканоатты,  полиді
(3-гидроксивалерианды  қышқылды)  Ұлыбританияда  өнеркәсіптік  масштабта  A.
Eutrophus қатысындағы ферментация көмегімен алады.
      Алайда бұл микроорганизм  баяу  өседі  және  көміртек  көздерінің  тек
шектеулі мөлшерін қолданады.  Сондықтан  өндіру  аса  қымбат  болып  келеді.
Басқа жолды қолдануға болады мысалы: осы полимер биосинтезінің  гендерін  Е.
coli –ге тасымалдау барысында тез өсетін, поли-дің (3-гидроксимайлы  қышқыл)
үлкен  мөлшерін  (жасушаның  құрғақ  массасының  95%-на  дейін)   жинақтаушы
трансформаттар пайда болады. Поли (3-гидроксимайлы  қышқылы)  ацетил-СоА-дан
әртүрлі үш фермент көмегімен катализделетін үш сатылы әдіспен  синтезделеді.
Осы гендердің ішіндегі оперон ұзындығы 5,2 т.п.н.болатын фрагмент  құрамының
плазмидасында құрылған.  Алайда  селективті  қысымның  болмаған  жағдайында,
мысалы, антибиотиксіз өсу кезінде, Е. Coli жасушаларының жартысына жуығы  50
генерациядан  кейін-ақ   берілген   плазмидадан   айырылған   болатын.   Бұл
культивирлеу масштабы  аз  болған  жағдайда  аса  маңызды  емес,  бірақ  ірі
масштабты немесе үздіксіз ферментация  кезінде  күрделі  мәселеге  айналады.
Дәл осы  қиындықтан  айналып  өту  үшін  полиді  (3-гидроксимайлы  қышқылын)
тасымалдаушы плазмидаға  басқа  плазмидадан  раrВ  локусын  құрастырды.  Бұл
сегрегациядан кейін құрамында плазмидасы жоқ  жасушалардың  өліміне  себепші
плазмидтердің   стабилизациясын    қамтамасыз    етеді.    Модификацияланған
плазмидтер поли (3-гидрокси-майлы қышқылы) конститутивті синтезі кезінде  де
тұрақты  болып  қала  берген.   Берілген   өнімді   синтездейтін   Е.   Coli
трансформанттары тек өте аз мөлшердегі жасуша өліміне  душар  ететін  ацетат
түзетін. Көрінгендей, барлық  артық  мөлшердегі  ацетил-СоА   ацетатқа  емес
полиге   (3-гидроксимайлы  қышқылына)  айналды.  Е.  coli   –де   поли   (3-
гидроксимайлы   қышқылы)    синтезінің    тағы    бір    артықшылығы,    оны
хлорноватистоқышқылды  натрий  (калий)  деп  аталатын  сілтілік  ерітіндімен
экстрагирлегенде  (A.  eutrophus.-дан  эекстракциялағанмен    салыстырғанда)
аздаған мөлшерде бөлінеді.  Байқалғандай,  бұл  Е.  Coli-дегі  синтезделетін
полимерлердің басым көпшілігі кристалл күйінде болады, ал  сол  мерзімде  A.
Eutrophus-те  аморфты  күйде  болады.  Осыған  қарамастан  осы  екі  әдіспен
алынатын полимерлер ұқсас болып келеді.
       Поли (3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат)  өзінің  полипропиленге
кеңінен  қолданылатын  қасиеттеріне  байланысты   аналогты   болып   келеді.
Сондықтан  оны  микробиологиялық  әдістермен  алу  коммерциялық  қызығушылық
тудыруы мүмкін. Дегенмен, полимер  биосинтезінің  гендері  экспрессияланатын
Е.  Coli  штаммдары  сополимерлерді  емес  тек  қана  поли  (3-гидроксимайлы
қышқылын) синтездейді. Бұл мәселені Е. Coli жасушаларының экспрессиясы  үшін
 fadR және atoC құрылымдарындағы мутацияны тасымалдаушыларды қолдана  отырып
шешуге   болады.   FadR     майлы   қышқылдардың   биосинтезінің   негативті
регуляциясына жауапты, ал atoC – олардың жұтылуының позитивті  регуляциясына
жауапты.  FadR  локусының  сополимер  бисоинтезінің   индукциясындағы   ролі
белгісіз,  бірақ  atoC  генінің  өнімі  atoA,  atoA  және  қоректік  ортадан
бактерияның   пропионатты   сіңіруін   жеңілдетуші   гендермен    кодталатын
ақуыздардың  синтезіне  әсер  етеді.   Соңғысы   пропионил-СоА-ға   айналып,
сополимерге кіретін, өз кезегінде 3-гидроксивалерил-СоА-ге де  айналып  кете
алатын 3- кетовалерил-СоА-ді түзе отырып, ацетил-СоА мен реакцияға түседі.
      Бактерияларды  рестриктаза  типінің  ақуыздарын  синтездеуге  арналған
«фабрика» ретінде ғана  қолданып  қоймай,  сонымен  қоса  олардың  көмегімен
бактериалды жасушалардың метаболизмін оларға  басқа  текті  гендерді  немесе
белгілі модификацияларды енгізе отыра өзгертіп, жаңа өнім алуға  да  болады.
L-аскорбин  қышқылын,  индиго  бояғышын,  аминқышқылдарды,  антибиотиктерді,
әртүрлі полимерлердің мономерлі бірліктері  сияқты  әртүрлі  төменмолекулалы
қосылыстарды синтездеуге қабілетті рекомбинантты микроорганизмдерді  жасауға
болады.
      Осылардың негізінде жалпы стратегия – бір немесе бірнеше  ферменттерді
кодтайтын,жарамды векторда клондалған спецификалық  гендердің  иесін  енгізу
болып саналады.  Барлық берлігендерге қарағанда жаңа метаболиттік  жолдардың
жасалуы техникалық жағынан жүзеге асу  мүмкіндігі  бар.  Бұл  тәсіл  әртүрлі
қосылыстардың синтезінің эффективті жолдарын жасауға мүмкіндік береді.
       ДӘРІС № 5. НУКЛЕИН ҚЫШҚЫЛДАРЫН ТАЛДАУ ЖӘНЕ СИНТЕЗДЕУ ӘДІСТЕРІ.


      Нуклеин қышқылдары полимер болып табылады. Сондықтан  олардың  синтезі
мононуклеотиттердің полимеризация  реакцияларының  тізбегін  көрсетеді.  Бұл
реакциялар жүзінде полинуклеотидті тізбектің біртіндеп ұзаруы жүреді
      Синтез  үшін  субстрат  ретінде  энергия  көзі  де  болатын  трифосфат
формасындағы мононуклеотидтер  алынады.  Синтез  барысында  пирофосфат  (ФФ)
бөлініп, энергия бөлінуі жүреді. Жалпы процесс төмендегідей сипатта болады:
      3’,5’-фосфодиэфирлі   байланыс   түзіледі.   Пирофосфатаза   көмегімен
пирофосфат (ФФ) бөлінеді.
      Синтез үшін субстрат ретінде  трифосфатты  формадағы  мононуклеотидтер
қолданылады,  сонымен  қатар  оларды  энергия  көзір  ретінде   пайдаланады.
Синтез кезінде ФФ бөлінеді де энергияның босансуы жүреді:
      Нуклеин қышқылдарының синтезі үшін ферменттер мен субстраттардан басқа
міндетті түрде субстрат-мононуклеотидтердің қосылу ретін  анқтайтын  матрица
қажет.
      РНК синтезінің  ферменттері  –  РНК-полимеразалар,  ДНК  үшін  -  ДНК-
полимеразалар. Полимеразалар синтетаза классына жатады.  Олардың  биосинтезі
субстрат-нуклеин қышқылы көмегімен бақыланады.
      Әрекет ту механизмдерінің ортақ болуына қарамастан РНК-полимераза  мен
ДНК-полимераза арасында маңызды айырмашылықтар болады:
      ДНК  полимераза  синтез  бастай  алмайды,   ол   тек   полинуклеотидті
фрагментті  ұзартады.  Синтез  бастамасы  үшін   праймерлерді   синтездейтін
праймаза  деп  аталатын  ерекше   РНК-полимераза   қажет.   ДНК-полимеразалы
реакциялар барлық  матрица  бойы  жүреді:  ДНК-ң  комплементарлы  молекуласы
түзіледі.  РНК-полимеразалар  ДНК  жіптірінің  тек   белгілі    аймақтарында
(транскрипцияның басын көрсететін промотордан соңын көрсететін  терминаторға
дейінгі аймақта) әсер етеді.
      Түзілетін  ДНК  молекуласы  дайын  өнім  болып,  ал   РНК-полимеразасы
әрекетінің өнімі тек бастапқы транскрипт (жетілген РНК-ң жоғарғы  молекулалы
негізін   салушы)   болып   саналады.   Оның    синтезінен    кейін    РНК-ң
посттранскримционды модификациясының реакцияларының  тұтас  сериясы  жүреді.
Ол ферменттердің үш тобы арқылы жүзеге асады:
      Спецификалы  эндонуклеазалар.  Олардың   әсері   бастапқы   транскрипт
фрагментациясына    әкеледі.    3’,5’-фосфодиэфирлі    байланыс     түзетін,
фрагменттерді байланыстыратын фермент – лигаза.
      Спецификалық эндонуклеаз және лигаз  әрекетін  «сплайсинг»  терминімен
анықтайды.
      Осы әрекетке әрбір  молекулаға  и-РНК  «кэп»-фрагмент  –  3-метил  ГТФ
қосатын фермент іске кіріседі.  Сонымен  қатар   АТФ  к  3'-  жасуша  аяғына
қосылатын полиаденилатполимераза ферменті де бар.
      РНК  құрамындағы  азотты  негіздердің   өзгеруін   қамтамасыз   ететін
ферменттер (метилированиеаденин,  гуанин,  урацилдің  дигидроурацилға  дейін
қалыпқа  келуі,  азотты  негіздердің  дезаминирленуі).  Өнімдерді    осындай
әдістермен модифицирлеу минорлы азотты негіз ретінде  танымал.  Олар  РНК  –
ны нуклеаз әдісінен қорғау және РНК –  ның  жоғары  структураларын  формалау
үшін де қолданылады. Минорлы азотты  негіздер  комплементарлы  бу  түзбейді,
сол себепті де тізбек түзіледі.
      Адам ағзасында келесідей полимеразалар кездеседі:
      ДНК-ПОЛИМЕРАЗАЛАР:
      - альфа-ДНК-полимеразалары негізгі тізбек синтезіне жауапты;
      - бета-ДНК-полимеразалары  ДНК  –  ның  зақымданған  жерлерін  қалпына
келтіреді;
      - гамма-ДНК полимеразалары -  митохондриалды  ферменттер,  митохондрия
құрамында болады және митохондриалы ДНК репликациясын қалыптастырады.
      РНК-ПОЛИМЕРАЗАЛАР:
      I -  тасымалдаушы РНК (т-РНК)  синтезіне  қатысады.  Тасымалдаушы  РНК
синтезінің әрбір соңғы минутында тізбекті 3 мононуклеотидтер қосылады:  ЦМФ-
ЦМФ-АМФ (ЦЦА).   Бұл тізбек аминқышқылдардың т-РНК  - ға қосылуына қажет.
      II  -  (и-РНК,  м-РНК)  Ақпараттық  (матрицалық)  РНК  (и-РНК,  м-РНК)
синтезіне қатысады;
      III - РНК – ның басқа түрлерінің синтезіне қатысады.
      РНК-полимеразалар-II ингибиторы ретінде пептид L-амонитин қолданылады.
Amonyta улы саңырауқұлақтарында кездеседі (бледная поганка).
      ДНК синтезі репликация деп аталады. Полинуклеотидті ДНК  тізбектерінен
синтезделетін фосфодиэфирлі байланыс бағыты (5'--->3')  синтезінің  бағытына
сәйкес келеді. Сондықтан ол бірден тұтастай және үздіксіз  синтезделеді.  Ал
басқасында  (3'--->5')  –ке  сәйкес  келмейді.  Сондықтан   ол   бөлшектеліп
синтезделеді. Бұл бөліктер  "  Оказаки  фрагменттері  "  деп  аталады.  ДНК-
полимеразалар  Оказакиdenovo  фрагментін  (жаңадан   (с   нуля))   синтездей
алмайды.  Сондықтан  әрбір  фрагмент  синтезі  үшін  праймер  қажет  болады.
Праймер дегеніміз РНК тізбегінің кесіндісі  (кусочек).  Праймерлер  синтезін
арнайы  фермент  праймазалар  синтездейді.  РНК  синтезі  ДНК  молекуласының
белгілі бір аймағында  жүзеге  асады  және  транскрипция  деп  аталады.  ДНК
тізбектерінде   арнайы   аймақтар   болады.   Транскрипция   кезінде   РНК-ң
жоғарымолекулалы  негізін  салушы  болып  саналатын   бастапқы   (первичный)
транскрипт түзіледі.  Сосын  дәл  осы  ядро  жасушасында  сплайсинг  жүреді.
Сплайсинг дегеніміз  РНК-ң  постсинтетикалық  модификациясы.  Бұл  процессті
бастапқы транскрипттен  интрондарды  қиып  алатын  эндонуклеаза  ферменттері
катализдейді.  Қалған экзондар РНК-лигазамен  байланысады  (сшиваются).  Ары
қарай РНК-ң   5'-соңына  7-метил-ГТФ  (КЭП-фрагмент)  қосылады.  Бұл  роцесс
"кэпирование"  деп  аталады.  3'-соңына  полиаденилді  "қосымша"   ("хвост")
(полиАМФ) қосылып реакцияны катализдейді.
      Азотты    негіздерді    метилирлеу    рибосомалы     РНК-ң     (р-РНК)
посттранскрипционды модификациясының ерекшелігі юолып саналады.
      Модуль 2. БИОТЕХНОЛОГИЯДАҒЫ ГЕНЕТИКАЛЫҚ ИНЖЕНЕРИЯ ЖӘНЕ АҚПАРАТТЫҚ
                                  ӘДІСТЕРІ.


           ДӘРІС № 6. БИОТЕХНОЛОГИЯДАҒЫ ГЕНДІК ИНЖЕНЕРИЯ ӘДІСТЕРІ.


      Биологтар заманауи  генетикалық  әдістерді  пайдаланып,  бактерияларды
ақуызды  препараттар  (мысалы,  рестрицирлеуші  эндонуклеаза),  алуан  түрлі
химиялық  қосылыстардың,  аминқышқылдардың,   антибиотиктердің   және   т.б.
өндірісі бойынша өзіндік «биологиялық фабрикиаларға»  айналдыруды  үйренген.
Олар спецификалық гендерді бактериалды клеткалардың  ішінде  клондау  арқылы
бірегей  метаболиттерді  алу  биосинтезінің  жаңа  жолдарын   шығарады.   Үй
хайуанаттары  мен  адамдардың  ауруларын  диагностикалауға  арналған   зонда
ретінде  аурутудырушы  микроорганизмдердің   клондалған   генін   қолданады,
сонымен  бірге  қауіпсіз   әрі   эффектілі   вакциналарды   алуға   арналған
изолирленген гендерді қолданады.
      Гендік  инженерияның  әдістері  көмегімен   биологиялық   процестердің
спецификалық түрде жүруіне  бактериялардың  белгілі  бір  түрлерінің  табиғи
қабілеттілігін  күшейтуге  болады.   Мысалы,   қоршаған   ортаны   ластайтын
токсикалық  қалдықтарды  эффективті   түрде   бұзатын   бактерия   штаммдары
ауылшаруашылық культураларының қарқынды өсуіне себепші  болады,  целлюлозаны
төменмолекулалы көміртек қосылыстарына дейін ыдыратып,  зиянкес  жәндіктерді
жояды.
      Молекулярлы диагностика
      Заманауи медицинаның және ауыл  шаруашылығының  жетістіктері  көптеген
табиғи    және     экологиялық     факторларға     байланысты     (бактерия,
саңырауқұлақтарға,  паразиттік  микроорганизмдерге  және   т.б.).   Көптеген
диагностикалық  процедураларды  жүзеге  асыру   үшін   алдымен   потенциалды
патогенді  микроорганизмнің  культурасын  өсіріп  барып  оның  физиологиялық
қасиеттірін  спектр  арқылы  анализдеу   керек.   Бұл   тәсілдер   әлдеқайда
эффективті және спецификалы болғанымен ұзақ уақыт  алады,  шығынға  әкеледі.
Ол бактериялардың да, паразиттік  микроорганизмдердің  идентификациясына  да
қатысты  (1-кесте).  Кейбіреуі  культивирлеуге  келмейді  мысалы,  хламидиоз
тудырушы Chlamydiatrachomatis және жыныс жолдары арқылы  таралатын  аурулар.
Хламидиозды диагностикалау қиын. Сондықтан кейде дұрыс емдеу  жүргізілмейді.



      1-кесте.   Паразиттік   микроорганизмдерден   туындаған    инфекционды
аурулардың диагностикасының кейбір әдістерінің салыстырмасы.


      |Әдіс                     |Артықшылықтары           |Кемшіліктері             |
|Mикроскопты зерттеу      |Қарапайымдылық.          |Еңбексіңіргіштік, ұзқтық.|
|                         |Паразиттік               |Төмен дәрежедегі         |
|                         |микроорганизмдерді       |сезімталдылық. Ұқсас     |
|                         |тікелей анықтау.         |микроорганизмдердің      |
|                         |Микроорганизмдердің      |шектелу мүмкіндігінң     |
|                         |морфологиялық белгілері  |болмауы. Нәтижелерді     |
|                         |бойынша шектелу          |интерпретациясы үшін     |
|                         |мүмкіндігі.              |жоғары квалификацияны    |
|                         |                         |қажет етуі.              |
|Тышқандарлы              |Тек тіршілікке қабілетті,|Анализ ұзақтығы, қымбат  |
|иммунизациялау invitrou  |паразитті                |болуы. Әртүрлі           |
|культивирлеу.            |микроорганизмдерді       |жануарлардың түрлерінде  |
|                         |анықтау. Вируленттілік   |әртүрлі нәтиже алынады.  |
|                         |пен инфекциондықты       |Жануарлар организмінде   |
|                         |анықтау мүмкіндігі.      |тіршілік қабілетін       |
|                         |                         |жоғалтуы. Жануарларды    |
|                         |                         |қолдану.                 |
|Антителаларды сарысуда   |Қарапайымдылық, анализдің|Әрдайым спецификалы      |
|анықтау                  |ұзаққа созылмауы.        |болмайды. Инфекцияның    |
|                         |Автоматизациялау         |латентті және қатерлі    |
|                         |мүмкіндігі. Үлгілердің   |шектеу мүмкіндінің       |
|                         |көп санын тестілеу       |болмауы.                 |
|                         |мүмкіндігі.              |                         |
|Гибридизация және ПЦР.   |Жылдамдылық, жоғары      |Анализдердің             |
|                         |сезімталдылық.           |қымбаттылығы,            |
|                         |Спецификалылық. Паразитті|көпдеңгейлілік. Тірі және|
|                         |микроорганизмдерді       |өлі микроорганизмдерді   |
|                         |тікелей анықтау. Әртүрлі |ажырату мүмкіндігінің    |
|                         |түрлерді шектеу          |болмауы. Жалған оң және  |
|                         |мүмкіндігі. Алдыңғы      |теріс нәтижелердің болуы.|
|                         |инфекцияларға тәуелсіз   |                         |
|                         |нәтижелер. Паразиттердің |                         |
|                         |тіршілікке қабілеттілігін|                         |
|                         |қажет етпейді.           |                         |
|                         |Автоматизация мүмкіндігі.|                         |


      Кез келген патогенді микроорганизмдерді анықтау әдістері қарапайым әрі
жоғары спецификалы және сезімтал болуы керек.  Әдістің  қарапайымдылығы  осы
әдісті рутинді  қолдануда  жеткілікті  түрде  продуктивті,  эффективті  және
арзан болатындығын көрсетеді.




            ДӘРІС № 7. БИОТЕХНОЛОГИЯДАҒЫ ИММУНОЛОГИЯЛЫҚ ӘДІСТЕР.


      Детекцияның көптеген  иммунологиялық  жүйелері  қарапайым  бола  тұра,
жоғары сезімталдық  пен  спецификалылыққа  ие.  Олар  дәрілік  препараттарды
тестілеуде,  әртүрлі   онкологиялық   аурулардың   мониторингін   бағалауда,
спецификалық    метаболиттерді    анықтауда,    патогенді    микроағзалардың
идентификациясы мен бақылауында кең қолданылады, бірақ өзіндік  кемшіліктері
де  бар.  Егер  молекула-нысан  ақуыз  болса,  онда  оның   детерминирлейтін
гендерінің  экспрессиясын  қамтамасыз  ету  және  антиденемен   байланысатын
сайттың  жасырынуы  (маскирование)  немесе   бұғалуы   болмайтын   шарттарды
қалыптастыру  керек.  Инфекция  қоздырғыштарын  диагностикалаудың   дәстүрлі
процедуралары патогенді микроорганизмнің сипаттамалар  жиынына  немесе  оның
бірегей,   оңай   ажыратылатын    ерекшелігіне    негізделеді.    Клиникалық
микробиологтар  оның  көмегімен   патогенді   микроағзаларды   табуға   және
идентификациялауға  кепіл  болатын  биологиялық  сипаттамалардың   минималды
жиынын табуға  тырысуда.  Мысалы,  кейбір  қоздырғыштар  биологиялық  үлгіде
анықтау  қажет  арнайы  биохимиялық  қосылыстарды  түзеді.  Көбінесе  мұндай
маркерлі  молекуланы   жоғарыспецификалық   биохимиялық   анализ   көмегімен
анықтауға   болады.   Бірақ   бұл   әрекет   патогенді   микроорганизмдердің
детекциясының   жекеленген   (индивидуализированный)   жүйелерінің   санының
көбеюіне  әкелеп  соғады.  Анағұрлым  қолайлы  болып,  кез  келген  маркерлі
молекуланы оның химиялық табиғатына  тәуелсіз  анықтауға  мүмкіндік  беретін
әмбебап  әдіс   саналады.   Антиген-антидене   кешенінің   идентификациясына
негізделген әдіс дәл сондай әдіс болып табылады.
      Ферментті иммуносорбентті анализ
      Антидененің антиген-нысанмен байланысқанын анықтауға мүмкіндік беретін
түрлі жолдар бар. Олардың бірі – диагностикада  көп  қолданылатын  ферментті
иммуносорбентті анализ (ELISA). Процедура келесі этаптардан тұрады.
      1. Спецификалық  молекула  немесе  микроорганизмді  анықтайтын  үлгіні
қатты төсемеге (подложка), мысалы 26 қуысы  бар  пластикалық  микротитрлеуші
кесіндіге бекітеді.
      2. Бекітілген үлгіге маркерлі молекулаға сезімтал антиденені енгізеді,
содан кейін бірінші антидененің байланыспаған молекулаларынан  кетіру  үшін,
қуысты шаяды.
      3.  Бірінші  антиденемен  өзіндік  (специфический)  байланысатын  және
маркерлі  молекуламен  әрекеттеспейтін  екінші  антиденені   енгізеді.   Бұл
антиденеге бояламаған  субстраттың  боялған  өнімге  айналуын  катализдейтін
фермент жалғанған (мысалы, сілтілік фосфатаза, пероксидаза  немесе  уреаза).
Екінші антидене-фермент конъюгатының байланыспаған  молекулаларын  жою  үшін
қуысты жуады.
      4. Боялмаған субстрат енгізеді.
      5. Боялған өнімнің сапалық немесе сандық анықтауын жүргізеді.
      Егер бірінші антидене үлгі нысанымен байланыспаса, онда ол алғашқы рет
шайғанда  жойылады.  Бұл  жағдайда  екінші   антидене-фермент   конъюгатының
байланысатын заты жоқ болғандықтан, ол  екінші  рет  жуғанда  жойылады  және
үлгі боялмай қалады. Егер нысанмен байланысу  жүрсе,  онда  екінші  антидене
біріншімен  бірігеді,  конъюгирленген  фермент  жеңіл   тіркелетін   боялған
өнімнің қалыптасуын катализдейді.
      ELISA-ның негізгі қағидасы (принципі) – бірінші  антидененің  нысанмен
спецификалық  байланысуы.  Егер  молекула-нысан  ақуыз  болса,   онда   оның
тазаланған препаратын берілген нысанды анықтауға көмектесетін  антиденелерді
алу  үшін  пайдаланады.  Иммунизирленген  жануардың  (әдетте  қоян)  қанының
сарысуында пайда болатын антиденелер,  молекула-нысанның  әртүрлі  антигенді
детерминанттарымен  (эпитоп)  байланысады.  Антиденелердің  мұндай  қоспасын
поликлональді препарат деп атайды. Поликлональді антиденелерді  пайдаланудың
екі кемшілігі бар: 1) поликлональді препараттағы жекеленген антиденелер  бір
партиядан  екінші  партияға  түрленіп  кетуі  мүмкін;  2)  егер  екі   ұқсас
нысандарды ажырату керек болса,  яғни  патогенді  (нысан)  немесе  патогенді
емес (нысан емес) формалар бір ғана детерминанттымен айырмашылық  жасағанда,
поликлональді антиденелерді қолдануға болмайды. Дегенмен қазіргі  кезде  бір
антигенді детерминантқа арнап  шығарылған,  яғни  моноклональді  антиденелер
препаратын алуды үйренгеннен соң, бұл мәселелерді шешуге мүмкіндік туды.
      Моноклональді антиденелер
      Эволюция барысында  сүтқоректілерде  организмді  токсикалық  заттардан
және инфекционды агенттерден қорғайтын  жасушалар  жүйесінің  күрделі  жиыны
қалыптасты.  Қорғаушы  реакцияның  құрамдас  бөлігі  болып  бөтен  заттармен
(антиген) байланысатын және иммунды жүйенің  басқа  ақуыздарының  көмегімен,
комплемент  жүйесін  қоса  есептегенде,   олардың   әсерін   бейтараптайтын,
спецификалық ақуыздардың лимфатикалық жүйесінің  жасушалармен  индуцирленген
өндірілуі табылады. Иммунологиялық ынталануға (стимул) жауап  ретінде  әрбір
антидене продуцирлеуші жасуша антиген молекуласының  жеке  бөлігін  (эпитоп,
антигенді детерминант) жоғары  ұқсастықпен  (сродство)  танитын  антидененің
бір  ғана  түрін  синтездейді  және  бөледі.  Әдетте  антиген  молекуласында
бірнеше  әртүрлі  эпитоптар  болатындықтан,   олардың   әрқайсысына    қарсы
антиденелер иммунды жүйенің жеке жасушаларынан  бөлінеді.  Мұндай,  берілген
антигенмен әрекеттесетін әрбір антиденелер поликлональді деп аталады.
      Осы ғасырдың басында, антиденелердің поликлональділігі  туралы  ештеңе
белгісіз болғанның өзінде, олардың  ерекшелігін  (специфичность)  инфекцияны
басуда  қолдануға  болатыны  анық  еді.  Кейіннен  антиденелерді  клиникалық
үлгілердегі токсикалық қосылыстарды анықтайтын диагностикалық құрал  ретінде
пайдалана бастады. Өкінішке орай,  кейбір  жағдайда  иммунизациялаған  кезде
антидене продуцирлеуші жасушалар берілген антигеннің бір  детерминанттарымен
қаттырақ стимулденетіндіктен, басқа жағдайда  иммунды  жүйе  сол  антигеннің
басқа   эпитоптарына   белсендірек   жауап   беретіндіктен,    поликлональді
антиденелердің  препараттарының  әсері   бір   партиядан   екінші   партияға
түрленеді   (варьирует).   Жеке   эпитоптар    түрлі    әсер    ететіндіктен
(ынталандырушы  қабілет),   бұл   әр   түрлі   препараттардың   антигендерді
бейтараптау   қабілетіне   ықпал   етуі   мүмкін.    Демек,    поликлональді
антиденелердің  берілген  партиясында  негізгі  эпитопқа  қарсы  бағытталған
молекулалар  аз  болуы  мүмкін,  соның  нәтижесінде  оның  әсері   алдыңғыға
қарағанда анағұрлым төмен болады.
      Антиденелерді диагностикалық құрал немесе терапиялық заттар компоненті
ретінде тәжірибеде  қолдану  үшін,  культурада  өсетін  және  антиденелердің
антиген-нысанға  өте  ұқсайтын  бір  ғана  түрін  продуцирлейтін   жасушалар
линиясын – моноклональді антиденелерді шығару керек болды. Мұндай  жасушалық
линия антиденелердің идентикалық молекулаларының таусылмас  қоры  бола  алар
еді. Өкінішке орай, антиденелерді синтездейтін  B-лимфоциттер  (В-жасушалар)
культурада  көбейе  алмайды.  Мәселенің  шешімі  гибридті   жасушаны   жасап
шығаруда  болды.  В-жасушадан  генетикалық  бірлікті  алғаннан   кейін,   ол
антиденелерді шығарып, сәйкес жасуша түрінен  бөліну  қабілетіне  ие  болып,
культурада  өсе  алатын  еді.  В-лимфоциттер  кейде   қайта   пайда   болып,
культурада өсу  қабілеті  мен  В-жасушалардың  көптеген  қасиеттерін  сақтай
отырып  ісік  (миеломды)  клеткаларына  айналатыны  белгілі  болды.   Осылай
миеломды клеткалар, бірінші кезекте антиденелерді  бөлмейтіндер,  антиденені
продуцирлеуші   В-жасушалармен   бірігетін   үміткерлерге   айналды.   70-ші
жылдардың ортасында бұл идеялар іске асты.
      Бір типті антиденелерді продуцирлейтін гибридті клеткалар линиясын алу
процесіндегі алғашқы қадам болып тышқандарға антигендерді  енгізу  табылады.
Бірнеше апта бойы  жүргізілген  иммунизациядан  кейін,  жануарларда  иммунды
жауаптың дамуы  болғанын  тексереді.  Егер  жауап  болса,  онда  жануарларды
өлтіреді, көк бауырын  алып,  оны  жуады,  ұсақтайды  және  ішінде  антидене
продуцирлеуші В-жасушалары бар жекелеген жасушалардың босатылуы  үшін  әлсіз
сілкиді.    Көк    бауыр    жасушаларының    қоспасын    гипоксантин-гуанин-
фосфорибозилтрансферазаға  (HGPRT-)  ақаулы  миеломды  жасушалар  қоспасымен
араластырады.   Комбинирленген   қоспаны   бірнеше   минут   бойы    35%-дық
полиэтиленгликольде  инкубирлейді,  сосын  гипоксангин,   аминоптерин   және
тимидин (ГАТ ортасы) бар ортаға ауыстырады.
      Полиэтиленгликольмен өңдеу жасушалардың бірігуін жеңілдетеді, дегенмен
бірігу  сирек  болады  және  жеткілікті  деңгейде  кездейсоқ  жағдай   болып
табылады. Қосапада миелома, көк бауыр  жасушалары,  сонымен  бірге  біріккен
миелома – көкбауыр,  миелома – миелома, көкбауыр – көкбауыр жасушалары  бар.
Алайда ГАТ ортасында тек миелома  –  көкбауырдың  гибридті  жасушалары  ғана
өседі,  ал  басқа  типті  жасушалар  онда  пролиферирлене  (пролиферировать)
алмайды. Көкбауыр және біріккен көкбауыр –  көкбауыр  жасушалары  культурада
мүлдем өспейді, ал HGPRT-дің миеломды жасушалары  және  біріккен  миелома  –
миелома жасушалары гуанин және  адениннің  пуринді  негіздерінің  биосинтезі
процесінде гипоксантинді алғызат ретінде  пайдалана  алмайды.  Бірақ  оларда
пуриндер синтезінің басқа табиғи жолы  бар  –  ол  дигидрофолатрекдуктазаның
қатысымен жүреді,  сондықтан  орта  құрамына  осы  ферменттің  белсенділігін
ингибирлейтін аминоптерин қосылады.  Осыған  байланысты  HGPRT-дің  миеломды
жасушалары  және  біріккен  миелома  –  миелома  жасушалары  ГАТ   ортасында
пуриндерді синтездей алмайды және жойылады.
      Көкбауыр – миелома жасушалары ГАТ ортасында өседі, себебі: 1) көкбауыр
жасушалары   дигидрофолатредуктазаның    қатысында    пуриндер    синтезінің
аминоптеринмен  бұғалуына  қарамастан,   ортаның   экзогенді   гипоксантинін
утилиздей  алатын  функционалды  HGPRT  жеткізеді;  2)  миелома   жасушалары
белсенді бөліне  алады.  Тимидин   дигидрофолатредуктазаның  ингибирленуімен
шартталған пиримидин синтезінің бұғалуын болдырмауға  қажет.  ГАТ  ортасында
жасушалардың бірігуінен кейін,  10-14  тәуліктерде  тек  біріккен  көкбауыр-
миелома  жасушалары   қалады   және   дамиды.   Сосын   оларды   пластикалыө
микротитрлеуші кесінділердің қуыстарына (лунка) енгізеді және ГАТ-сыз  толық
культуралды ортада өсіреді.
      Енді  иммунизирлейтін  антигенге  арналған   антиденелерді   өндіретін
гибридті жасушаларды идентифицирлеу керек.  Бұл  үшін  әдетте  секреттелетін
антиденелері  бар  культуралды  орталардың  скринингін   жүргізеді.   Дамушы
жасушалары бар қуыстардан жасалған  орталарды  бөліп  алады  және  қуыстарды
басқа,   алдын   ала   антиген-нысан   молекуласының   қабатымен   қапталған
микротитрлеуші  кесіндіге  ауыстырады.  Егер  культуралды  ортада   берілген
антигеннің бір эпитопын танитын антидене (бірінші антидене) болса,  онда  ол
антигенмен байланысады және қуыстарды жуған соң сонда  қалады.  Содан  кейін
қуыстарға тышқан антиденелеріне  сезімтал  (специфичный)  екінші  антиденені
енгізеді. Ол антигенмен байланысқан кез келген бірінші антиденеге қосылады.
      Иммунды анализде қолданылатын екінші антиденеге боялмайтын  субстратты
боялған  қосылысқа  айналдыратын  ферментті  алдын  ала  қосады.  Қуыстардың
бірінде  түстің  өзгеруі  бастапқы  культуралды  ортада  берілген  антигенге
сезімтал  антидененің  болғанын  білдіреді.  Егер  мұндай  антидене   ортада
болмаған болса, онда екінші антиденеге байланысатын  зат  болмайды  және  ол
екінші рет жуғанда шайылып кетеді.  Мұндай  қуыстардағы  субстрат  боялмаған
күйде қалады.
      Оң  иммунды  жауап  беретін  (түстің  өзгеруі)  ортасы  бар,  бастапқы
микротитрлеу  кесіндісіндегі  қуыстарда  құйылған  жасушалар  қоспасы  болуы
мүмкін.  Бір  жасушадан  дамыған  линиялар  алу  үшін   (клондар),   осындай
қуыстардан жасалған жасушалық суспензияны культуралды  ортамен  араластырады
да, басқа қуыстарға  отырғызады.  Алынған  клондарды  культивирлегеннен  соң
орталарды   қайта   тексереді,   антиген-нысанды    танитын    моноклональды
антиденелерді қай жасушалық линия  (гибридома)  продуцирлейтінін  анықтайды.
Бірден көп өзіндік (специфичный)  гибридомалар  алған  жағдайда,  ары  қарай
түрлі клондардан өндірілетін антиденелер бір антигенді  детерминантқа  қарсы
бағытталды   ма,   жоқ   па   екенін   анықтайды.   Моноклональды   антидене
продуцирлейтін әрбір клонды культурада  шексіз  ұстауға  болады.  Сондай-ақ,
үлгілерді сұйық азотта қатырып, ары  қарай  оларды  жасушалар  көзі  ретінде
пайдалануға болады.
      Бір   ғана,   қатаң   түрде   анықталған   антигенді   сайтпен    ғана
байланысатындықтан,  моноклональды  антиденелерді  қолдану  ELISA   әдісінің
ерекшелігін  арттырады.  Қазіргі  кезде  әртүрлі  қосылыстар  мен  патогенді
микроорганизмдерді  анықтауда  қолдануға  болатын   бірқатар   моноклональды
антиденелер алынған. E. coli  көмегімен  антиген-нысанға  қарсы  бағытталған
моноклональды  антиденелер   мен   олардың   бөліктерінің   (Fv-фрагменттер)
таңдалып  алынуы   және   өндірілуі   гибридомды   жасушалар   культурасынан
моноклональды антиденелерді алудың альтернативі болуы мүмкін.




              ДӘРІС № 8. БИОТЕХНОЛОГИЯДАҒЫ АҚПАРАТТЫҚ ӘДІСТЕР.


      Адамның  өзіндік   тұқымқуалайтын   ауруларын   генетикалық   деңгейде
диагностикалау зерттелетін  индивидумдар  немесе  олардың  ұрпақтары  жоғары
генетикалық қауіпті топқа жататыны немесе жатпайтыны  туралы  сұраққа  жауап
береді. ДНҚ-анализді тұқымқуалайтын аурулардың генін тасушыларды  анықтауда,
сонымен қатар қауіпті генетикалық ауытқулардың прентальды және  пресимптомды
диагностикасын жүргізуде пайдалануға болады.
      ДНҚ  деңгейінде  тестілеу  арқылы  спецификалық  мутацияларды  қатесіз
анықтауға  болады.  Бұрын  бұл  үшін  зерттелетін   ген   өнімін   анықтауға
негізделген биохимиялық әдістер  қолданылған.  ДНҚ-тесттер  мутантты  геннің
экспрессиясын  жүргізуді  қажет  етпейді,  бұл  барлық  моногенді  ауруларға
арналған скрининг жүйесін ойлап табуға мүмкіндік жасайды.
      Орақ тәрізді клеткалы анемия
      Орақ тәрізді клеткалы анемия – кодондағы гемоглобин  молекуласының  (-
тізбегіндегі алтыншы амин қышқылына сәйкес  келетін  нуклеотидтің  біреуінің
алмасуымен сипатталатын генетикалық ауру. Мутантты гені  (S/S)  гомозиготалы
науқастарда эритроциттері ерекше орақ тәріздес пішінге  ие;  бұл  гемоглобин
молекуласында    валиннің    глутамин    қышқылына    алмасуы     салдарынан
конформациясының бұрмалануына  байланысты.  Мутантты  гемоглобин  жеткілікті
мөлшерде оттегін тасымалдай алмайды, осындай науқастарда  жүрек,  өкпе,  ми,
буындар үдемелі түрде зақымдалатын  қауіпті  анемия  дамиды.  Берілген  гені
бойынша гетерозиготалы  (A/S)  (генетикалық  ауруды  тасушылар)  науқастарда
эритроциттер қалыпты (нормальная) пішінге  ие  және  аурудың  белгілері  тек
экстремалды  жағдайларда  ғана   байқалады   (аса   биік   жерлерде   немесе
организмнің оттегімен қамтылуы төмендеген кездегі тым  жоғары  немесе  төмен
температураларда). Егер ата-ананың екеуі де гетерозиготалы  болса  (генотипі
A/S), онда олардың балалары мутантты ген  бойынша  гомозиготалы  (S/S)  болу
ықтималдығы 25%. Орақ тәрізді клеткалық  анемияның  гені  жоғарғы  жиілікпен
афроамерикандықтар    мен    олардың     ұрпақтарында,     сонымен     бірге
латиноамерикандықтарда кездеседі. АҚШ-та орақ тәрізді  анемия  генін  өзінің
ұрпақтарына   бере   алатын   тасушыларды   анықтау   мақсатында    скрининг
жүргізіледі. Осы үшін пайдаланылатын тесттердің біреуін қарастырып көрейік.
      Орақ тәрізді анемияға әкелетін  (-глобинді  гендегі  бір  нуклеотидтің
алмасуы рестицирлеуші CvnI. эндонуклеазаға арналған сайттың  элиминациясымен
сүйемелденеді (сопровождается). Бұл фермент CCTNAGG ретін  таниды  және  ДНҚ
молекуласын С және Т негіздері (N – төрт нуклеотидтің кез келгені)  арасында
ыдыратады. Қалыпты генде бұл рет мынандай түрге  CCTGAGG,  ал  орақ  тәрізді
анемия генінде – ССТGTGG түріне ие. Берілген аурудың  ДНҚ-диагностикасы  осы
айырмашылыққа негізделеді.
      CvnI сайтын фланкирлеуші праймерлерді қолдана  отырып,  ПЦР  көмегімен
тестіленетін ДНҚ-ның  азғантай  мөлшерін  амплифицирлейді.  Амплифицирленген
фрагментті CvnI өңдейді, рестрикция  өнімдерін  гель-электрофорезбен  бөледі
және   оларды   бромды   этидимен   бояйды.   Cvn1-сайты   болған   жағдайда
электрофореграммада   спецификалық   жолақтардың   жинағы   пайда    болады.
Сипатталған  әдіс  арқылы  гибридизация  жүргізбей-ақ,  зерттелетін   заттың
генетикалық статусын қиындықсыз және жылдам анықтауға болады.
      ПЦР/ЛОЗ әдісі
      Ақаулы  гендердің  пайда  болуына  әкелетін  генетикалық  бұзылулардың
рестрикция   сайтының   жоғалуы   немесе   өзгеруімен   барлығы   (не   все)
сүйемелденбейді,  сондықтан  бір  нуклеотидті  ауыстырудың  (замена)  орнына
басқаларды  да  қолданады.  Олардың  біреуінде  ПЦР  және   олигонуклеотидті
зондтардың (ЛОЗ), ПЦР/ЛОЗ дотирлеуіне негізделген әдіс біріккен.
      Қалыпты геннің белгілі сайтында (мысалы, 106-шы орында) А-Т  жұбы,  ал
мутантты геннің дәл сондай сайтында G-S жұбы бар делік.  106-шы  нуклеотидті
фланкирлейтін нуклеотидті реттілікті біле отырып, берілген  сайтқа  жабысқан
және қарама-қарсы  тізбектерге  комплементарлы  екі  қысқа  (20-нуклеотидті)
фрагментті синтездеуге болады. Олигонуклеотидтердің бұл  жұптарының  негізгі
ерекшелігі  –  біріншісінің  З'-ұштық  нуклеотиді  (Х  зонд)  106-шы  орында
қалыпты ретпен орналасқан негізге комплементарлы,  ал  екіншісінің  5'-ұштық
нуклеотиді (Y зонд) 106-шы нуклеотидке жабысқан нуклеотидке  комплементарлы.
ДНҚ-нысанмен қалыпты  реттілікке  ие  осы  зондтарды  жағу  (отжиг)  кезінде
олардың толық гибридизациясы  жүреді,  ДНҚ-лигазасының  реакционды  қоспасын
қосқан кезде, X және  Y  зондтары  ковалентті  тігіледі.  Егер  бұл  зондтар
мутантты ДНҚ-мен жағылған болса, онда оған комплементарлы  емес  X  зондының
3'-ұштық нуклеотиді онымен жұп түзе алмайды. Y  зонды  бұрынғыдай  толығымен
гибридизацияланғанымен, ДНҚ-лигаза X және Y зондтарын тіге алмайды.
      Мутантты 106-шы нуклеотидтің реттілігіне толық сәйкес келетін басқа да
олигонуклеотидті зондтарды синтездеуге болады.  Зондтардың  мұндай  жиынында
лигирлеу  (лигирование)  олардың  мутантты  ДНҚ-нысанымен  жағылуы   кезінде
болады және қалыпты нысанмен жағылуы кезінде болмайды. Осыған орай,  ПЦР/ЛОЗ
әдісі екі жағдайды ажыратады: зондтарды лигирлеу және лигирлеудің болмауы.
      Лигирлеу жүргенін тексеру үшін X  зондының  5'-ұшын  биотинмен,  ал  Y
зондының З'-ұшын сәйкес антиденемен байланысатын төменмолекулалы  қосылыс  –
дигоксигенинмен   белгілейді.    Гибридизация    мен    лигирлеуден    кейін
гибридизацияланған зондты босату  үшін  ДНҚ  денатурациясын  жүргізеді  және
қоспаны стрептавидинмен қапталған  кішірек  пластикалық  қуысқа  ауыстырады.
Стрептаввидинмен   байланысқан   биотинилирленген   зондтан   басқа   барлық
материалды жою үшін қуысты  жуады.  Сосын  алдын  ала  сілтілі  фосфатазамен
байланысқан дигоксигенинге антиденені  енгізеді.  Байланыспаған  конъюгаттың
жойылуы  болатын  шаюдан  кейін   түссіз   хромогенді   субстратты   қосады.
Ерітіндідегі  бояу  дигоксигенинмен   белгіленген   (меченный)   зонды   бар
дигоксигенин антиденемен  байланысқанын,  яғни  зонд  биотинмен  белгіленген
зондпен  лигирленгенін  білдіреді.  Егер   бояу   болмаса,   онда   лигирлеу
болмағаны.
      Екі жұп болғанда кез келген  адамның  генетикалық  деңгейін  анықтауға
болады. Мысалы, гетерозиготалы тасушылардың ДНҚ-сы  зондтардың  екі  жұбымен
де,  қалыпты  геннің  екі  көшірмесі  бар  ДНҚ  иелері  тек  қалыпты  сайтқа
комплементарлы нуклеотиді  бар  зондтар  жиынымен,  екі  геннің  өзгертілген
көшірмелері  бар  индивидтер  ДНҚ-сы   тек  мутантты  сайтты  детектирлейтін
зондтар жұбымен  ғана  оң  нәтиже  береді.  Анализге  қажетті  бастапқы  ДНҚ
мөлшерін минимизациялау үшін, гибридизация алдында  тестіленетін  сайтқа  ие
ДНҚ-нысан бөлігін ПЦР көмегімен амплифицирлейді.
      ПЦР/ЛОЗ жылдам, сезімтал және жоғарыспецификалық әдіс болып  табылады.
Оның  барлық  деңгейлері  күніне  1200-ге  дейін  тест  жүргізуге  мүмкіндік
беретіндей етіп роботизацияланған.
      ПЦР/ЛОЗ-дың біршама қарапайым әдісі  болып  лигазды  тізбекті  реакция
табылады. Тестіленетін ДНҚ-ны термотұрықты ДНҚ-лигаза қатысында  қалған  екі
индикаторлы зондпен араластырады. Лигирлеуді 65°С-та жүргізеді, сосын  пайда
болған   зонд   гибридтері   –   ДНҚ-нысанның   денатурациясы   жүруі   үшін
температураны 94°С-қа  дейін  көтереді,  ДНҚ-нысаны  бар  бос  лигирленбеген
индикаторлы ЛОЗ-зондтарын  гибридизациялау  мақсатында  температураны  қайта
65°С-қа төмендетеді. Бұл циклды 20 рет  қайталайды.  Егер  индикаторлы  ЛОЗ-
зондтар ДНҚ-нысанға толық комплементарлы  болса,  онда  лигирлеу  әр  циклда
болады  және  20  циклдан  кейін   электрофорез   немесе   ELISA   көмегімен
анықталатындай жеткілікті лигирлеу өнімдері («тігілген» X және  Y  зондтары)
жинақталады. Егер комплементарлық  толық  болмаса,  лигирлеу  болмайды  және
ешқандай өнімдер тіркелмейді.
      Флуоресцентті белгіленген ПЦР-праймерлерді қолдану арқылы генотипирлеу
      Колориметриялық  генотипирлеу   әртүрлі   флуоресцентті   бояғыштармен
белгіленген  ПЦР-праймерлерді  пайдалануға  негізделген.  Мутантты  ДНҚ  мен
жабайы  типті  ДНҚ-ны  ажырату  үшін,  ПЦР-ді  екі  әр  түрлі  праймерлермен
жүргізеді. Олардың бірі (P1) жабайы типті ДНҚ-мен  комплементарлы  және  5'-
ұшында родаминмен (қызыл түс), екіншісі (P3) мутантты ДНҚ-ға  комплементарлы
және 5'-ұшында флуоресцеинмен  (жасыл  түс)  белгіленген.  Екі  жағдайда  да
амплификацияны қарама-қарсы тізбекке  комплементарлы,  үшінші  белгіленбеген
праймер  (P2)  қатысында  жүргізеді.  ПЦР  тек  праймер  ДНҚ-нысанға   толық
комплементарлы болған  кезде  ғана  жүре  алатындықтан,  реакционды  қоспада
барлық үш праймер болғанда не жабайы типті ДНҚ, не мутантты ДНҚ, не  болмаса
матрица рөліндегі ДНҚ-нысанға байланысты олардың екеуі де  амплифицирленеді.
Егер  жабайы  типті  ДНҚ  бойынша  индивид  гомозиготалы  болса,  онда   ПЦР
жүргізген  соң  және  артық  праймерлерді  жойғаннан   кейін   қызыл   түсті
флуоресценция байқалады, ал егер мутантты ДНҚ бойынша гомозиготалы  болса  –
жасыл,  егер  мутантты  ДНҚ  да,  жабайы  типті   ДНҚ   да   (яғни   индивид
гетерозиготалы) болса – сары. Бұл әдісті белгілі нуклеотидті  реттілікке  ие
кез   келген   гендегі   кез   келген   бірнуклеотидті   сайт-нысанға    сай
автоматизациялауға және бейімдеуге болады.
      Бір геннің әр түрлі сайттарындағы мутациялар
      Барлық (не все) генетикалық  аурулар  гендегі  бір  ғана  спецификалық
өзгеріске негізделмейді. Көпшілік жағдайларда мутациялар  бір  геннің  түрлі
сайттарында  жүреді,  бірақ  олар  бір  генетикалық  ауруға  әкеледі.  Мысал
ретінде (-глобиннің  белсенділігін  жоғалтумен  байланысты  тұқым  қуалайтын
ауру –  (-талассемияны  келтіруге  болады.  Гетерозиготалы  тасушыларда  бұл
жағдайда аздаған анемия байқалады. Мүмкін болатын  мутантты  сайттардың  кем
дегенде сегізден бірі  гомозиготалы  болатын  индивидтер  тіршілігін  сақтау
үшін үнемі қан  құю  мен  басқа  емдерге  мұқтаж.  (-глобинді  геннің  сегіз
спецификалық сайтындағы кез келген  мутация  (-талассемияға  әкелетіндіктен,
кем дегенде сегіз әртүрлі  тест  жүргізу  қажет.  Қымбат  болса  да,  мұндай
диагностика жасауға болады.
      Бір геннің әртүрлі сайтында пайда болатын мутациялар  скринингі  үшін,
бір  реакция  жүргізуге  негізделген  ПЦР/гибридизация   стратегиясы   ойлап
табылды. Ол үшін белгілі мутацияны тасушы  ген-нысан  фрагментіне  әрқайсысы
толық   комплементарлы   20-нуклеотидті   зондтардың   спецификалық   жиынын
синтездейді. Әр зондтың 3'-ұшына ұзындығы шамамен 400 нуклеотидке  тең  poly
(dT) гомополимері  жалғанған,  оның  көмегімен  ДНҚ-зонд  найлонды  фильтрде
алдын ала белгіленген  нүктемен  байланысады,  ал  оның  қалған  бөлігі  бос
қалады және гибридизацияланады. Мүмкін болатын мутантты сайттардың  біреуіне
ие тестіленетін ДНҚ сегменттері ПЦР көмегімен бір уақытта  амплифицирленеді,
әр  жұптың  бір  праймері  5'-ұшында  биотиппен  белгіленген.   ДНҚ-нысанның
амплифицирленген  фрагменттері  тек  толық   комплементарлы   реттіліктердің
гибридизациясын  қамтамасыз  ететін  жағдайларда  ғана   фильтрге   тігілген
зондтармен гибридизацияланады. Гибридизациялық қоспаға сілтілі  фосфатазамен
(сонымен  қатар  хрен  пероксидазасы  мен   уреазаны   пайдалануға   болады)
байланысқан стрептавидин қосады. Гибридизациядан кейін фильтрді  жуады  және
боялмаған субстратты енгізеді. ДНҚ-нысанның  амплифицирленген  сегменті  мен
спецификалық олигонуклеотидті зонд  арасында  толық  сәйкестік  болса,  онда
фильтрде түрлі түсті нүкте қалыптасады. Бір  фильтрге  әртүрлі  спецификалық
олигонуклеотидті зондтардың толық қатарына сай келетін бірнеше нүкте  салуға
болады. Осы түрлі түсті мозаиканы анализдеу арқылы көптеген  мүмкін  болатын
мутация сайттарының біреуін идентификациялауға мүмкіндік бар.
      Молекулярлы диагностика – тез дамып келе жатқан  бағыт.  Оның  негізгі
принциптері   қалыптасқанымен,   жеке   тесттердің   техникалық    бөлімдері
(технические  детали)  айырмашылық  жасайды.  Қазіргі   кезде   ДНҚ-нысанның
жеткілікті  мөлшерін  алу  үшін   ПЦР-ді   тиімді   пайдаланады.   ПЦР   мен
спецификалық зондтарды қолдану тесттердің  сезімталдыған  жоғарылатады  және
радиоактивті емес хромогенді, хемилюминесцентті  және  флуоресцентті  тіркеу
жүйелерін  пайдалануға  мүмкіндік   жасайды.   Көбінесе   мутацияны   немесе
инфекционды агенттің экзогенді  ДНҚ-сын  анықтау  үшін  өнімдерді  келесілік
электрофоретикалық  бөлумен  ПЦР   жүргізу   жеткілікті.   ДНҚ-диагностикасы
көмегімен  көптеген,  тіпті  кең  тараған   генетикалық   және   инфекционды
ауруларды,  сонымен  қатар  жаңа  туындағандардың  барлығын  дерлік  анықтау
мүмкіндігі күмән тудырмайды.

• Іс жүргізу
• Автоматтандыру, Техника
• Алғашқы әскери дайындық
• Астрономия
• Ауыл шаруашылығы
• Банк ісі
• Бизнесті бағалау
• Биология
• Бухгалтерлік іс
• Валеология
• Ветеринария
• География
• Геология, Геофизика, Геодезия
• Дін
• Ет, сүт, шарап өнімдері
• Жалпы тарих
• Жер кадастрі, Жылжымайтын мүлік
• Журналистика
• Информатика
• Кеден ісі
• Маркетинг
• Математика, Геометрия
• Медицина
• Мемлекеттік басқару
• Менеджмент
• Мұнай, Газ
• Мұрағат ісі
• Мәдениеттану
• ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности)
• Педагогика
• Полиграфия
• Психология
• Салық
• Саясаттану
• Сақтандыру
• Сертификаттау, стандарттау
• Социология, Демография
• Спорт
• Статистика
• Тілтану, Филология
• Тарихи тұлғалар
• Тау-кен ісі
• Транспорт
• Туризм
• Физика
• Философия
• Халықаралық қатынастар
• Химия
• Экология, Қоршаған ортаны қорғау
• Экономика
• Экономикалық география
• Электротехника
• Қазақстан тарихы
• Қаржы
• Құрылыс
• Құқық, Криминалистика
• Әдебиет
• Өнер, музыка
• Өнеркәсіп, Өндіріс