УМКД

Клеткаларды культивирлеу

ОҚУ-ӘДІСТЕМЕЛІК КЕШЕНІ

5В070100 «Биотехнология»

мамандығының студенттеріне арналған

«Клеткалық биотехнология » пәнінен

ОҚУ-ӘДІСТЕМЕЛІК МАТЕРИАЛДАРЫ

Семей - 2013

Мазмұны

|1 |Дәрістер | |
|2 |Зертханалық жұмыстар | |
|3 |Өзіндіқ жұмыстар | |

1. Глоссарий – антигендер иммунды жүйеде антидененің пайда болуына
әкелетін заттарға спецификалық әсер туғаызатын ақуыз. Антидене –
иммунды жүйеде түзілетін ағзаға түскен бөгде патогендерді
агенттерді бекітетін ақуыз. Гаплоид, ядро, жасуша, ағза, бұл
хромосома жиынтығынан тұратын, толық жиынтықтың жартысын көрсетеді.
Ген – бір немесе бінеше полипептидті тіркесті белгілейтін немесе
РНК молекуласының немесе белгілі регуляторлы қызмет атқаратын
хромосоманың бір бөлшегі (ДНК молекуласы). Жасуша культурасы
асептикалық жағдайда арнайы жасанды қоректік ортада жануарлар
немесе өсімдіктердің белгілі бір тіндеріне жасушаларды өсіру.
Каллус – жасушаның ұйымдастырылғын пролиферациялық жолмен алынған
тін. Пролиферация – ол бір жасушадан көбею арқылы жаңа түзілістің
пайда болуы. Өсімдік- регенерант- культурада пайда болған, тамыры
мен дамыған асептикалық жолмен алыңған өсімдік яғни in vitro.
Тотипотенттік өзіне тән гентикалық ақпаратты көрсете алатын жасуша
құрамы дифференцировканы және ағзаның ары қарай дамуын
жалғастырады.
Суспензиялы культура – бұл белгілі бір жасушаларды немесе олардың
белгілі бір топтарын сұйық ортада аэрациясы мен араласуын қамтитын
аппараттар арқылы өсіру.
Протопласт – бұл қабықшасынан айырылған «жалаңаш» жасуша.
Фитогормондар - өсімдіктерде физиологиялық процестердің регуляциясына
қатысатын қосылыс. Дифференциация – бұл анализ жасушаларымен дочерни
жасушаларының немесе олардың өзара айырмашылығын көрсететін процестер
кешені.
Инокулюм жаңа ортаға қайта отырғызу үшін қолданылатын суспензиялы
культураның бір бөлігі. Компитенция индуцирленген әсерлерді қабылдайтын
және өзгенген дамуына спецификалық жағдайда әсер көрсете алатын
ктеткалардың қабілеті. Детерминация- жасушаға баайланысты арнайы тұқымдық
құрылысты реализацияға дайындайтын жағдай.

Дәріс №1
Жоспар
1. Клетка биотехнологиясының дамуы
2. Биотехнологияның үш бағыты, жекеленген клеткалар мен ұлпалардың
маңызы
1. Өсімдіктер әлемі тіршіліктің көзі болып есептеледі. 1,9млрд тонна
құрғақ затты аздап өсімдіктен алатыны белгілі. Өсімдікті көптеген салаларда
қолданады: ауылшаруашылығында, құрылыста, қағаз және энергетика
өндірісінде, шаруа қожалықтарында, химикаттарды, дәрілік заттарды,
биологиялық белсенді заттарды, заттардың химиялық байланыстарын алу үшін
арнайы қызығушылық танытады.
ХХ ғасырда химизация, механизация, мелярацияның қолдануда
ауылшаруашылық өнімдері жоғарылады, бірақ ол қоршаған ортаның ластануына,
ресурстардің төмендеуіне себепші болды. Сонымен қатар қосымша прогресстің
арқасында ауылшаруашылық өнімдерінің көрсеткіші өз шегінен асып кетті.
Сондықтан жаңа ізденістер мен жаңа әдістер керек болды.
Жаңа әдістердің ішінде ең перспективтісі- жасуша инженериясы болып
саналды. Жасушаның арнайы жаңа әдістерін қолдану арқылы құрылған оларды
эукриоттық ағзалардың жекелеген жасуша әдісі.
2.Жекеленген жасушалар мен ұлпалар биотехнологиясын 3 бағытта
қарастырады:
1. Жекелеген өсімдік жасушаларынан бағалы медициналық өнімдер,
парфюмериялар. косметикалар, бояулар және т.б. екіншілік
өнімдер: алколоидтар, стероидтар, гликоидтар, гормондар, эфирлі
майлар өндіреді.
2. Екіншілік өнімдерді қатты немесе сұйық каусты ұлпалардан алады.
Жасуша технологиясы арқасында диосгенинсияқты медициналық
препараттар алады, оны парфюмерияда қолданады. Осы тәсілдің
тиімділігі оның екіншілік синтезделген заттарының алынуына
біздің табиғата бағынбайтын өсімдіктерден алуға болады. Екінші
бағыты – отырғызатын материалдардың көбеюінде жекелкенген
тіндердің культурасын пайдалану болып саналады. Бұл әдіс
өсімдіктің микрокөбею клоналімен аталған. Бұнда бір
мерисистемадан бір жылда мыңдаған өсімдік алуға болады.
3. Селекциялық өсімдіктерде жекеленген жасушаларды пайдалану арқылы
жасалады. Бұнда тез өсетін өсімдіктерді табиғаттың қолайсыз
жағдайына: ыстық, суыққ, сусыздыққа төзе алатын өсімдіктерді алу
жатады.
ХІ ғасыр - өсімдік трониген ғасыры болып саналады. Бұл өсімдіктер
гербицидтерге, жәндіктерге, вирустарға төзімді. Бөтен геннің протопластарын
жеке генді инженерия әдісімен трансгенді өсімдікті алуда жақсы нәтиже
береді.

Дәріс №2
Тақырып: Клеткалық биотехнологияның теориялық негіздері
Жоспар
1. Тарихи ақпарат
2. Өсімдік жасушаларының тотипатенттігі
1. «Тін», «ағза», «жасуша культурасы» - термині толығымен өсімдікер
бөлігінің асептикалық өндірілуінде қолданылады:
• агарирленген ортадағы каллусты тіндерге
• жасушаның суспензиялы культурасына және сұйық ортадағы аздаған
агрегаттарға
• протопластар культурасында
• жекеленген ұрықтарда
• жекеленген ағзаларда (тамыр ұштары, өркендеуші меритемаларда)
1.1. Тарихи ақпарат өсімдіктер тіндерінің жекеленген жасушаларын
культивирлеу бұрын жасалған және бұл әдістің дамуының тарихи бірнеше
кезеңдері бар.
1 кезең (1892-1902) Х. Дерканд, Фехтинг, Ресимгер деген неміс
ғалымдарының атымен тығыз байланысты. Олар сахароза ерітіндісінде көптеген
өсімдіктер тіндерін культивирлеуге тырысқан.
Бақбақ пен теректің сабақтарының бөлшектерін зерттеуіне біріншілік
каус қолданылған. Оң нәтиже алмаған ғалымдар бірнеше ойлар мен
пікірлерайтқан, бірақ олар кейіннен расталды. Соған байланысты Хаберланд
арнайы культивирленген жағдайда өсімдіктер өзінің даму потенциалын
құрастыра алады деген болжам айтқан.
2 кезең (1902-1922) жануарлар тіндерін культивирлеу арнайы қоректік
орталарда жасалу негізделген. Бұл орталар табиғаты жағынан қан сарысуынан
және ұрықтық ерітіндіден құралған. Жасанды құрамында өсімдік экстрактылары
бар қоректік ортада жекеленген өсімдік тіндерін өсіру дұрыс нәтиже әкелген
жоқ, өйткені ол жасушаның және өсімдік тіндерінің өсу жылдамдығына қатысын
аз тигізді.
3 кезең (1922-1932) Ағылшын ғалымы Робинс және неміс ғалымы Котте
қатты қоректік орталарда культивирлеуге болатынын айтты, бірақ та белгілі
бір уақытта өсімдік тіндері өліп қалды.
4 кезең (1932-1940) француз ғалымы Р. Готри өсімдік тіндерінің жаңа
қоректік ортада периодтық отырғызу арқылы in vitro жағдайында ұзақ
культивирлеуді көрсетті.
5 кезең (1940-1960) 1955ж цитокин – фитогормон класының ашылуы табак
паренхимасының жасушалық бөлінуіне ықпал етті. Осы арқылы морфогенезді
индуцирленген каллустық тіндердің өсуін қамтамасыз етуге, эксплантты
жасушаларды қолданды.
6 кезең (1960-1975) Нотинген университетінің профессоры Э. Коккинг
ферментативтік әдісті ойлап шығарды. Оның әріптесі Пауэроль соматикалық
гибридтарды шығарды. Француз ғалымы Ж. Морель in vitro жағдайда культура
меристемасын қолдана отырып орхидеяның отырғызылған түрлерін алатын әдісті
ойлап тапты.
7 кезең (1975- қазіргі уақытқа дейін) in vitro техникасы тез дамуды
жалғастыруда, протопластардың электрслияния әдісі, мутагенез әдісі,
гаплоидты өсімдіктер алу әдісі, вектормен протопластардың жекеленуі арқылы
жасушаларды терең культивирлеу әдісі пайда болды. Генді инженерия әдісі
арқылы екі үйлі өсімдіктер үшін генді жеткізу әдісі ойлап шығарылды.
2. Өсімдіктің жекеленген бөліктерін культивирлеу әдісі - өсімдіктің
жасушасының маңызды құрамын тотипотенттілігін зерттеуде пайда болған.
Тотипотенттілік (лат. тотус- бүкіл, потенция –күш) – бұл жасушаның
генетикалқ ақпаратын ұйымдастырады. Онда бүкіл ағзаның өсуін және
дифференциациясын қамтамасыз етілетін жағдайлар туады. Тотипотенттілікке
жануарлар жұмырқаларының және өсімдіктердің жұмырқа жасушаларының ұрықтануы
тән.
Өсімдіктерде тотипотенттілікті табиғи жағдайда арнайы жасушалар
көрсете алады. Өсімдіктер тотипотенттілігі жараның жазылуында пайда болады.
Өсімдіктердің жаралы бетінде арнайы емес жасуша пролиферациясы себебінен
каустық пайда болады. Каллус жараның жазылуына әсер етеді.

Дәріс №3
Тақырып: Клеткалық биотехнологияның объектілері. In vitro – өсірілетін
клеткаларды биологиялық активті заттарды алу үшін пайдалану.
Жоспар
1. Каллусты культураны алу
2. Каллусты клеткалар қасиеті
3. Каллусты жасушаың генетикасы
4. Гормонға тәуелсіз өсімдіктер тіндері
1. Биологиялық активті заттарды шығаруда қатты фазалы ферментация және
терең суспензиялы культивирлеу арқылы алынған каллусты тіндер қолданады.
Каллусты культуралар – бұл дифференцирленген жасушалардан тұратын арнайы
емес пролиферлеуші тін. Клеткалар тіндерінің жекеленген бөліктерінде in
vitro, сонымен қатар жараланған өсімдіктер тіндерінде түзіледі.
Өсімдік жасушаларының каллусқа айналуы қоректік ортада
фитогормондардың болуына байланысты.
Әрбір жасушаның өсуі 3 фазадан өтеді:
1. бөліну
2. созылу
3. дифференцирлену
Қартаю мен бөліну болмау үшін және каллусты клеткалардың өлмеуі
үшін, эксплантта пайда болатын біріншілік каллусты, 4-6 аптадан кейін жаңа
қоректік ортаға отырғызады. Бұны пассирлеу операциясы деп атайды. Үнемі
пассирлегенде бөлінуге қабілеттілік 10 жылға сақталады. Каллусты
жасушаларды өсірген қисық S- тәрізді пішінге ие болады. Өсудің бұндай
сипаттамасын каллусты клетканың супензияда өсіруден байқауға болады.
2. Каллусты клекалардың ерекшеліктері. in vitro жағдайда өсірілген
каллусты клеткалар жай клеткаларға тән физиологиялық, химиялық қасиеттерін
сақтайды. Каллусты клеткалар 2-ші метаболиттік синтездік қасиетті сақтайды.
Суыққа төзімді өсімдік клеткаларынан алынған каллусты клеткаларда қатты
суыққа төзімділік, шынығуға бейімділік қасиеті байқалады.
Каллусты және пористі клеткаларға тән ортақ қасиет жоғарғы
температуға, осмотикалық белсенді заттарға, тұздалуға төзімділік.
Жай клеткалардан каллусты клеткалар жекеленген қасиеттерімен
ерекшелінеді. Оларда спецификалық белоктар пайда болады және
фотосинтезделген жапырақ клеткаларына тән белок мөлшері азаяды немесе
мүлдем жойылады. Каллусты клеткалар генетикалық гетерогенділігімен және
физиологиялық асинхрондылығымен ерекшелінеді.
Ағзаның бақылауынан шығу нәтижесінде каллусты клеткалардың өсуі
ұйымдастырылмаған, асинхронды және шексіз болады. Р. Готре 60 жыл бұрын
жаңа қоректік ортаға отырғызған сәбіз тінінің культурасы әлі күнге дейін
коллекцияда өсіп жатыр. Ашық грунтта өсіп жатқан өсімдікке қарағанда,
каллусты клеткалардың өсу циклы ұзақ.
Каллусты клеткалардың ерекшелігі, жас бойынша гетерогенді болуы:
клеткалар бір уақытта каллусты тіндерде кәрі және жас болады.
Каллусты клеткалар энергетикалық алмасуында елеулі өзгерістер
байқалады. Олар жай клеткалармен салыстырғанда ауаны аз тұтынады.
3. Каллусты клеткалардың генетикасы. каллусты тіндер клеткасы
генетикалық гетерогенді болады. Каллусты клеткалардың генетикалық
біртексіздігі алдымен әртүрлі тығыздықта байқалады, яғни каллусты клеткалар
хромосома санымен өзгешеленеді. Генетикалық стабильді in vitro болып
меристемалық тіндер саналады.
Каллусты және суспензиялы культураларда өсімдікке тән диплоидты
хромосома жиыны бар, клеткалар құрамында 3,4,5 және одан да көп хромосама
жиыны бар полиплоидты клеткалар кездеседі. Плоиплоидиямен қатар каллусты
клеткалар культурасында анеуплоидия (хромосома жиынының өсуі немесе
төмендеуі бінеше хромосомаға) кездеседі. каллусты клеткалар ұзақ
культивирлеген сайын плоидтылығымен көбірек ажыратылады.
Темекінің каллусты клеткаларын төрт жыл культивирлегенде диплоидты
клеткалар жойылып, барлық клеткалар полиплоидты немесе анеуплоидты болады.
Плоидтылықтың өзгеруінен басқа өсімдікткрдің тіндері мен
клеткаларын in vitro культивирлеу клеткаларда хромосомалық аббербацияның
пайда болуын шақырады. Ақырғысы культивирленетін тіндердің биологиялық
ерекшеліктеріне, сыртқы көрінісіне, зат алмасуына, өсу жылдамдығына әсер
етеді.
Каллусты клеткалардың генетикалық әртүрлілігі оларды клеткалық
селекциядажағымсыз факторларға төзімділікке, фитопатогендерге және жоғары
продуктивтілікке қолдануға мүмкін,дік береді.
4. Гормонға тәуелсіз өсімдік тіндері. Каллусты клеткалар қоректік
орталарда гормондардың мөлшеріне байланысты ғана бөлінеді. Бірақ та, ұзақ
культивирлеу нәтижесінде ортада гормонсыз өсу қабілетіне ие болуы мүмкін,
яғни ауксин мен цитокининге қатысы бойынша автономды болады. Бұндай
клеткаларды «қалыптасқан» деп атайды. Қалыптасқан клеткалар ісік клеткалары
сияқты, көп жағдайда қалыпты регенерацияға қабілетсіө және тек тератомдар
түзеді.
Барлық каллусты тіндерде, кейбір культураларда 4-ші апссаждан
абстап, регенерацияға қабілетілігі төмендейді, одан мүлдем жоғалады. Ескі
егілген культураларда өсімдік регенеранттар алынбайды. Химиялық ісіктермен
негізделеген «қалыптасқан» тіндерден басқа бактериямен, вируспен туындайтын
өсімдік тектес тіндермен және өсімдіктердің түраралық гибридтерден
туындайтын генетикалық ісіктер де бар.
«Қалыптасқан» тіндерде және ісіктерде өзіндік гормондардың
интенсивті синтезі жүреді, сондықтан олар қоректік орталарға енгізуді қажет
етпейді.
«Қалыптасқан» тіндерде гормонға тәуелділік гормондар ситезіне,
грмон молекулаларының құрылысуына қатысуына, ферментті белоктардың
синтезіне жауапты гендер белсенділігінің өзгерісі нәтижесінде туындайды.
Ісік тіндерінде гормондар синтезі осы процесске жауап беретін бактериалды
генді клеткаға ауысуына қатысты.

Дәріс №4
Тақырып: In vitro – өсірілетін клеткаларды организмге, ұлпаларға
және мүшелерге түрлі биологиялық активті қосылыстардың, дәрі-дәрмектердің,
токсиндердін, әр түрлі патогендердің әсерін зерттеу үшін модельді объект
ретінде пайдалану.
Жоспар
1. Жинақтағыш немесе кезеңдік культивирлеу
2. Үздіксіз культивирлеу
1. Сұйық ортада клеткаларды культивирлеу бірнеше әдіспен іске асады.
Қарапайым және көп таралғантүрі жинақтағыш немесе кезеңдік
культивирлеу болып табылады. Клеткалар тұрақты көлемде қоректік
роллерлі немесе тербеткіш типті құралдарда өседі. мұндай жүйелер газ
және метаболизмнің ұшқыш өнімдерінен басқа барлығы үшін жабық. Осы
кезде колбаларда көп мөлшерде көмір қышқыл газының біраз көлемі
жиналады. Өсу аяулағаннан кейін суспензия алғашқы тығыздыққа келеді,
өсіру циклы қайталанады.
Өсіру циклы – бұл жүйе инокулюмды жаңа ортаға келесі
субкультивирлеуе дейі енгізу. Жинақтағыш культуралар үшін көбінесе минутына
60-120 айналым жылдамдық жасайтын толық айналымды және жартылай айналымды
платформалы тербеткіштердегі әртүрлі мөлшердегі коникалық кеңмойынды
колбалар қолданылады. Өсімдік клеткалары микроорганизмдер сияқты
спецификалық ерекшеліктер қатарына қарамастан өсу заңдарына бағынады,
сондықтан микроорганизмдермен жұмыс істегенде қолданылатын технология және
аппаратуралар қолданылады. Микроорганизмдерді әдетте ферментер деп аталатын
аппараттарда культивирлейді. Жинақтағыш ферментерлерді 0,5-10л көлемді
лабораторлы ферментерлорда өсіруге болады. Тереңдік өсірумен салыстырғанда
тербеткіштердегі колбаларда тереңдік өсіру арқылы клеткаларды ферментерда
культивирлеуде олардың кострукцияларымен сәйкес жаңа мүмкіндіктер пайда
болады.
2. Ағынды режимде культураларды өсіру әдісі үздіксіз культивирлеу деп
аталады. Ағынды жүйені құру негізіндегі тәжірибелерде культураның
экспоненциалдық өсу фазасында жаңа қоректік орта бөлігін супензияға
қосу клеткалардың бөлінуін ұзақ қолдайды. Үздіксіз культивирлеу жабық
ағынды және ашық ағынды жүйелермен іске асады.
Жабық ағынды жүйеде суспензиялы культура жаңа қоректік ортамен
қамтамасыз етіледі, онда пайдаланылатын ортаның ағып келуі мен ағып шығу
көлемі баланстанған. Өсірудің жартылай ағынды режимінде суспензияның
белгілі бір көлемі уақыт өткен сайын таңдалынып алынады және қалған бөлігі
жаңа ортада ерітіледі. Үлкен биомасса алу үшін және биохимиялық зерттеу
үшін қолданылады.
Ашық ағынды жүйе жаңа қоректік ортаның ағып келуі мен клетка
суспензиясының тең көлемін жою арасындағы балансты қамтамасыз етеді. Клетка
бөлігін жүйеден жою жылдамдығы бөліну нәтижесінде, клетаның бөліну
жылдамдығына сәйкес келуі керек, ол клетканың өсуі және биосинтез арасында
тең жағдай туғызады.
Үздіксіз культивирлеу негізіне микроорганизмдерді культивирлеуде
құрылған турбидостат және хемостат принциптері кіруі мүмкін. Хемостатты
режимде үздіксіз культивирлеу ламитирлеуші өсу факторының әсерінен жүреді.
Турбидостат принципі сыртқы лимитирлеусіз үздіксіз культивирлеуді
көрсетеді, клетка популяциясының өсуі белгілі бір деңгейде клетканың
оптикалық тығыздығын реттеуде қолданылады. Бұл үшін төмен тығыздықты
клеткалы және жоғарғы өсу жылдамдықты суспензиялар келеді, яғни алғашқы өсу
фазасы популяциясы. Турбидостат тығыз культураға сезімтал фотоэлектрлік
элементпен толтырылған хемостатпен сипаттайды. Клетканың өсу популяциясы
берілген деңгейде автоматты түрде фотометрикалы ортаны беру регуляциясымен
қолданылады.

Дәріс №5
Тақырып: Клеткаларды культивирлеу
Жоспар
1. Әдіс тарихы
2. Клеткаларды культивирлеу
1. 20 ғасырдың бірінші 10 жылдығында жануарлардың клетка
тіндерін организмнен бөліп алуды және олардың өсуіне жағдай жасауды және in
vitro өндіруді мойындады. Мұндай процесстерге қол жеткізуге болатындығы
белгілі болғандықтан, жұмыcтың екінші этапы басталып, негізі болып өсіру
мүмкіндіктерінің демонстрациясы және мұндай клеткадағы инфекция агент-
вирустарының репродукциясы болып табылады. Тарихтың үшінші этапы вакцина
препараттарына қолдану үшін жануарлар клеткаларындағы үлкен вирус
материалының көлемін алу мүмкіндігін прктика жүзінде көрсетіле басталды,
және жойылуы: 1) клеткаға спецификалық экзогенді алынған гендерді енгізу
және олардың экспрессиясын алу және 2) клеткада бүтін популяцияның бір
клеткасын өсіру мүмкіндігі бекітілгенге дейін болды. Мұндай популяцияларды
қоршаған ортаға антидене бөлетін клеткалардан алғанда, барлық антидене
молекулалары тұнбаүстілік сұйықтықта бірдей болады. Бұл екі феноменнің
себебі мен барысы қазіргі уақытта қарқындылықпен зерттелуде және олар
өзімен берілген бағыттың 4-ші этап жұмыстарының басталуынаң алғышарты болып
саналады.
Культурада жануар клеткаларының өсу және бөліну қасиетін көрсету
үшін, әдістер қатарын меңгеру қажет етілді.
1. Экзогенді прокариоттардан және саңырауқұлақтардан таза клеткалар алу
әдістемесі.
2. «Тіннен бөлініп алынғын» немесе жекешеленген клеткалары бар ортаны
жасау әдістемесі ығыстырылмайды.
3. Динамикада клетканың дамуын бақылау әдістемесі.
4. Жануарлар клеткасын үздіксіз in vitro жағдайда культивирлеу және
оларды басқа биологиялық агенттерден бос ұстау әдістемесі.
Осы әдістемелердің разработкасының ғылыми негізін, жануар және
өсімдік тектес тірі организмдердің құрылымдық элементі ретінде клетка
құрайды. Жануар тінінің клеткасын организмнен бөлу және одан кейін олардың
өсуіне жағдай жасау оларды in vitro өндіру идеясы Клод Бернардың
концепциясында пайда болды. Ол ішкі жағдайда қоршаған ортада өзгеріске
тәуелсіз, ішкі ортаның тұрақтылығын сақтауға қабілетті тек тірі организмдер
ғана емес деген пікірде болды. Организмнен тыс жануар клеткасы өзінің ішкі
жағдайларын сақтауға тырысады. Егер ішкі және сыртқы жағдайлар арасындағы
ерекшелік елеусіз болып, өсу мен клетканың бөлінуінің мүмкіншілігі артады.
Мұндай құбылыстың түсінігі қолдауға қабілетті және клетканың организмнен
тыс өсуін стимульдейтін орта құрылымын жасау болып табылады.
Одан кейінірек 1885 жылы У. Рукс организмнен тыс тірі организмдерді
сақтайһу мүмкіншілігін практика жүзінде көрсетті. Ол тауық эмбрионының
қабықшасын физиологиялық ерітіндіде тіршілікке қабілетті күйде сақтады.
Кейінірек 1897ж Леб жалғағыш тіндермен қан клеткаларын сарысу мен қант
плазмасы бар пробиркаларда тіршілкке қабілетті күйде сақтады. Льюнгрен
(1898ж) реиплантацияға қабілетін сақтаған қышқылды ортада адам терісінен
алынған экспланттарды тіршілікке қабілетті күйде ұстады. Қосымша
эксперименттерді Джолли (1903) саламандра лейкоциттері бпар ілмелі
тамшыларда клетканың бөлінуін бақылады., ал Биб және Эвинг (1906) бұл ит
тінінің лимфосаркомасын қайта отырғызу деп бекітті.
Ру және Росс Харрисон жұмысты жалғастыру барысында ілмелі тамшылар
әдістемесін жетілдірді. 1907 жылы камераның көмегімен бірнеше апта ішінде
нерв клеткаларының өсуін бақылай алды: ол бұл клеткалардың өсу жылдамдығы
25 минутта 20мкм болатынын бекітті.
1913ж Алексис Каррель эмбрион экстрактысымен байытылған қан
плазмасын қолданды. Бұл әдістеме үлкен жетістікті қамтамасыз етті. Рид
теңіз шошқасының сүйек миынан культура дайындап және белгілі химиялық
құрамдық ортада экспланты өсіруге талпынды. Левис (1911) және Рид (1908)
қолданған. Каррельдің жұмысы «өлмейтін» клеткаларды культивирлеу деген
атпен жариялағандықтан көпшіліктің үлкен назарын аудартты. 1912 жылдың 17
қаңтарының басы тауық эмбрионының жүрегінің клеткаларының инкубациясын алу
кезеңі болды. Клеткаларды қайтара егуді 34 жыл бойында Эблинг жалғастырды.
Каррель хирург болғандықтан және асептика жөнінде білгендіктен жануарлардың
клеткаларын in vitro культивирлеуге үлкен үлесін тигізді. Каррель өзінің
әріптестеріне клеткаларды қайтадан өткізу процесі кезінде жасалатын
бақылаулар туралы демонстрация жасады. Істелінген жұмыс барысында
культивирлеу ортасы рецептурасына бірқатар өзгертулер енгізді. Тирод
Ренгердің ерітіндісін модифицирледі және тауық сарысуымен эмбриональды
экстракты толтыруда фибрин коагулятын қолдана бастады. Бөлініп жатқан
жануарлар клеткаларын бақылау үшін 1928ж Канти кинофотомикрография тәсілін
шығарды. Осы кезеңде клеткалық жұмыс техникамына қосымша және түбірлі
өзгерістер болды. Ең бірінші жалғыз клетка культуралар клонын 1948 Эрли мен
оның әріптестері алды.

Дәріс №6
Тақырып: Жануарлар клеткаларын культивирлеу
Жоспар
1. Культураға клетканы енгізу
2. Клеткалардың шығуы
Экспериментальды жұмыстың мақсаты мен тапсырмаларына қатысты жануар
клеткаларының 2 бағытта культивирленуін шығаруға болады.
- клеткалар культурасы
- ағза мен тін культуралары (ағзалық культуралар)
Клеткалар культуралары құрылымдық мекемелерден алыстатылған
гистиотипикалық архитектураға тән қасиетін биохимиялық белгілерін жоғалтады
және олар арнайы жағдайлардың болмауы кезінде тепе-тең жағдайда көбінесе
жетпейді. Клеткалар культурада көбееді, олар клетканың үлкен массасын алуды
қамтамасыз етеді, одан оларды идентифицерлейді, идентикалық параллельдерде
бөледі және қажет болса сақтайды. Осымен байланысты кейбір зерттеулер
берілген тіннің құрылымдық біртұтастығын сақтайтын клеткалық жүйелерді
қолданады.
Клеткалар түрінің культураға кірген тізімі жетерліктей көп. Олар
адамның қосалқы тін элементі (фибробластар), скелет тіндері (сүйек және
сіңір), жүрек және тегіс бұлшықеттер, эпителий тіндері (бауыр, бүйрек
т.б.), нерв жүйесінің клеткалары, эндокринді клеткалар (бүйрек үсті,
гипофиз), меланоцит және әртүрлі ісік клеткалары. Клеткалар популяциясы
үнемі гомогенді болмайды және фиксирленген фенотипі бар. Культураға
енгізуге қандай ті алуға болады, ересек немесе эмбринальды, калыпты немесе
ісіктік? Эмбриональды тіннен алынған культуралардың тіршілікке
қабілеттілігімен және ересек тіндерге қарағанда белсенді өсу қабілетімен
сипатталады. Мұның себебі болып, мамандандырудың төменгі деңгейі қызмет
етеді. Ересек тіндерді пролиферативті қабілеті болып, олардың бөлінбейтін
маманданған клеткалардың көп болуы. Үлкен тіндердің біріншілік клетка
культураларын алу және олардың көбеюі қиын болғандықтан, мұндай
клеткалардың өмірі ұзақ емес. Ісіктен алынған культуралар үздіксіз ұзақ
уақыт пролиферленгенде қалыпты тіндер культуралар өміріне белгілі бір
уақыт береді. Ісік клеткалары культурасында пролиферацияға қабілеттілікті
сақтауда аздаған бөлікте дифференцировка болуы мүмкін.
Жаңа бөлінген культуралар пассирлеу мен субкуьтурлеубасталғанға
дейін біріншілік культура деген атқа ие болады. Біріншілік культуралар
клеткалары әдетте гетерогенді және төменгі пролиферациямен сипатталады.
пассерлеу культураның өмір сүруін ұзартып, клонирлеу мүмкіндігін зерттеу
және клетканың сақтау қасиетін қамтамасыз етеді. Бұдан неғұрлым біртекті
популяция пада болады, сонымен қатар специфирленген клеткалар жоғалады.
Бірнеше егуден кейін клеткалар линиялары өледі неме транформацияланады және
тұрақты клеткалар линияларына айналады. Өлмейтін қасиетке ісіктен алынған
клеткалар ие. Тұрақты клеткалар линиялар морфологиялық өзгерістерімен,
сарысуға тәуелділігінің төмендеуімен, эффектісінің жоғарлауымен субстратқа
тәуелділігінің төмендеуімен гетероплоидтылықтың жоғарлауымен
анеуплоидтықпен және ісіктектіліктің көбеюімен констатирленеді.

Дәріс №7
Тақырып: Соматикалық бұдандастыру
Жоспар
1. Іn vitro жағдайында культивирленетін клеткалар сипаттамасы
2. Трансформация
Бір типтегі клеткалар ұстап тұру үшін тіндердеәрекеттеседі және
бөліну жылдамдығын келіседі. Бұндай тектің «әлеуметтік» бақылауы бұзылу
реакциясында байқаланады. Ұқсастықты культуралардың дисоциирленген
клеткаларынан байқауға болады.
Адгезивті қатынастар клеткалар мембраналарын беткі рецепторларынан
комплекстердің түзілуін қамтамасыз етеді. Гликопотеиндердің көлденең
қозғалысының нәтижесінде мембранада гликопротеин комплексінің электронды
тығыз белгілер (бляшки) түзіледі. Бұндай белгілер аглютинерлі агенттер
немесе көрші клеткалар антиденесінің әрекетіне жауап ретінде түзіледі.
Адгезияда субстрат көпвалентті антидене ретінде әсер етеді. Ал көп түзілген
белгілерді «адгезивті дақ» деп атайды. Бұл дақтар адгезивт ақуыздарға бай
және гликопротеидті ұстап тұратын ситос скелет элементтері шығарады. Осы
қызметтердің көмегімен мембрананың күюі (разжижение) азаяды және
домаланудан алдын-ала сақтанады. Клетка түзілген адгезивті дақтар
шошақтарын (выступы) құрайды. Олардың көмегімен орын ауыстырады. Цитоплазма
шошақтары көрші мембраналармен қатынасында қозғалысты ингибирлейді. Осы
жағдайда клеткалар өздерінің псевдоподияларын басқа бағытқа ауыстырады.
Ондай клеткалар көпқабатты болған жағдайда жалған аяқтылардың белсенділігі
және клеткалардың қозғалысы тоқтайды. Қалыпты клеткалар бөлінуді тоқтатса,
бұл құбылыс тығыздыққа байланысты пролиферацияның тоқтауымен
түсіндіріледі.Егер мұндай моноқабат атбақшада клеткадан бос сызық пайда
болуы үшін инемен «жараланса (поранить)» клеткалар бұл сызықтың шетімен бос
орынға жылжи бастайды және бөліне бастайды. Клетка популяциясының тығыздығы
ортада өсу факторларының жоғарылауымен үлкееді, бұдан басқа егер
культуральды сұйықтық табақша бетімен клетка шеттерімен ағатын болса, онда
ортамен жуылған, басқа клеткалар үстімен өткен клеткалар, бос клеткалар
бөлімдері үстімен өткен, ортамен жуылған клеткаларға қарағанда баяу
бөлінеді. Клетка үстімен аққан ротада, кейбір қоректік заттар немесе өсу
факторлары болмайды.
Өсу факторы әдетте концентрациясы 10-10 М болатын ортада
болады. Өсу факторы бір фибробласта 105 рецепторлы өсу факторы болады,
олардың әрқайсысы оған өте жоғары типтілікке ие. Осылайша әрбір клеткаларды
150мкм диаметрлі сфера көлемінде өсу факторларының барлық молекулаларын
байланыстыру үшін рецепторлары жеткілікті.
Осыдан басқа клетка бетінің рецепторларымен байланысқан өсу
факторларының көп мөлшері эндоцитоз жолымен бұзыып, жойылады. Бұдан
көршілес клеткалар бір-бірімен өсу факторының азғана мөлшері үшін
бәсекелеседі. Бәсекелесудің бұндай түрі тіндегі клетка үшін де,
культивирленген клеткалар үшін де маңызды. Ол тығыздықтың кейбір деңгейінен
жоғарғы популяцияның өсуіне айналады.
Өсу факторы мен қоректік орта бәсекелестігі клетка культурасындағы
бөлу жылдамдығына әсер ететін жалғыз фактор емес. Субстрат бетіндегі олады
распластауымен, бос орындарға қозғалысының клеткалар формасы олардың бөліну
қабілетіне тағы да күшті әсер береді. Қатты бетке бекітілгенқалыпты
клеткаларды культивирлегенде, олар тіпті бөлінбейді. Сондықтан дөңгелек
пішінді иемденеді. Клетканың бөліну жиілігі олардың распластау дәрежесінің
үлкеюіне байланысты өседі. Қатты распластанған клеткалар көптеген өсу
факторының көп молекуласын ұстауы мүмкін және өзінің үлкен жоғарғы
қабатының арқасында көп мөлшерде қоректік ортаны қалғиды (поглощать).
Бірақ та субстрат аймағымен байланысқа түсе сала, клетка
распластай алмайтындай бұл аймақ өте кішкентай болса да суспензияда
пролиферацияға қабілетсіз клеткалар типі белсенді бөлінеді. Бұндай фокальды
байланыстар сыртқы клеткалық матрикстар молекуласымен клеткадан тыс актинді
филаминттер қосылысының орны болып табылады. Осы және басқа да байқаулар
клетканың бөлінуін бақылау қалайда цитоскелеттік ұйымдасумен байланысты
деген ойды туындатады. Механизм мен функция бұл ретте түсініксіз клетканың
байланысы оның бекітілуіне байланысты деп ойлауға болады, шындығында тіндер
клетка пролиферациясын, оның бүтіндігін сақтайды. Қатерлі ісік
клеткаларында өсуді басқарудың жоғарылауы әрқашан клетканың адгезивтіктің
азаюымен байланысты.
2. Культивирленген клеткалардың өсу ерекшелігінің өзгерісі
трансформация деп аталады. Трансформация қайтарылмайтын процесс, және тұқым
қуалаушылық ақпараттың спецификалық бөлігінде, өзінің иесінің
трансформирленген геномына қосылған неопластикалық фенотипті бақылайтын
генетикалық өзгерістері болады. Өсу ерекшеліктерінің өзгерісі,
трансформирленбеген клеткалар үшін жағымсыз жағдайда клеткаларды
полиферлейтін адаптивті ерекшеліктерінің бірі болып табылады. Осылайша
қалыпты клеткаларының өсуін шектейтін, трансформирленген клеткалар
популяцияның өте жоғары тығыздығында өседі және өсу факторларында олардың
төменгі қажеттілігімен байланысты. Трансформация кезіндегі өзгерістер
клеткалық мембрана арқылы қоректік заттар тасымалдауымен байланысты екені
дәлелденді, бұл, өз кезегінде «геометрикалық» өсу факторларына клеткаларды
аз тәуелді етеді.
Трансформирленген клеткалар сферикалық клондарды құра отырып,
суспензиялық клеткада өседі. Осылайша трансформирленген клеткалар аздаған
мөлшерде толерантты жануарларға алдын-ала енгізілген жағдайда қатерлі ісік
пайда болуы мүмкін. Осы себеппен трансформация кезінде қатерлі өзгерістеоге
теңеседі. Трансформация вирусты немесе спонтанды болуы мүмкін. Көптеген
клеткалармен орындалған зерттеулер вирустық трансформациямен негізделген.
Көп зерттеулер спонтанды тасымалданатын клеткалар ДНК енгізінде
жалғастырушылықты игереді. Бірақ бұнадй жұмыстар анологиялық болып саналады
және өзгерістер қалыпты генде нүктелі мутацияны шақырады.
Мысал болып адамның диплоидты клеткаларының линиялары қызмет етеді.
Трансформирленген клетканың өсуіне жоғары қабілеттілікті трансформация
береді.
Қартаю генетикалық факторларға байланысты, яғни әрбір түр сипатты
өмір жалғасын береді, бірақ популяция ішінде бұл көрсеткіш бойынша
вариабельділік фенотип әсерімен куә болады. Адамның диплоидты клеткалар
адаптирлегенде (линия W138) басынан бастап культивирленген клеткалар қартаю
феноменінберетіні көрінді және өмірдің өлшеулі уақытын берді.
(50±популяцияны екі еселеу). Өмір жасына байланысты өзгерістер
митотикааралық интервалдардың ұзаруын қоса қамтыды, (19±25%-31±41%/сағ),
метаболизмнің, фермент деңгейінің және өнім экспрессиясының өзгеруі.
Клетканың пайда болуына байланысты өмір жалғасы аралығы культурадағы
клеткалардың екі еселену потенциалы арасындағы анық байланыс көрінбеген.
Өмір жалғасы бойынша шектелген клеткалық линиялар, мысалы
фибробластардың диплоидты клеткалар линиялары өндіріс мақсаты үшін идеалды
обьектілер болып санала алды. Олар клеткада қартаюдың нағыз өзгерісі
болғанша пайдаланылуы керек. Практикалық қатынаста бұл өндіріс мақсатында
оларды қолданғанда бұл клеткалардың өмір сүру периоды 12 мен 30 пассаж
аралығында аяқтлады (бірінші жағдайда – себетін материалды дайындау үшін).
Трансформирленген клеткалар шектелген өмір сүру жалғасын
иеленбейді, бұл биотехнологияда олардың мынадай артықшылығын айқындайды:
әртүрлі өнімдердің генерациясы үшін субстрат ретінде клетка популяциясына
неғұрлым жоғарға тығыздықпен, неғұрлым өсудің жоғары жылдамдылығымен
суспензияда өсу қабілеттілігімен араластырып пайдалану.

Дәріс №8
Тақырып: Микробиологиялық жүйелердің клеткалық биотехнологиясы.
Жоспар
1. Қоректік орта
2. Клетканың культивирлену шарты
Тіннен немесе ағзадан клеткаларды алып оларды культураға
орналастырған соң, культуральды орта клеткалары in vivo иеленетін барлық
сыртқы жағдайларды қамтамасыз етуі керек. Бұл клетканың өмір сүруін,
олардың пролиферациясын дифференцировкасын қамтамасыз етеді. Сыртқы
клеткалық орта клеткаларды қоректік және гормональды факторлармен, яғни өсу
үшін және клетканың өмір сүруі үшін барлық қажеттілікті қамтуы керек.
Адам және жануарлардың клетка культурасы сұйық (қоректік орта)
газообразды (газ концентрациясы) және қатты (субстрат беті) фазада,
нақтыланған талаптарды көрсетеді. Қоректік орта түсіндірілмеген биологиялық
түзілу компоненттері қосылатын, анықталған құрам ерітіндісін құрайды
(плазма қоспасы, қан сарысуы, тіндік экстракт және т.б.). Қоректік ортаның
негізін тұз ерітіндісі құрайды. бұл ерітіндіде минералдық компоненттер
культивирлеу процесінде ортаның тұрақты қышқыл сілтілі балансын қолдайтын
буферлік функцияны орындайтын ерітінді таңдалған. Ортаның pН тұрақтылығы
культивирлеу шартының негізгі талаптарының бірі болып саналады.
Қоректік ортаны дайындау үшін Эрл мен Хенкстің тұ ерітіндісі
қолданылады. Бұл ерітінділер фосфаттұзды буфер Дубленко мен Фугт сияқты
культураны пассирлеуде, клетка линияларын бөлуде, клетка культурасымен
басқа манипуляцияда өсіру және жуу үшін қолдалынады. Культивирлеудің басқа
маңызды шарты осмотикалық қысым болып табылады. Ол 1кг еріткіште
(осмолярлы) немесе 1 ерітіндіде (осмолярлы) ерітілген заттардың осмотикалық
белсенді бөлігінің (иондар мен ионсызданғдырылған молекулалар) мольдерінің
санымен анықталады. араластырылған су ерітіндісінде бұл шамалар жақын.
ерітіндінің осмолярлығы (осмоль/кг)=Smі *хі , мұндағы mі – ерітілген
заттардың 1-ші концентрациясы (моль/кг), хі – молекуласы диссоцирленген
бөліктер саны. Мысалы, Эрл ерітіндісі үшін осмолярлықтың есептік шамасы.
310,6 мосмоль/кг шындығында 283 клетка көбеюінен шығатын pН диапазоны мен
осмолярлығы жіңішке және клетка типіне байланысты варьирленеді. Мысалы:
W138 диплоидты фибробластарының клональды өсуі үшін pH=7,30+0,15 оптимальды
және осмолярлығы 285+40 мосмоль/кг, ал балапан эмбрионынан шығатын
фибробластар үшін 7,12+0,18 және 300+20 сәйкес болады. Көптеген ортада егер
көмір қышқыл газы бөлінсе HCO3=СО2+ОН. Көптеген ортада бикарбонатты буфер
қолданылады да, ОН концентрациясы көбееді. Ерітінділер бикарбонат буферінің
аздаған санын ұстауы мүмкін (Хенкс ерітіндісі), олар рН қолдау үшін тығыз
жабылған сосудтарға арналған. Басқаларынды (Эрла ерітіндісінде) биарбонат
көптеу, олар көтеріңкі парциальды СО2 қысыммен жүйеде қолданылады. Егер,
культура, рН қолдау қиын болған жағдайда СО2 инкубатоынан тыс жүргізілсе,
альтернативтік буферлік жүйе қажет. HEPES4- (2-оксиэтил)-пиперазин
этансульфондық қышқыл жақсы буфер болып табылады. HEPES суда жеңіл ериді,
еківалентті катионды байланыстырмайды, 0,05 моль концентрациясына дейін
цитотоксикалық емес 0,01 0,03М концентрациясында қолданылады.
Жануарлар клеткасы культурасын жүргізу үшін стандарттық орта. Игл
орталары МЕМ (minimal essetial medium) және ВМЕ (basal medium, Eagle). МЕМ
жиі қолданылады. Олар көмірсулар субстратының міндетін атқаратын минералды
заттар, Аминқышқылдары (13 ауыстырылмайтын), 6 суда ерітілген ерітінділер,
витаминдер, холин мен инозитті құрайды. МЕМ тек сарысумен ғана қолданылады,
өйткені онда тек қана биотин, В12 витамині, темір ионы және
микроэлементтер. Эрл ерітіндісінің негізі.
Дульбекко ДМЕ және ДМЕМ ортасы (Игл ерітіндісінің қосарланған
модификациясы). Клетка культивирленгенде әртүрлі типтер қолданылады, оның
ішінде трансформирленген клеткалар мен гибридтер бар). Марысусыз ортада
негіз болып табылады. Амин қышқылының қосарланған концентрациясын, глицин,
серин, пируват, темір құрайды. Бұл ортаны қолданғанда 10%-тік СО2
концентрациясымен инкубатор қажет.
Исков IMDM – Дульбекко ортасы модификациясы. алмастырылмайтын
амиқышқылдары, биотин, В12 витамині, натрий селениті қосылады. Ортаға HEPES
енгізілген және NaCl мен NaHCO3 концентрациясы азайтылған. Орта сарысусыз
лимфоциттер мен қанжасаушы клеткаларды культивирлеу үшін қолданылады.
МакКоя 2А және RPMI сериясы ортасы. МакКоя 5А 1958 жылы сарысу
қатысымен Уолкер 256 карцинсаркома клеткаларының клональды өсуін қолдау
үшін құрылған, одан кейін басқа алғашқы культуралар мен әртүрлі клеткалық
линиялар құрылды. Әдетте Ивката мен Грейс (RPMI) модификациясы өндіріледі,
сарысу қатысымен лейкоциттерді культивирлеу үшін арналған, гибрид
культивирлеуінде де жиі қолданылады. атмосферадағы культивирлеуде ауадағы
СО2 концентрациясы 5%.
199-ші орта 1950 жылы балапанның эмбрионынан жүрек фрагментін
культивирлеу үшін құрылды. Орта үшін азықтық ортаның кең кең спектрі мен
жоғарғы концентрациясы сипатталған. Қосымшасыз, алғашқы клеткаларды
қолдайтын, сарысумен тез көбейетін клеткалармен өсетін орта болып саналып,
қолданады (егер тасымалданбаса). клетканың оптимальды өсуі үшін 5-20%
фетальды сарысулар қосымшаланады.
Сарысу ұсақ және ірі молекулалардың клетка өсуін шақыруға да,
тежеуге де қабілетті күрделі қоспаны айқындайды. Сарысудың күрделі
функциясына: гормональды жағдайлармен қамтамасыз ету, клетканың өсуі мен
олардың функцияларын стимульдеу. Клетканы бекіту және распластау
факторларын қамтамасыз ету, гормон жеткізетін тасымалдау ақуыздарымен
қамтамасыз ету минералды заттар липидтер т.б. жатады. Саоысу ақуыздары
клеткалық бөліну стимуляциясында тура және спецификалық қатысында өсу
факторы деп аталынады.
Сарысуды өсу факторының көпшілігі бірнеше нанограммалардың
милиметрге және төмен араласумен қатысады. Бұл факторлардың кейбіреуі
дифференцировканың нақтыланған стадиясының клеткалары үшін, қандай да бір
клеткалары типімен басқасының әрекеті шекиелмеуімен анықталады.
Бір және клетканың тағы да сондай түрі өсудің әр қилы факторларымен
стимульденген. мысалы: фибробластар өсу факторына, эпидермистің өсу
факторына, тромбоциттер және соматомединдердің өсу факторына жауап беріп
көбейеді. Осылардың бәрі митогендер болып саналады (митоз стимульдейбі).
Барлық клеткалар типі үшін бұдан басқа маңызды фактор инсулин гормоны болып
саналады. Басқа гормондардың неғұрлым жиі ұолданылатыны глюкокортиоидтар
(гидрокортизан, диксометазан), стероидтар (эстрадиол тестостерон,
прогестерон) және қалқанша без гормоны (тринодтиронин). Гормондар клеткалар
типімен тығыздығына байланысты өсуді стимульдейді, немесе басып тастайды.
Глюкокортикоидтар, мысалы, өсу факторына олардың сезімталдығын өзгерте
отырып клеткалар пролиферациясына әсер етеді.
Аз молекулярлық факторларды (витаминдер, аминқышқылдары, липидтер
т.б.) жеткізу үшін тасымалдау ақуыздары қажет. Бұл рольде альбумин ойнайды.
Безді тасымалдауды трансферрин қамтамасыз етеді, ал көптеген
культивирленген клеткалардың беті бұл клетка үшін рецепторлар жасайды.
Клетканы бекіту распластау факторына коллаген мен фибронектин жатады,
хондронектин неғұрлым арнайы (хондроциттер адгезиясы) және эпителиальды
клеткалар адгезиясы жақын.
Ақырғы жылдары клетка көбеюі үшін сарысусыз орта құрылды. бұл орта
белгілі бір салада ғана мамандандырылған, яғни клетканың нақтыланған
түрлеріне арналған. Базалық ортаға инсуллин, трансферрин, гидрокартизон
немесе оның аналогы дексаметазан қосылады. Сарысусыз ортаның нақты
артықшылықтары қамтиды: орта құрамын үлкен тұрақтандыру жолымен іске
асыратын тәжірибе қорытындыларын жақсарту, культураның вирустармен,
саңырауқұлақтармен, микоплазмамен залалдану рискісін төмендету. Клеткалық
метаболизмдер өнімін тазалауды жеңілдету, биологиялық зерттеулер
қорытындысына қосымша белоктардың әсерін төмендету, сарысудың
цитотоксикалығының болмауы. Сарысудың қатысуымен клетканы культииврлеу
бірқатар жетіспеушіліктерді қамтиды: кейбір шығатын тіндермен байланысты
болатын тіндер үшін сарысу физиологиясы сұйық болмайды, сондықтан, мысалы:
сарысу фибробластардың өсуін шақырады бірақ эпидермальды кератиноциттердің
өсуін тежейді, сарысу цитоксикалық болуы мүмкін, өйткені полиаминге
(спермин, спермидин) әсер ететін полиаминоксидаз құрайды, ол тез
пролиферлеуші клетка секрециясы өнімі болып табылады; әр партиядағы сарысу
құрамының маңызды вериабельдігі, сарысулар арнайы өсу факторының клетка
культурасына үстемелеу керектігін шақыратын жеткіліксіз санын құрауы
мүмкін.Сүтқоректілердің көптеген культуралары пролиферацияға түспей,
клеткалық моноқабат құрмай тұрып, субстратқа бекітіп распластайды. Осымен
байланысты қажет болатын материалдар мәселесі көтерілді. Қазіргі уақытта
субстрат үшін бірнеше материалдар қолданылады. Шыны пирекстан
(аллюмоборосиликат шыны) жақсылау, яғни натрисиликатты шыны ортаны
қалдықтандыруы мүмкін және оны қолданар алдында әлсіз қышқылды қайнату
қажет. Қолданған сайын мұндай шынының пайдалылығы азаяды. Пластик –
полистерол, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон, т.б. жиі қолданылады.
Металлдар тат баспайтын болат, титан сияқты сәйкес келеді. Себебі бұл
заттар химиялық инертті, жоғары теріс беткі зарядтарды қамтиды. клеткалар
электростатикалық өзара әрекеттесу арқылы бекітіледі, культуральды
сосудтардың беттері суланған және теріс зарядты болуы крек. Бұған қышқылдау
агенттерімен химиялық өңдеу арқылы физикалық әсер ету (жоғарывольтты
разрядпен, ультракүлгін сәулемен, жоғарғ энергетикалық электрондармен
бомбардировкалау) арқылы жетуге болады. Бұл әдісті пластик ыдыстар
өндіретін фирмалар қолданады. Кейбір зерттеушілер, бұған да қарамастан
тіпті жаңа ыдыстыда клетка отырғызу алдында концентрленген қышқылымен және
калий бихроматымен өңдеп, одан соң тазалап жуғанды дұрыс көреді. кей кезде
сосудтың үстіңгі жағын клетканы бекітуді жеңілдететін заттармен жабады. Бұл
үшінколлаген мен полиамин қышқылдарын жиі қолданады.
3. Өсімдік клеткаларының, тіндерінің, органдарын культивирлеу жетістігі
тек ортаның құрамы ғана емес, культивирлеу шартымен де анықталады,
өкінішке орай, олардың in vitro клеткасының өсуіне және дамуына әсері
нашар зерттелген және арнайы зерттеуді қажет етеді. айтылған,
тұжырымдарға сәйкес клетканың сәтті культивирленуі үшін 25±2°С тұрақты
жылу қажет. Бірақ бұл қалыптасқан, жағдай мәліметтерден қалыптасқан,
жағдай мәліметтердің шектеулігін қамтиды. Темекінің каллустың
өнімінің оптимальды өсуі 32°С-да, ипомеяның суспензиялық өнімі – 30-
32°С-да қадағаланады.
Өсімдіктің бірінші және екінші метаболизм үрдісіне жылу әсер етеді.
Жылулық оптоминимумды таңдап алу әр культураға эксперимент мақсатына
байланысты эмпирикалық тәсілмен жүзеге асуы қажет. Дегенмен, мұндай
тәжірибені қою – еңбекпен, ұзақ жұмыспен келеді, сондықтай зерттеушілер
клетканы әдеттегідей 25°С мөлшеріде өсіреді.
Клетка культивирлеуге әсер ететін сыртқы факторға жылудан басқа
жарық та жатады. Осы уақытқа дейін фотоавтотрофты өсімдіктер өсімдіктің 16
түрі үшін сипатталған. Қалған басқа өнімдер фотоавтотрофты өсімге
қабілетсіз, сондықтан қараңғы оның өсуі қабілетсіз.
Клетканың сәтті өсуіне аэрация маңызды болады. Аэрациялы
суспензиялы өнім болуы мүмкін емес. Клетка өніміне газ фазасы (оттегі,
азот, екіқышқылды көміртегі) компоненттерінің әсері зерттелмеген деуге
болады.
Қоректік орта мен клетка өсіруді құруда азықтық ортаға осмотикалық
құрылымның әсерін есепке алу керек. Жоғарғы осмотикалық қысым азықтық
ортаны игеруді қиындатады. Әсіресе бөлу және клетка қабырғаларынан
аластатылған протопластардың культивирлеуде ортада осмотикалық қасиетті
қолдау аса қажет.

Дәріс №9
Тақырып: Клетканы культивирлеу жүйесі
Жоспар
1. Ағынды емес культура
2. Ағынды культура
3. Көпқабатты және суспензиялық культура
Клеткаларды культивирлеудің 2 негізгі жүйесі бар.
1. Ағынды емес культура – ортаға клеткалар фиксирленген көлем кіргізетін
культураның түрі. Клеткалардың өсуімен қоректік орта клеткалық
метаболизм өзгерісіне әкеп соғатын, физиологиялық дифференциялау болып
табылатын жүйемен ауысуы керек. Уақыт өте келе ортаның жүдеуіне
байланысты клетка пролиферациясының қысқаруы пайда болады.
Ағынды емес культураның өмірін жалғастыруды біренше әдіспен
ұлғайтуға болады:
- үздіксіз (культура бөлігі жаңа ортаның тең бөлігімен ауысады)
- тұрақты (культура көлемі тұрақты төмен жылдамдықпен көбейеді, ал
клетканың аздаған бөлігікезеңмен жойылады)
- перфузионды (жаңа ортаның үнемі түсуі асырылады, және қолданылған
ортаның тең бөлігі бір уақытта жойылады.
Перфузияның ашық болуы мүмкін, жоғалған орта қосымша орта арқылы
өткенде рН қайтадан құрылғанда, аэрирлену жүзеге асырылады және
культуральды сосудқа қайта оралады.
Ағынды емес культураның барлық жүйесі қандай да бір пішінде
қалдықтардың жиналуымен сыртқы жағдайлардың тұрақсыздығымен сипатталады.
2. Ағынды культура қоректік заттар мен метаболиттер
концентрациясының, сондай-ақ клетканың санының өзгермейтіншынайы
гомеостатикалық шартын қамтамасыз етеді. культураға ортаның тұрақты кіруін,
клеткамен бірге ортаның кең көлемін бір уақытта жойылуын қамтиды. Бұндай
жүйелер суспензиялық культура мен мен көпқабатты микротасымалдаушы
культурада пайдалы.
3. Жануар клеткаларын культивирлеуде 2 ірі бағыт бар: моноқабатты
культура, суспензиялы культура.
Суспензиялы культура клетка шығымын ұлғайту үшін тиімдірек.
Моноқабатты культуралар да бірқатар артықшылықтарға ие болады:
1. Ортаны толық алмастыру жеңіл болады және жаңа қоректік ортаны қосу
алдында клетканы жуу оңай болады. Бұл клетка өсуі бір жағдайда
жүргенде, өнімнің істеген жұмысы басқа жағдайда жүргенде, мысалы:
сарысулы ортадан сарысусыз ортаға клетканы көшіргенде маңызды
болады. Сонымен қатар қажет емес компоненттерді толықтай жоюға
болады.
2. Клетканың жоғарғы тығыздығын қамтамасыз етеді
3. Көп клеткаларда егер клеткалар субсьратқа бекітілсе қажет етілетін
өнімнің экспрессиясы тиімді жүреді.
4. Моноқабатты культура клетканың әрбір түріне зерттеудің неғұрлым
жоғарғы икемділігін қамтамасыз ету үшін қолданылуы мүмкін.
5. Кей жағдайларда, мысалы вирус жойылуы үшін тығыз клеткааралық
байланыстар қажет болады.
Көп қабатты культуралардың кемшіліктері мынадай:
- үлкен кеңістіктерді иалап етуі
- масштабты үлкейту барысында құны мен еңбек сиымдылығының өсуі
- сынақ алу қиындығын қамтитын тиімді бақылаудың жетімсіздігі
- рН анықтау мен бақылаудың күрделілігі, оттегінің концентрациясы
Тегіс флаконда (матрацта) культивирлеу
2. Уақыттың әрбір мезетінде бутылдың 1520% беткі қабаты қоректік ортамен
жабылғанда, ал клеткалар біресе ортада біресе ауада болғанда айналу
бутыліндегі культивирлеу.
3. Диаметрі 35 мм араласпайтын тығыз қапталған шыны моншақтар, пластин
стопкалары т.б. ретінде қызмет атқаратын микротасымалдау колонкасында
культивирлеу, ал қоректік орта оларды жоғарыдан төмен ағу арқылы
жуады.

Дәріс №10
Тақырып: Адам клеткалары культурасын пайдалану
Жоспар
1. Дәрігерлік-биологиялық зерттеуде адам клеткалары культураларын қолдану
2. фибробластар культурасы
1. Адамның барлық клеткалары культураға кіруі мүмкін, көптеген дәрігерлік –
биологиялық зерттеулер обьектісі мен құралы болуы мүмкін. Клеткалардың
культурадағы маңызды артықшылығы – микроскоптың көмегімен тіршілігін
бақылау мүмкіндігі. 1000 адамды сұрақты пайдаланы отырып түсінуді қажет
ететін эксперименттер, жабылған шынылардағы 100 культураға қойылған
статистикалық сенімділікпен тең болуы мүмкін.
Клетка культивирленуі арқасында зерттеу мүмкіндігі мен
диагностикасы шексіз кеңейеді, себебі бағалау мүмкіндігі морфологиялық және
биохимиялық өзгеріске ғана емес, клетка тәртібінің өзгерісінде, олардың
әртүрлі агентке реакциясында оның ішінде дәрілік әсер етуде де пайда
болады. Неғұрлым культурадағы клетка әртүрлі биохимиялық манипуляция үшін
жеңіл қол жетуге болса, онда олармен жұмыста берілген уақыт бойы
радиоактивті негізін салушылар, улар, гормондар және басқаагенттер берілген
концентрацияға кіруі мүмкін. Зерттелген қосылыстардың бауырға
метаболизмденуі қауіптілікті жояды, бұлшықеттермен қамданады немесе
бүйректе экскретирленеді. Ереже бойынша клеткалық культураларды қолданғанда
клеткамен зерттелетін заттардың байланыс уақытын қою, берілген уақыт кезеңі
барысында оның концентрациясының өзгерісін қою жеңіл болады. Бұл кіру
жылдамдығының нақтылығының маңызын, зерттелетін қосылыстар метаболизмін
алуды қамтамасыз етеді.
Клеткалық линияларды тестілеу үшін, дәрілік препараттар,
детергенттер, косметикалық өнімдер, инсектицидтер, консерванттар ретінде
қолданатын әр түрлі заттардың әрекет ету механизмін оқыту үшін қолданады.
Клеткалық культуралардан алынған қорытындылар бүкіл организмге
экстраполирлеуге болмайды, бірақ егер зерттелген заттар культивирлеген
клетканың бірнеше линияларында зақымдаушы әрекет жасаса, онда адам
ағзасында да жағымды тиімділікті күтуге болады.
Бұдан басқа, in vivo клеткасына жататын ұрпақтар қатарында ақау
жүзеге асатын болса, бұл ақау тұқым қуалаушылық ақау болып саналады. Гендік
инженерия мүмкіндігі арқасында клетка генотипінінөзгерісі шындыкка ие
болды. Біз ағзадан ақаулы генін алмастыратын мутантты клеткаларды бөле
аламыз, дені сау гендік модифицирленген клеткалар линиясын алып, ағзаға
қайтадан кіргізе аламыз.
2. Фибробластар культурасын алу кеңінен жайылды.Патогенез бен
тұқымқуалаушылық аурулары диагностикасын оқыту ушін фибробластардың кеңінен
қолданылуы оларды культивирлеудің тек қана жеңілдігін қамтып, бірақ сонымен
бірге негізгі клеткалық элементтері фибробластар болып саналатын
біріктіретін тіндер дене массасын маңызды бәлігін құрайды. Бұдан басқа
фибробластар көптеген мүшелердің стромдарын құрайды,, олардың
морфогенездерінің маңызды қатысушылары болады және арнаулы клеткалардың
дифференцировкасы мен функционирленуі үшін қажет болатын микроқоршау шартын
құрады. Фибробласта моноаминоксидаза, яғни кейбір нервтік және психикалық
ауруларға белсенділігін өзгертетін ферменттері болады.Фибробластар
глюкокортикоид гормонына , инсулинге, кейбір нейромедиаторға рецептоады
құрайды.
Тринберг1978 жылы культивирленген фибробластан алынған in vivo
шартында экстраполяция жағдайы дәлелдеуге мүмкіндік алды.
1. Біріншіден, in vitro фибробластары ағзадағы клеткаларға қатысты
негізгі жағдайларды сақтайды, сонымен қатар онтогенетикалық және
ағзадонордың жеке генотипті қасиетін сақтайды.
2. Екіншіден, ағза клеткалары қасиеттерін толық мөлшерде
насихаттайтын басқа да осындай клеткалар типі болмайды.
3. Үшіншіден, культураға фибробластар енгізу арқылы өзгерістер
туындағанда жеңіл бақылауға, қалыпты жағдай құруда минимумға кіруге болады.

Жоғарыда аталғандар фибробластарды қолдану аурулар қатарының
патогендерінің клеткалық, биохимиялық, молекулярлық аспектісін, оның ішінде
нерв жүйесінің тұқымқуалаушылық ақаулармен байланысты аспектісін оқытуды,
қолдануды қамтамасыз етеді.
Болжамдар бойынша ХІХ ғ басында көпядролы клеткалардың ашылуына
байланысты соматикалық клеткалар бір-бірімен ағып келіп қосылуы мүмкін
екендігі дәлелденген. Тарихи аспектіде поликариондардың ашылуы Шлейденнің
қате ұсынысы ретінде жаңа клеткалар аналық клеткалардың цитоплазмалық
мембраналарының ішінде көпіршік түрінде дамиды деп саналған. Рудольф Вирхов
1851ж бұл ұғымды ядро жаңа клеткаларда эндогендң тұқымдандыруды болдырады
деп санап көп ядролы ісік клеткаларының суретін толық сеніммен ұсынады.
Бұдан басқа поликарионның ашылуы клеткаларының теория күресіне отқа май
құйғандай етті. Оның қарсыластары организмді үздіксіз цитоплазмамен
біртұтастың массасын ұсынатын гипотеза ретінде алға қойды, ал
поликариондардың бар болуы бұл гипотезаның бекітпесі ретінде қаралды.
Уақыт өте келе клеткалық теория салтанат құрылды. Ал
поликариондарды қызық тұжырымдар разрядына жатқызды.
Соматикалық клеткалардың гибридтері біздің жүз жылдығымыздың 60-шы
жылдарында ғана ашылды. 1960ж Барский әріптестерімен гибрид клеткаларының
бөлінуін хабарлады. Гибридтік клеткалар тышқан саркомасының бір клеткасынан
ертеде бөлінген екі линиясын араластыру арқылы алынды. Шығарылған линиялар
саны бойынша хромосома морфологиясы бойынша сонымен қатар тышқандарға
енгізген ісіктің пайда болу қабілеті бойынша ерекшелінеді. Гибридтік
клеткалар шығарылғын клеткалар линиясына өте жақсы хромосомдар санын құрды.
сонымен қатар барлық аналық линиялардың беткі антигендері құрды, одан әрі
қарай гибридтік клеткаларды жануарлардың әртүрлі клеткаларын қолдана
отырып, алуға болатынын жасайды. Агент ретінде НVJ инактивирленген вирусы
(сондай вирусы деп аталады) көрсетіледі. Содан бері сондай вирусты
клеткалар құйылуы экспериментінде кеңінен қолданыла бастады.
Пролиферацияға қабілетті түраралық гибридтік клеткаларды оқытуды
екі өте маңызды байқаулар жасалды:
- гибридте екі геном да байқалуы мүмкін
- ұзақ өмір сүретін түраралық гибридтер біртүрлі хромосомдар
элиминирленген
Клеткалардың құйылуы бірнәрсемен стимульденуі міндетті емес. Осыған
қарамастан осы атаудағы барлық құрылымдарды спонтанды деп атауғу болады.
Олардың кейбіреуі онтогенез процесінен шығады. Осы уақытқа дейін биологияда
клетка ішінде жатқан мамбраналар жиі құйылып, ал клеткаларды шекаралайтын
клеткалар сирек. Құйылатыны қиын жұмбақ ретінде шешілмейтін күйі қалады.
Мысалы: Гольджи аппаратының көпіршіктері бір-бірімен өсімдік цитокинезде
клеткалық пластикалар түзе отырып, эндоплазматикалық ретикулум мембраналары
жаңадан синтезделген белоктарды тасығанда Гольджи аппараты элементтерімен
құйылады.
Дәл осы уақытта қалыпты клеткалар табиғи жағдайды бір-бірімен сирек
құйылысады. Жоққа шығаруды тұқымдану жағадйы құрайды. Бұдан басқа жұқа
шығарудың осы түрі ретінде жоғарғы саңырауқұлақтардың плазмогамии жағдайы
көрсетеді, бір ядролы гаплоидты клеткалар құйылып екі ядроларды түзеді
(дикариондар). Бұндай клеткалар митотокикалық жағдайда көбейеді екі
ядролықта қалады, қорытындысына барлығына жақсы белгілі тұқымдық дене
құралады.
Табиғи жағдайда клеткалар құрылым сүтқоректілерде болады. Мысалы:
клеткалар тышқан түтікшелерінің құру арқылы құйылуы мүмкін. ХІХ ғ ала
тышқандардың миофибрильдері поликарионда түзілетіні көрсетіледі.
Поликарионда бір ядролы миобластардың құрылуы ісік клеткаларының құйылымы
әдеттегі құбылыс. in vivo ісік клеткалары кей жағдайда жай клеткалармен
де қиылысады.

Дәріс №11
Тақырып: Химер құру әдісі
Жоспар
1. Агрегациялық әдіс
2. Инфекциялық әдіс
1. Агрегациялық әдіс. Тарковскиймен бір уақытта бір-біріне қатыссыз
Варшавада және Филадельфиядағы Минцте (1961-1962ж) ұсынылды.
Буаз ұрғашы- докторлардың жатырынан 8-ші бластомер кезңіне
жеткен ұрықтарды бөліп алады. Екі жануардан алынған әртүрлі генотиптермен
алынған бластомерлерді. Мысалы: жүні қарала тышқандардан олардың
агрегациясы мен 16-шы клеткалы ұрықтың пайда қабілетін жасау жағдайына
орналастырады.
Бұндай құрамды ұрықтар in vitro бластоцистер кезеңіне
дейін дамиды, содан кейін оларды қабылданған ананың жатырына енгізеді, онда
сәйкес гормондарды енгізу арқылы алдын-ала жалған буаздықты шақырады.
Қорытындысында аллофенді тышқанадр пайда болады. Тышқанда жүн пайда
болғанда, оның түсі ата-анасыныкіндей ақ немесе қара емес аралас болады,
қара мен ақ дақтар сызықтар алмасып келеді. Бұл жануарлар Химер тіні
мозаикалы яғни ақ және қара клеткалардан тұрады. мұндай жануарладың тіндер
мозайкалы. айырмашылық ферментативтік фукнция атақаратын блогтарға ғана
қатысты: олар тышқанның ата-анасының бір және де басқа да реакцияларын
катализдейді, бір және басқа кофакторда қажет етеді, бірақ бұл жағжайда
идентикалық емес болу керек. Бұл белок изофермент деп ааталады және оны
электрофорездің көмегімен бөлуге болады. Агрегациялы химерлерді екі эмбрион
аралығында ғана емес изомирленген бластомерлер немесе эмбриондардың
жекелеген бөлшектерімен алуға болады. Химерлік эмбриондар массасы
әдеттегіден үлкен емес және эмбриональды регуляция механизмдері
әркетткрімен бекітілген әдістің артықшылығ микрохирургиялық техниканың
араласуын қажет етпейді, өйткені эмбриогенетикада кеңінен қолданылады.
2. Инфекциялық – 1968ж Р. гарднермен жасалынды. Эмбриондар
бластоциттер кезеңінде қолданылады. Бластоцистерді фиксирлейді және
микроманипуляторда қоддан отырып бластомақсат эмбрион- реципиентке
бластоцистер доноры клеткаішілік клетка массаларын иньекция арқылы
енгізеді. Бұл әдіспен тек ерте эмбриондарының ішкі клеткалық массасын
иньекцирлеуге болады, бірақ көптеген дифференцирленген клеткаларда.
Тышқан мен көртышқан арасындағы түраралық химерлік ұрықтар
агрегация жолымен тек 70-ші жылдары ғана алынды. Алғашқы химерлік жануарлар
Р. Гарднер мен М. джонсонмен тек 1976ж ғана алынды. Бұл эксперименттер
жетістігі80-ші жылдары химерлік ауылшаруашылық жануарларын құруға кірісуге
қол жеткізді. 1984 ж қой мен ешкінің түраралық химерлі – қойешкі алынды.
Бұлар Англия мен ФРГ-де бірге тәжірибеленді.
Химерлік өсімдіктер де жиі кездеседі, олар фенотипикалықпен
көрінбей, жабық түрде болады. Дегенмен пластидтік мутациялар оны өсімдікте
көруге мүмкіндік береді.

Дәріс №12
Тақырып: Моноклональды антидене
Жоспар
1. Антидененің функциональды құрылымы
2. Антидене алу
1. Клеткалар қосылысы антиденені продуцирлейтін гибридтер клеткасын алу
негізінде жатады. Антидене – организмге бөгде заттар түскенде қорғану
реакциясын жасайтын ағзада синтезделетін, қан сарысуының ақуызы.
Иммундық жүйе көптеген ауқымды антигендерге спецификалық антиденелер
өндіреді. Иммуноглобулинмен антидене қанның маңызды белоктық компоненті
– салмақ бойынша 20%плазма белогын құрйды.
Антиген ретінде әртүрлі заттар қызмет атқарады: микроорганизмдер
клеткасы, вирустар, белоктар, нуклеин қышқылдары кейбір жағдайда
антибиотиктер мен пестицидтер типінің төмен молекулярлы заттар. Антидене
барлық белок молекулалары немесе бактериалды клеткаларға қарсы емес болып
түзіледі, ал тек аздаған участокқа антиген детерминант деген атаумен пайда
болады. Антидененің жай молекулалары Ү әріпті пішінді болып, екі
идентикалық антиген байланыс аумағын қамтиды, екі бұтақты болады. Антидене
әрекетінің қорғану механизмі антигенді детерминант байланысына неізделген.
Неғұрлы екі аумақ болса олар антигендер түзе алады.
Егер антиген молекуласы 3 немесе антиген детерминантының көптеген
санын иеленсе, антидене олармен кеңейтілген торап түзуі мүмкін. Белгілі
мөлшерде игеріле отырып, бұл торап ерітіндіден тұнбаға түседі.
Үлкен иммундық кешен тенденциясы антидене мен антиген шығару үшін
тұндыруға бейім. Мұндай кешендердің пайда болуы молекулалардың
аглютинациясына әкелуі мүмкін. Бұл құбылыста қан тобына анықтак негізінде
эритроциттер антиденемен жабысады, сөйтіп гемоглютинация реакциясы жүреді.
Антидене молекуласы 4 полипептидті шынжырдан құрылған. Оның екеуі
идентикалық жеңіл. Ал екеуі ауыр. Барлық 4 шынжыр ковалентсіз және
ковалентті байланысады. Антиген – байланыс реакциясының тиімділігі икемді
шарнирлі антидене аймағының арқасында екі антиген-байланыс
аймағыныңарақашықтыығ өзгерісін жасайды. Шарнирлі аймақ Н сызығында жатады.
Н олигосахриттік шынжырының функциясы түсініксіз «құйрықты» молекулалар
аумағын құрайды. L сияқты сияқты Н шынжыр қайталанған сигменттерден
домендерден құралған. Бұлардың әрқайсысы функциональды компактілі бірліктер
құрап тәуелсіз айналады.
2. Антидененің құрылымы. Иммунды жауап – арнаулы гормондардың
қатысымен лимфоидтық клеткаларының әрбір типінің клеткааралық өзара
әрекеттесуінің күрделі прцесі, осының нәтижесінде В- лимфоциттері белсенді
синтезделе бастайды және қанға берілген антигенге қарсы арнайы антидене
бөледі. В- лимфоциттер бетінде рецепторлар анологиялық антиденеге күрделі
клеткааралық комплексте биосинтез антиденесінің басталуының стимулы ретінде
қызмет атқарады. Антиденені адам қажеті жануарлардың иммунизациясынан
алады. Бірнеше антинген иньекциясынан соң иммунды жауап стимуляторы
көмегімен қан сарысуында спецификалық антидене шоғырланады. Антидене
сарысудан глобулинді фракция түрінде аммоний сульфатымен, спиртпен т.б.
заттармен тұндыра отырып бөледі. Алынған антидене көп белоктар қоспасын
құрайды. Жоғары тазаланған антидене ион алмасу хромоьтография көмегімен
бөлінеді.
Стандартты құралдарды өте күрделі жағдайда алады, себебі оның құрамы
жануардың түріне, жеке ерекшеліктеріне, иммунизация цикліне т.б.
факторларға байланысты. Бұл жағдай антидене пайдаланатын «антиген-антидене»
принципімен арнайы өзара әрекеттесіп, имуннохимиялық әдісті қодану арқылы
жүргізіледі.
Антидененің анықталған түрлерін синтездейтін гибридомдар селективті
өсу ортасында теріліп алынады. Сосын оларды көбейетін және көптуыстық
клеткалар түзетін культуральды сұйықпен араластырады (клон). Ьұндай клондар
көп клонды деген атпен МКА антиденесін синтездейді.

Дәріс№13
Тақырып: Жануарларды клонирлеу
Жоспар
1. Клонирлеу тарихы
1. Барлық жануарлардың тірі ағзалары бірдей генетикалық ақпарат береді.
алайда морфогенез үрдісінде соматикалық жасушалар дифференцияланады,
нәтижесінде геномдардың бөлігі репрессияға ұшырайды. Клеткалардың
специялизациясының деңгейі неғұрлым жоғары болса, олардың
тотипотенттігі төмендей береді, бұл заңдылық ядроны ауыстыру
экспериментінде қолданылды. 1952ж Американдық ізденушілер Р. Бригспен
Т. Кинг бірінші болып соматикалық ұрық клеткасын бақаның энуклерлік
клеткасына трансплантация жасау арқылы ойлап атпты. Ғалымдар
микропипетканы қолдана отырып бақаның жұмыртқа клеткасынан ядроны
жойып, оның орнына эмбриондардың ядро клеткасын қайта отырғызды.
Алғашқы ұрық ядросы кеш даму сатысының бластулалары мен алғашқы
гаструлдарының тотипотенттілігін иеленеді және ұрықтардың қалыпты
дамуын қамтиды. Бластула ядрода 80% болады да, ұрық ары қарай сәтті
жетіледі. Ұрықтың келесі даму сатысы гаструла деп аталады. Көптеген
дифференциалданған жасушалардың ядросын ауыстырып салғанда жай немесе
кеш гаструлдар ұрықтарында жетілмеушіліктер немесе жүйке жүйесінің
болмау анықталады. 1962ж ағылшын биологы Дж. Гордон бірінші
тәжірибесімен оңтүстік африкалық базада бақаның ядро доноры ретінде
ұрықтанбаған клеткаларын қолданып, одан жүзіп жүрген итбалықтардың
маманданған ішек эпителий клеткаларын қолданған. Ядроның жұмырқа
клеткасының реципиентін хирургиялық жолмен алмай, ультракүлгін сәулемен
жойды. Көптеген жағдайда, қайта құрылған жұмыртқа клеткалары дамымай
қалды, ал қалған 10-нан бір бөлігі эмбриондар ұрығын құрды. Осындағы
6,5% эмбриондар бластула сатысына жетті, 2,5%-і итбалық сатысында және
тек 1%-ті жыныстың дму барысында жетілді. Алайда, бірнеше ересек
особьтардың пайда болуы, жасушаның арасындағы эпителий ішектерінің
дамуыитбалыққа ұзақ уақыт барысында қатысқан бірінші жыныстық
клеткалармен, ядролар ауыстыру кезінде қолданылуы мүмкін.
Кейіннен Гордон экспериментті модифицирледі. Болжағандай көптеген
қайта құрылған жұмыртқа клеткалары гаструлдар стадиясы аяқталғанша өле
бастады. 1970ж Гордон in vitro жағдайда қоректік ортада бүйрек, тері өкпе
клеткасын культивирлей бастады. Бұл клеткалар ядро доноры ретінде қолданыла
бастады.
Өз кезегінде Берардино және Хофнер трансплантация үшін бөлінбейтін ядро
және басқа эритроциттері дифференцияланған қан клеткалары толықтай
қоладнылды. М. Бернардино мен Н. Хоффнер жұмыстары амфибияның ооциттері
цитоплазмасы дифференцирленген соматикалық клеткалардың жаңартылған
тотипотенциялдығы факторларын құрайтынын көрсетті. Бұл факторлар геномының
репрессирленген ауданын реактивирленеді.
1985ж балық сүйегін клонирлеу технологиясысипатталды, оны совет
ғалымдары Л.А. Слепцова, Н.В. Дабагян және К.Б. Газарян жасады.
Сүт қоректілердің ядросын қайталап отырғызу 80-ші жылдары кеш
басталды. Бұл техниканың себептерімен болды.
Эмбриондарды клонирлеуде алғашқы маңызды жетістіктер тышқанда емес
сүт қоректілердің басқа түрлерінде жүзеге асырылды.

Дәріс№14
Тақырып: Вакцина және басқа иммунопрофилактикалық және диагностикалық
құралдар алу үшін жануарлар клеткалары культуралары
Жоспар
1. Медицинада трансгенді жануарларды қолдану -биологиялық белменді
қосылыстарды алу
2. Инсулин алу
3. Соматотропин синтез
4. Интерферондар алу
1. Медицинада трансгенді жануарларды қолдану стратегиясының маңызды
бір тапсырмасы – ағза клеткаларына жаңа белоктар синтезін шақыратын гендер
енгізу арқылы биологиялықбелменді қосылыстар алу болып табылады. Трансгенді
жануарлар бағалы биологиялық белсенді белоктар мен гормондар продуценті
сияқты, микроағзалар мен клеткалық системелер алдында бірқатар
артықшылықтарға ие. Трансгенді жануарлар линиясында алынған жаңа белоктар
модифицирленуі мүмкін, олардың белсенділігі протеиннің белсенділігімен тең.

2. Инсулин – көміртегі алмасуын реттейтін және қандағы қант
деңгейінің қалыптылығын қолдайтын ұйқы безі гормоны. Ағзада бұл гормонның
жетіспешілігі аса ауыр дерттердің бірі- қан тамыры ауруларымен қатерлі
ісіктерден кейін үшінші орында тұрған қант диабетіне алып келеді. инсулин –
кішігірім глобулярлы ақуыз, бір-бірімен екі дисульфидті көпір арқылы
байланысатын, екі полипептидтік шынжырдан тұратын, 51 аминқышқылды
қалдықтарды құрады. 100гр кристалдық инсулинді алу үшін 800-1000кг шикізат
қажет.
3. Соматотропин (адам өсуінің ГРЧ гормоны) гипофиздің алдыңғы
бөлігімен синтезделеді. Алғаш рет 1963ж гипофизден бөлініп, тазаланды. Оның
жетіспеушілігі гипофизарлы карликтік дертіне алып келеді. Өдетте оны
мәйіттің гипофизінен алады. Мәйіттен алынған материалдар бірнеше формалар
қоспасынан тұрады.
4. Интерферондар 1957ж Лондонда Ұлттық зерттеулері институтында вирус
инфекциясына төзімділік факторы ретінде ашылды. Вирустың әрекетіне
қозғалаған жануарлар клеткалары ортаға, жаңа клеткаға, вирус инфекциясына
төзімділік беруге қабілетті. Интерферон клеткада вирустың көбеюінің алдын
алады. Итерферонның 3 тобы белгілі: α- интерферондары, лейкоциттерге вирус
әрекетінен түзіледі; β- интерфероны, фибробластқа вирус әрекетінен пайда
болды; γ- интерфероны, Т- лимфоциттеріменбактериалды және вирустық
антигендермен немесе сарысуға қарсы лимфоциттердің үстіңгі детерминациясына
жауап ретінде; Интерферондар – 146-166 амиқышқылдадар қалдығынан шыққан
төмен молекулярлы ақуыздар. Емдеуге жататын интерферонның арнайы түрін
ескере отырып адам клеткаларынан алынған осындай препараттар қажет. Дағды
бойынша оларды адам қанынан (1литр қаннан 1доза) 1мкг интерферон алуға
болады. Әлемде өндіріс Финляндияда кейіннен Францияда жүзеге асты.

Дәріс
Тақырып: Эукариоттық жүйелерде клеткалық биотехнологияны қолдану
Жоспар
1. Иммобильдеу
2. Иммобильдеу әдістері
3. Иммобильденген клеткалардың артықшылығы
1. Ылғалды ортада өсетін клеткаларға қарағанда каллусты культуралар
беттік культивирлеу кезінде екіншілік метаболиттерді көбірек жинайды. Тез
өсуші және борпылдақ культураларға қарағанда агар ортадағы культуралар
алкалоидтарды көп жинайды, қалыпты метаболизмге қандай да бір кеңдік ұйым
қажет. Организмдегі клетка жағдайы дифференциациясының типін және сатысын
анықтайтын фактордың бір түрі болып табылады. Агрегат ретінде бір – бірінен
жекешеленген өсуші клеткалардың әртүрлі метаболизм жолдары мен әртүрлі орта
шарттары бар. Клетка немесе клетка тобы ұйымдық деңгейі бүтін бір өсімдікке
жақынырақ болған сайын, бүтін бір ағзаға тән метаболиттік жолдар болуы
әбден мүмкін.
Заттарды иммобилизациялау әдістерінің пайда болуы және жетілдірілуі
арқасында жасалуы мүмкін болған «контейнер» типті ферменттік препараттар
медицинадағы жаңа бағыт болып табылады. .
Иммобилденген протеиназалар операцияға дайындық кезінде және
пластикалық операцияда ерекше тиімді. Иммобилденген протеолиттік ферменттер
өкпе мен плевраның іріңді ауруларын емдеуде үлкен табыспен қолданылады.
2. Иммобилдеу әдістері. Иммобилдеу дегеніміз – молекуланың қозғалысын
тұрақтап бекіту. Сол кезде болаын конфораиялық қайта құру физикалық,
химиялық принциптерге негізделе отырып, молекулалардың белсенді ортасын
сақтай отыра бекітіледі.
Иммобилдеу процессінде биологиялық системаларды 2 принципке негізделе
отыра синтезделеді:
1. Биологилық обьектімен тасымалдаушының арасында ковалентті
байланыстардың болмауы керек, бұл физикалық әдіс.
2. Биологиялық оьектімен тасымалдаушының арасында ковалентті байланыстың
байқалуы бұл химиялық байланыс.
Екі әдісте әртүрлі тәсілдермен жүзеге асады.
Иммобилдеудің физикалық әдісі: биологиялық системаны ерімейтін
таымалдаушының үстіне адсорбтау (қандыру) және жартылай енгізгіш заттардың
ішіне енгізу арқылы жүзеге асады.
Ерімейтін тасымалдаушыларға адсорбтау (қандыру). Бұл әдісте молекула
электростатикалық әсерге, гидрофобтық қасиетке, дисперсиялық қарым –
қатынасқа және сулы байланыстарға негізделіп, тасымалдаушының бетіне
абсорбтанады.
Гельдің ішіне енгізу арқылы иммобилдеу. Бұл әдіс бойынша иммобилдеу
келесі әдістермен жүзеге асады.
1. Молекуланың мономері судың ерітіндісіне салады, содан кейін
полимерлейді.
2. Екінші тәсілде молекуланы дайын полимер ерітіндісіне салынады содан
екйін ол гельді қатырады.
Жартылай енгізгіш структуруларды иммобилдеу жартылай енгізгіш қасиеті бар
мемрананың көмегімен молекуланың сулы ерітіндісін субстраттын сулы
ерітіндісінен айыру. Ең кеңінен таралған әдіс ол молекулаларды және
микрокапсулаларды рибосомаларға енгізу.
Иммобилденген клеткаларды алу. Клеткаларды иммобилдеу техниканы жеңілдетті:
1. Тұтас клетканы қолданған, олардың құрамындағы ферменттерді бөліп
және тазалап керек жоқ.
2. Клеткалар 1, 2 тағы да көп стылы процесстерді жүргізуге мүмкіндік
береді.
Өндірісік жағдайлары жиі өлтіріліп, иммобильденген клеткаларды
қолданады.
Өлген клеткалар, тек бір сатылы процестерге жарамдв, мұндай клеткалар
инкапсуланған ферменттерге өте ұқсас болып келеді.
Тірі клеткалар жоғарыда қөрсетілген клеткаларға қарағанда перспективті
болып саналады. Бірақ тірі клеткалар өте көп жағдайды талап етеді. Сонымен
қатар популяциядан популяция аралығындағы клетканың қасиеті көп емес.
Көптеген өнімдер өсіп жатқан клеткалардан түзілмейді. Олардың синтезі тек,
клетка стационары фазада болғанда байқалады. Сондықтан осы фазада
иммобилдейді.
Иммобилденген клеткалардың органеллалары. Бөлініп алынған клеткалық
органеллалар:
1. Хлоропластар
2. Митохондриялар
3. Микросомалар
4. Лизосомалар
Олардың барлығы биотехнология обьектілеріне жатады. Бөлініп алынған
органеллалардың клеткалардан айырмашылығ олар өспейді және бөлінбейді.
Қатарлас иммобилдеу ол әртүрлі биокатализдерді біріктіріп 2 немесе
бірнеше ферменттер (әртүрлі клеткалар, ферменттермен клеткалардың
комбинациясы) иммобилдеу. Әсіресе ферменттер мен клеткаларды қатар
иммобилдеуге қатар көңіл аударады.
1. Клеткада ферментке тән катализік қасиет бар, екеуін қатар иммобилдеу
арқылы реакцияны шапщаңдатады және катализдік белсенділікті
тұрақтатады (стабилизация).
2. Клетка мен фермент әртүрлі реакцияларды катализдейтіндіктен, субстрат
бірнеше сатылы тұтас өнімге айналады.
Иммобилденген клеткаларды тәжірибеде қолдану. Иммобилденген клеткалар
келесі биотехнологиялық процесстерде қолданылады.
• Saccharomyces cerevisiae, Zimomonas mobilis - клетканы
целлюбиозды этанолға дейін ыдырату үшін;
• Saccharomyces cerevisiae, Zimomonas mobilis - клеткасы лактозаны
этанолға дейін ыдыратуға;
• Saccharomyces cerevisiae – құрамында аз мөлшерде белоктар бар
шараптар алу үшін;
• Saccharomyces cerevisiae – глюкозаның глюкон қышқылына айналуы
және тағы басқалар.

Иммобилденген клеткалардың өндірісте қолданылуы.
• фруктоза немесе глюкоза қышқылын алады;
• L – және D – изомерлерден L – амин қышқылдарын алады;
• L – аспарагин қышқылынан аммония фумаратын алу;
• Жартылай синтетикалық пенициллинің негізі, табиғи
бензилпенициллинмен 6 – аминді пеницилинді қышқылды алу;
• Лактозасыз сүтті алу үшін;
• Алма қышқылының биосинтезін өткізу үшін;
• Преднизолонға гидрокортизонды тасымалдау (трансорбтау) үшін.
Дифференсациялауға әкелетін клетканы иммобилдеу екіншілік заттардың
шығуын көбейтуді жасайтын шарттарды қамтамасыз етеді. Иммобилдеу әдісі бір
– бірімен тығыз физикалық қатыспен клетканың өсуіне жағдай жасайды.
Клеткалар бір – бірімен қатысқан уақытта олардың салмағында белгілі бір
метаболизммен дифференсация жағдайын реттейтін химиялық және физикалық
градиенттер тағайындайды. Бұл өсуді азықтық заттарды ауаны көмірқышқыл
реттейтін градиенттер.
Клеткалар төрт жағдаймен иммобилденеді:
1. Инерттік субстратты иммобилденуі яғни әртүрлі цементтелген орталардан
бірінші клеткалық шылануы (аргинат, агар, полиакриламид, коллаген және
гльдердің комбинациясы);
2. Инертті субстратта клетканың абсорбциясы;
3. Инертті субстратта биологиялық макромолекуланың көмегімен клетканың
абсорбциясы;
4. Карбоксилметилцеллюлоза тәрізді кейбір инертті субстратты клеткалармен
коваленттік байланысы;
Алғашқы екі жағдай жиі қолданылады. Иммобилденген клеткаларды синтездеуге
ғана емес, әртүрлі қосылыстарды биотрансформациялауға да
қолданылады.Иммобилденген клеткаларды синтездеуге ғана емес Алғашқы екі
жағдай жиі қолданылады, әртүрлі қосылыстарды биотрансформациялауға иә
қолданылады . Иммобилденген клеткалардың суспензиялық культуралармен
салыстырғанда артықшылықтары:
1. ортадан өнімді алу және биореакторда клетканы сақтау арқылы
биомассаны көп рет қолдану;
2. Ортадан клеткаларды физикалық алу;
3. Кішкене көлемді тамырларда биомассаның көп мөлшерін
культивирлеу;
4. Культивирлеу ұзақтығы;
5. Заттарды эффективті биотрансформациялау.

Пәндер

Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.

Ақпарат

Қосымша

Email: info@stud.kz

Іздеу
Файл қосу
Презентациялар
Тегін
Кабинет
Баланс
Таңдаулы жұмыстар
Cатып алған жұмыстарыңыз
Менің файлдарым
Презентацияларым
Сатылым статистикасы