Файл қосу
Әртүрлі өсімдіктер
ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ БІЛІМ ЖӘНЕ ҒЫЛЫМ МИНИСТРЛІГІ
ШӘКӘРІМ атындағы СемЕЙ МЕМЛЕКЕТТІК УНИВЕРСИТЕТІ
3 деңгейлі СМК құжаты
ПОӘК
ПОӘК 042-18-35.1. ______
/02-2013
ПОӘК
Мұғалімдерге арналған пәннің бағдарламасы
<<Өсімдіктер физиологиясы>>
№ 2 басылым
10.01.2013 ж.
ПӘННІҢ ОҚУ-ӘДІСТЕМЕЛІК КЕШЕНІ
Өсімдіктер физиологиясы
<<5В011300>> - <<Биология>> мамандығы үшін
МҰҒАЛІМДЕРГЕ АРНАЛҒАН ПӘННІҢ БАҒДАРЛАМАСЫ
Семей
2014 ж
МАЗМҰНЫ:
* Қолдану саласы
* Нормативті сілтемелер
* Жалпы ережелер
* Пән мазмұны, пәннің модульдік бөлінуі
* СӨЖ тақырыптары мен мазмұны
* Пәнді оқу бойынша әдістемелік ұсыныстар
* Оқу - әдістемелік әдебиеттер тізімінің қамту кестесі
* Глоссарий
* Әдебиет және қорлар
1. ҚОЛДАНУ САЛАСЫ
<<Өсімдіктер физиологиясы>> пәнінің оқу-әдістемелік кешені <<5В011300>> - <<Биология>> мамандығының студенттеріне арналған. ПОӘК студенттерді курс мазмұнымен, өзектілігімен, қажеттілігімен, саясатымен және студенттің оқу үдерісінде қандай дағдылар мен іскерлікті үйренетінімен таныстырады.
2. НОРМАТИВТІ СІЛТЕМЕЛЕР
Осы <<Өсімдіктер физиологиясы>> пәнінің оқу-әдістемелік кешені (ПОӘК) берілген пән бойынша ұйымдастыру ретін анықтайды және келесі құжаттардың талаптары мен ұсыныстарына сәйкес әзірленген:
<<5В011300>> - <<Биология>> мамандығының Мемлекеттік жалпыға бірдей міндетті білім стандарты ҚР МЖМБС 3.08.0ХХ-20__, ҚР Білім және ғылым министрлігінің 20__ жылғы <<__>> _________ №__ бұйрығымен бекітілген.
Шәкәрім атындағы СМУ <<Пәннің оқу-әдістемелік кешені туралы ережесі>>.
3. ЖАЛПЫ ЕРЕЖЕЛЕР
3.1 Пәннің қысқаша мазмұны:
Өсімдік клеткасы үш бөлімнен тұрады. Тірі клетканың ең негізгі құрам бөлігі - оның протопластысы. Ядросыз бұл бөлім цитоплазма деп те аталады. Протопласт тіршілікті қамтамасыз ететін маңызды, әрі күрделі көптеген физиологиялық процестер жүреді. Сондықтан да, протопласт тірі клетканың ұйымдасқан негізгі құрылымы ретінде қарастыру қажет.
Протопласт физикалық-химиялық жағынан алып қарағанда, ертіндіде макромолекулалық қасиеттері мен белгілері бар күрделі коллоидты жүйе. Протопластың (цитоплазманың) химиялық құрамы, оның мынандай қасиеттерін анықтайды: тұтқырлығын, коллоидтылығын, созылмалдылығын, серпімділігін, түсін және т.б.
Клетканың физиологиялық активтілігі, оның химиялық құрамына және жоғарыда көрсетілген физикалық қасиеттеріне тікелей байланысты. Протопластың физикалық-химиялық қасиетттерінің өзгеріске түсуі, клетка тіршілігін қамтамасыз ететін көптеген физиологиялық процестердің өзгеруін туғызады. Осыған байланысты протоплст қасиеттерін зерттеу, клетка дкеңгейінде тіршілікті қамтамасыз ететін әртүрлі құбылыстарды танып білуге, талдауға бағыт береді.
Өсімдіктер физиологиясының негізгі курсында, клетка физиологиясына қатысты көптеген лабороториялық зерттеу жұмыстары берілген. Осыған қарамастан, өсімдіктер физиологиясының арнаулы практикумында клетканың кейбір физикалық-химиялық қасиеттерін, жаңа әдіс-тәсілдерді қолдану арқылы, тағы да зерттеп білу артықшылық тудырмайды. Cондықтан, бұл тарауда протопласт тұтқырлығын, қозғалысын және протопластыны жеке бөліп алу арқылы, оның тіршілік ету қабілетін анықтау жұмыстары енгізіліп отыр.
3.2 Пәннің оқыту мақсаты: <<Биология>> мамандығында оқитын студенттер профессионалды жұмыс барысында көп нәрсені біліп, істей алу тиіс.
3.3 Пәнді оқытудың басты міндеттері:
- студенттерді нақты теориялармен таныстыру, олардың көптүрлілігін және шектеулілігін түсіну және оларды активті түрде теориялық және қолданбалы биологияның актуалды мәселелерін шешуде қолдану.
4. ПӘН МАЗМҰНЫ, ПӘННІҢ МОДУЛЬДІК БӨЛІНУІ
Зертханалық жұмыстарды орындаудадғы әдістемелік нұсқау
КЛЕТКА ФИЗИОЛОГИЯСЫ
Өсімдік клеткасы үш бөлімнен тұрады. Тірі клетканың ең негізгі құрам бөлігі - оның протопластысы. Ядросыз бұл бөлім цитоплазма деп те аталады. Протопласт тіршілікті қамтамасыз ететін маңызды, әрі күрделі көптеген физиологиялық процестер жүреді. Сондықтан да, протопласт тірі клетканың ұйымдасқан негізгі құрылымы ретінде қарастыру қажет.
Протопласт физикалық-химиялық жағынан алып қарағанда, ертіндіде макромолекулалық қасиеттері мен белгілері бар күрделі коллоидты жүйе. Протопластың (цитоплазманың) химиялық құрамы, оның мынандай қасиеттерін анықтайды: тұтқырлығын, коллоидтылығын, созылмалдылығын, серпімділігін, түсін және т.б.
Клетканың физиологиялық активтілігі, оның химиялық құрамына және жоғарыда көрсетілген физикалық қасиеттеріне тікелей байланысты. Протопластың физикалық-химиялық қасиетттерінің өзгеріске түсуі, клетка тіршілігін қамтамасыз ететін көптеген физиологиялық процестердің өзгеруін туғызады. Осыған байланысты протоплст қасиеттерін зерттеу, клетка дкеңгейінде тіршілікті қамтамасыз ететін әртүрлі құбылыстарды танып білуге, талдауға бағыт береді.
Өсімдіктер физиологиясының негізгі курсында, клетка физиологиясына қатысты көптеген лабороториялық зерттеу жұмыстары берілген. Осыған қарамастан, өсімдіктер физиологиясының арнаулы практикумында клетканың кейбір физикалық-химиялық қасиеттерін, жаңа әдіс-тәсілдерді қолдану арқылы, тағы да зерттеп білу артықшылық тудырмайды. Cондықтан, бұл тарауда протопласт тұтқырлығын, қозғалысын және протопластыны жеке бөліп алу арқылы, оның тіршілік ету қабілетін анықтау жұмыстары енгізіліп отыр.
2.1. Цитоплазма тұтқырлығын элодея жапырақтарында центрифугалау арқылы анықтау.
Плазмолизді тудыратын ертінділерде цитоплазм пішінінің өзгеруі және қабықтан ажырауы, оның тұтқырлық деңгейіне тікелей байланысты. Егер, протопласт тұтқырлығы төмен болса, протопласт дөңгелек пішінге айналып, осының нәтижесінде дөңес плазмолиз пайда болады.Жоғарғы тұтқырлықта цитоплазма беті, плазмолиз кезінде ойыс түрге айналады. Өте жоғарғы тұтқырлықта, цитоплазма "іркілдек" плазмолиз жүреді. Плазмолиз түрлеріне байланысты, цитоплазма тұтқырлығының үш деңгейін көруге болады: төменгі, ортаңғы, жоғарғы.
Құрал жабдықтар және реактивтер : Центрифуга,микроскоп, пинцет, заттық және жабындық шынылар, 1% хром қышқылы ,2-4% формалин, элодея өсімдігі.
Жұмыстың орындалуы: Элодея бұтағынан ( Elodea canadensis) бір-бірінен 4-5 см қашықтықта орналасқан 10 жапырақты алып, суы бар стаканға 15-20 минут салады. Осыдан кейін, центрифуганың әрбір шыны пробиркасына иненің көмегімен су тамшылары бар екі жапырақшаны орналастырады, жапырақшалардың ұшы жоғарғы бағытта болуы керек. Пробиркаларға су тамшыларын құя отырып, таразыда теңестереді. Жапырақ салынған бұл пробиркаларды центрифугаға орналастырып, 10 минут аралығында центрифугалайды. Бірінші жұп жапырақтарды 90 g жылдамдықта, екіншісін 350 g, үшіншісін 750 g центрифугалайды. Центрифугалағаннан кейін, жапырақтардың хромопласттары бұзылмас үшін, ине көмегімен оларды пробиркалардан алып, 1 % -хром қышқылынан және 2-4%- формалин ерітіндісінен тұратын, 5:2 қатынасындағы бекітуші (фиксациялайтын) ертіндіге ауыстырады. Содан кейін, қоспадан жапырақтар алынып, су тамшысы бар заттық шыныға салынады да, микроскоппен қарай отырып, олардағы протопласт тұтқырлығы анықталады. Бұл үшін, элодея бұтағының ұшы мен төменгі бөлігінде орналасқан жапырақ клеткаларындағы, хлоропласталарды ауытқу және араласу деңгейлерін салыстыра отырып, протопласт тұтқырлығын салыстырмалы түрде анықтайды Жапырақтың негізгі және төбе клеткаларындағы цитоплазманың құрылымдық тұтқырлығын Стокс формуласы бойынша есептейді:
∙ r 2 ∙ ( D - d) ∙ C∙ g
9 n
Мұндағы, r- ауытқыған дене радиусы; Д- ауытқыған дененің тығыздығы ( араласқан денелердің); d - сұйық тығыздығы; n- cұйық тұтқырлығы; v - ауытқу жылдамдығы ( араласқан) ; g- ауырлық күшінің күшеюі; c- центрифугалау арқылы анықталатын жылдамдық мөлшері.
Тәжірибе барысында, ауытқыған бөлшектердің мөлшері мен тығыздығы және сұйықтықтың тығыздығы мен тұтқырлығының өзгермейтінін былай өрнектей отырып:
2 ∙ r2 ( D-d) ∙ g
9 n
бұл тұрақтылықты k мәнімен белгілеп, Стокс формуласын қысқаша былай көрсетеміз.
V=k:: c
мұнда,V-цитоплазма тұтқырлығы, k- тұрақтылық , с- центрифуга жылдамдығы. Сонымен, бөлшектердің қозғалуы жылдамдыққа қатынасты , егер с=0 болса, онда бөлшектер қозғалмайды.Центрифуганың төменгі жылдамдығында бөлшектер араласпайды, жылдамдықтың артуына байланысты бөлшектердің ауытқуы және араласуы басталады.Тәжірибе нәтижесінде хлоропластардың ауытқуын және араласуын тудыратын центрифуга айналымының жылдамдық мәні анықталады. Жылдамдықты арттыру арқылы хлоропластардың әрі қарай араласу және ауытқу шамасын арттыруға болады.Мұндай жағдайда, егер цитоплазма тұтқырлығы төмен болса, хлоропластардың араласу және ауытқу шамалары артады, керісінше жоғарғы тұтқырлықта кемиді. Сонымен, центрифугалауда жылдамдықтың артуына байланысты бөлшектердің ауытқу дәрежесі цитоплазманың тұтқырлығын анықтайтын негізгі көрсеткіш болып есептеледі.
Тәжірибе нәтижесін көрсетуді, центрифуганың жылдамдық дәрежесіне қатынасты, цитоплазманың төменгі, жоғарғы және өте жоғарғы тұтқырлық шамаларын кесте түрінде қортындылайды.
Бұл қарапайым анықтау тәсілін, көптеген өсімдіктердің протопластысының құрылымдық тұтқырлықтарын анықтауда және
әр түрлі плазмолиз шақырушы ерітінділер мен факторлардың тұтқырлыққа тигізетін әсерін анықтауда кеңінен қолдануға болады.
2.2. Протопласт қозғалыстарын анықтау.
Клетка протопластысысында қалыпты жағдайда алғашқы (бірінші) қозғалыс байқалады. Әртүрлі ортаның әсерлерінен (жарық,температура,механикалық әсерлерден және т.б.) протопласт қозғалысының жылдамдығы өзгереді, яғни екінші қозғалыс түрі пайда болады. Протопласт қозғалыстары бағытына қарай бірнеше түрлерге бөлінеді: шеңберлі, толқынды, ретсіз және т.б.
Протопласт қозғалыстарының клетка тіршілігінде физиологиялық маңызы өте зор. Қозғалыс кезінде метаболизм өнімдері, клетканың бір бөлімінен екінші бөліміне тасымалданып, метаболизм қарқынына әсерін тигізеді. Сонымен қатар, заттарды эндо-экзоцитозды жолдармен сіңіру және бөлуде белгілі роль атқарады. Протопласт қозғалысы клетка қабығы мен вакуольдің пайда болуына және өзгеруіне әсер етеді.Мысалы, Гольджи аппараттарынан бөлінген дискретті мембраналы бөлшектер, протопласт қозғалыстарының ағыны мен клетка ішінде жылжып, орнын ауыстырып, плазмолемма мембранасына тірелген кезде, бөлшек ішіндегі көмірсулар қабыққа қарай құйылады да, қабықтың қалыңдауын туғызады.
Протопласт қозғалыстары клетка тіршілігінің қабілетін көрсететін сезімтал көрсеткіштердің бірі.
Протопласт қозғалыстарының қарқынын анықтайтын бірнеше тәсілдер бар, солардың ішінде хлоропластың белгілі бір уақыт аралығында, жылжу жылдамдығын салыстырмалы өлшеу арқылы анықтау тәсілі кеңінен қолданылуда.
Құрал жабдықтар және реактивтер: микроскоп, микрометрлі окуляр, секундомер, пробиркалар, заттық және жабынды шынылар, пипеткалар, 5 ∙10-3 М АТФ, 5∙10-4 М ДНФ (динитрофенол), 6 БАП (бензиламинопурин).
Жұмыстың орындалуы: Элодея бұтағының төбе бөлімінен бір жапырақты алып,оны зат шынысының үстінде бір тамшы суға орналастырып, бетін жабындық шынымен жабады. 10 минут өткеннен соң, яғни, цитоплазманың қалыпты қозғалысы тұрақталғаннан кейін препаратты микрометрлі окуляры бар микроскоп арқылы қарайды.Микрометрдің ондық бөлім бірлігіне сәйкес орналасқан 5 клетканы таңдап алып, олардың ішінде қозғалыстағы хлоропластарды табады.Секундомер арқылы хлоропластардың микрометрдегі екі нүкте аралығындағы жылжу уақытын өлшейді.Осындай тәсілмен 5 хлоропластың қозғалу жылдамдығын анықтап, олардың орташа мәнін мына формуламен табады.
M= a/n
Мұнда, М-қозғалыс жылдамдығы, а- уақыт өлшемдерінің қосындысы, n- өлшеу саны.
Микропрепараттың жабындық шынысының астындағы суды бір жағынан фильтр қағазымен сорып алып, екінші жағынан АТФ ертіндісін енгізіп, 10 минут өткеннен соң жоғарыда көрсетілген тәсіл бойынша, протопластың қозғалу жылдамдығын анықтайды.
Осындай тәжірибелерді,4-динитрофенол (ДНФ), 6-бензиламинпурин (БАП) ертінділерімен әсер ету арқылы да қоюға болады. Сулы ортадағы элодея протопластың қозғалу жылдамдығын бақылау үлгісі ретінде алып, оны АТФ, ДНФ, БАП ертінділеріндегі қозғалыс жылдамдықтарымен салыстыра отырып, протоплазст қозғалыстарының қарқынының өзгергенін байқауға болады.
Тәжірибе нәтижесін ,тәжірибе варианттары мен ондағы қозғалыс жылдамдықтарын көрсететін кестені құру арқылы қортындылайды.
+ Протопласт қозғалыстарының белсенділігін анықтайтын тәсілдер.
Протопласт қозғалысының белсенділігін бөлшектің қозғалыс жылдамдығымен, массаның мөлшерімен немесе қозғалыс күшінің шамасымен анықтауға болады.Протопласт қозғалысының сандық сипаты оның жылдамдығын көрсетеді. Протопласт қозғалыс жылдамдығын өлшеудің бірнеше тәсілдері бар, солардың ішінде тәжірибелік жұмыстарда кең қолданылатындар мыналар:
Салыстыру тәсілі. Микроскопта анықталған протопластың қозғалыс жылдамдығын, суретті салу аппаратының лентасындағы сызықтардың жылдамдық қозғалысымен салыстыра отырып анықтайды. Лента қозғалысын қолмен немесе реттеуші қондырманың көмегімен реттеуге болады. Уақытты белгілеп, лента мен протопласт қозғалыс жылдамдықтарын теңестіре отырып, протопластың абсолютті қозғалыс жылдамдығын оңай есептеуге болады. Бұл әдіс миксомицеттердің плазмодияларының қозғалыс жылдамдығын өлшеуге өте ыңғайлы.
Фотографиялық тіркеу тәсілі. Протопласт бөлшектерінің қозғалысы фотопленкада тіркеледі. Микроскоптың қараңғы аймағында бөлшектер ашық нүкте түрінде көрінеді. Фотографиялау кездерінде ашық нүктелер белгілі қашықтықта жылжып, фотопленкада із қалдырады. Фотографиялауға кеткен уақытты және пленкадағы ашық жолақтың ұзындығын біле отырып, протопласт қозғалыс жылдамыдығын анықтауға болады. Әдістің жетістігі - қарапайымдылығында және алынған нәтижелердің құндылығында.
Протопласта бөлшектердің қозғалу жылдамдығын өлшеу арқылы қозғалысты анықтау тәсілі. Бұл тәсіл саңырауқұлақ гифтері, плазмодиялар, жапырақ , сабақ, тамыр клеткалары, аталық жіпшелердің түктері, тостағанша жапырақшасы және тозаң түтіктері протопластағы қозғалыстарды зерттеуде жиі пайдаланылады. Протопласта бөлшектердің өткен жолы микроскоп окулярының микрометрлік сызғышымен, ал уақыт-секундомермен өлшенеді.
Окулярдың микрометр сызғышының бөліну мөлшерін объектмикрометр көмегімен анықтайды.
Бұл тәсілдерді жақсы меңгеруде және протопластың қозғалыс табиғатын терең түсінуде , мынандай тәжірибелік зерттеу жұмыстарын орындау ұсынылады:
* Протопластың қозғалу қарқынын және оның абсолютті жылдамдығын әртүрлі өсімдік түрлерінде, өсімдік мүшелерінде салыстырмалы анықтау ұсынылады: мысалы, төмендегі кестеде протоплазманың қозғалыс қарқынын осындай жолмен анықтаған тәжірибе қортындысы беріліп отыр. Acetabularia ( сабақ), Nitella ( қойнау аралығы), Elodea densa, Vallisneria (жапырақ), Tradescantia ( аталық жіпшенің түгі), Allium cepa ( қабықшаның ішкі эпидермисі),Aventa Sativa, Zea mays ( тамыр түкшесі).
Өсімдік
Мүше
,мкм/с
Температура, С[0]
Physaeum pdycephalum
Плазмодия-лар
1350
28
Mucor stolinifer
Гиф
55
28
Acetabularia caluculus
Сабақ
2-5
25
Nitella flexilis
Қойнау аралығы
52
20
>>
Ризоид
21
23
Elodea Canadensis
Жапырақ
10
20
Elodea densa
Жапырақ
6,0
20
Vallisneria spiralis
>>
10-15
18
Tradescantia Virginia
Аталық жіпшенің түгі
5,4
24
Cucurbita marima
Сағақ түкшелері
4,3
20
Allium cepa
Қабықшаның ішкі эпидермисі
4,0
20
Әртүрлі өсімдіктер
Тамыр түкшесі
4,8-9,5
20
>>
Аналық түтік
2,3-5,5
26
* Протопластың қозғалыс жылдамдығын анықтауда АТФ және тыныс алу ингибиторларының әсерін анықтауға негізделген зерттеу жұмыстарын жүргізу ұсынылады.
* Протопластың қозғалысына сыртқы факторлар әсер етеді. Жарықтың және температураның протопласт қозғалысына тигізетін әсерін зерттейтін жұмыстарды жүргізу ұсынылады.
Протопластың қозғалыс қарқынын және жылдамдығын зерттеуге байланысты төменде бір тәжірибелік жұмыстың орындалуы ұсынылып отыр.
2.4. Клетка мембранасының бетацианинді өткізуіне температураның әсер етуі.
Бетацианин- қызылшаның клетка шырынында кездесетін пигмент.Бұл пигмент суда жақсы ериді.Бетацианин молекуласының клетка шырынынан сыртқа өтуі , цитоплазманың тонопласт және плазмолемма мембраналары арқылы жүреді.Бетацианиннің вакуольден сыртқа жартылай өткізгіш мембраналар арқылы диффузиялануына әртүрлі факторлер әсер етеді.Белгілі бір уақыт аралығында қызылша кесінділерін инкубациялаған ортаның оптикалық тығыздығын өлшеу арқылы ,белгілі бір факторлердің мембрананың өткізгіштігіне тигізетін әсерін анықтауға болады.
Құрал жабдықтар және реактивтер : Фотоколориметр немесе спектрофотометр ,Бюхнер воронкасы , термостат,бұрғы, пробиркалар, скальпель, пипетка,0.5 M сахароза, қант қызылшасының тамыр жемісі (Beta vulgris).
Жұмыстың орындалуы:Қант қызылшасының тамыр жемісінен қалыңдығы 2-3 мм пластинкалар даярлап,олардан бұрғы арқылы диаметрі 5 мм болатын 60 дискілер алынады.Бұл дөңгелек пішінді кесінділерді Бюхнер воронкасы арқылы 15-20 минут аралығында ағынды суда жуады.Алты пробирка алынып,оның үшеуіне 10 мл су,ал қалған үшеуіне 10 мл 0.5 М сахароза құйылады.Әрбір пробиркаға қант қызылшасының 10 дөңгелек кесіндісін салады.Қант қызылшасы салынған екі пробирканы (біреуінде су,екіншісінде сахароза) бөлме температурасында, осы тектес екі пробирканы температурасы 35 C* термостат ішіне,қалған екі пробирканы температурасы 45 C* екінші термостатқа орналастырады.Бір сағат аралығында 10-15 минут сайын бетацианиннің су және сахароза ерітінділеріне өту қарқынын анықтайды.Ол үшін,бұл пробиркалардағы ерітінділердің оптикалық тығыздығын, толқын ұзындығы 535 нм жасыл фильтрді қолдана отырып, спектрофотометрде анықтайды. Оптикалық тығыздықты анықтағаннан кейін, алынған ерітіндіні қайтадан сол пробиркаларға құяды.Ерітінділердің оптикалық тығыздығы 1 сағат аралығында 3-4 рет анықталады.
Жұмысқа қорытынды жасау үшін, уақытқа байланысты оптикалық тығыздықтың өзгеруін көрсететін график құрылады.
2.5. Тозаңның өсуі кезінде заттардың шығуын анықтау.
Тозаң ауа арқылы аналық аузына түсіп,онда тамшылы сұйық шірнектің көмегімен өседі,өсуі кезінде тозаң түтігі пайда болады.Тозаң түтігі өзінен сыртқа күрделі химиялық құрамды экссудат бөледі.Бөлінген экссудат тозаң мен аналықтың әрекеттесуі кезінде,олардың сәйкестігін анықтайтын қасиеті бар қосылыс.
Тозаңды in vitro жағдайында өсіруге болады.Осыған байланысты тозаң мен өсіретін орта аралығындағы, өзара әрекеттесу ерекшеліктерін анықтауға болады.Тозаң өсу ортасынан көмірсулармен минералды элементтерді сіңіріп қана қоймай ,ортаға өзінен белгілі бір химиялық заттарды бөледі.Тозаңнан заттардың диффузиялануы цитоплазма мембраналары арқылы жүреді.Тозаңнан бөлінген иондардың динамикасын салыстыру арқылы,тозаңның тіршілік қабілетін анықтауға болады.Тіршілік қабілеті жоғары тозаңдардың , in vitro жағдайындаөсіру ортасына экссудатты бөлуі, алғашқы минуттарда басталады. Мұндай заттар,алғашқы кезеңде тозаң қабығынан бөлінеді. Бұл кезде, цитоплазма мембраналарын құрайтын липидтер ламеллярлы күйде болады.Тозаңның өсу уақыты артқан сайын, мембрана липидтерінің дегидратациялануына байланысты мицеллярлы күйге көшеді. Яғни, мембранадағы саңылаулар мөлшері артады, оның өткізгіштік қасиеті жоғарылайды. Осы кезде,тозаңнан экссудаттардың шығу қарқыны арта түседі. Тіршілік қабілеті төмен тозаңдарда, бұл заттардың (экссудаттың) шығуы, тозаңның өсуі кезінде алғашқы минуттарда артса,кейінде керісінше кемиді. Цитоплазма мембраналарының химиялық күрделі заттарды(экссудатты) бөлу қарқындылығына байланысты, тозаңның тіршілік қабілетін анықтауға болады.
Құрал жабдықтар және реактивтер:Центрифуга, фотоэлектроколориметр (ФЭК), Эрленмейер колбасы, секундомер, пипетка, пробиркалар,10% сахароза , А ертіндісі (50 мл 2% Na2 CO3 - тың 0.1 M NaOH-тағы ертіндісі және 1 мл 0.5% Cu2SO4 5H2O-тің 1% жүзім қышқылды K,Na ертіндісінде), Фолин реактиві, традисканция тозаңдары (Tradescantia paludosa)
Жұмыстың орындалуы : 22 мл 10% сахароза құйылған колбаға 30-40 мг тозаң салып шайқайды.Бір минуттан кейін колбадан 2 мл ертінді алып, ертіндіні тозаңнан бөлу үшін,оны 2 минут бойы 4000
мин/айналымда центрифугалайды (немесе фильтр қағаз арқылы сүзеді).Колбадағы тозаң бар қалған суспензияны 3 мл-ден 6 пробиркаға құйып, тозаңның өсуі үшін бұл пробиркаларды 25 C* термостатқа орналастырады.Әрбір 10 минут сайын пробиркадан 2 мл көлемде суспензияларды алып, жоғарыда көрсетілгендей центрифугалау арқылы тозаңнан бөледі.Жұмыс аяқталғаннан кейін,бөлінген сахароза ертінділерінде белгілі бір уақыт аралығында,тозаң клеткалары бөлген экссудат заттарды анықтайды.Тозаңнан бөлінетін заттардың бірі аминқышқылдары мен еритін белоктар.Тозаңнан өсіру ортаға бөлінген белок мөлшері Лоури әдісі арқылы анықталады.Ол үшінбпробиркаға 1 мл зерттелетін ертіндіге (тозаңнан бөліп алынған сахарозаға) 5 мл А ертіндісін құяды,10 минут өткеннен кейін 0.5 мл Фолин реактивін қосады.30 минуттан соң қызыл түсті жарық фильтрін қолдану арқылы фотоколориметрде ертінділердің оптикалық тығыздықтары өлшенеді.
Белок мөлшерін сарысу альбуминінің негізінде құрылған калибровка қисық сызығын қолдану арқылы анықтайды.Тәжірибе нәтижесін белгілі бір уақыт аралығында тозаңнан бөлінген белок мөлшерін көрсететін графикте қортындылайды.
2.6. Протопластарды бөлу және олардың тіршілік қабілеттілігін анықтау.
Клетканың сыртындағы қабықты жойған кезде,протопласт қайтадан клетка қабығын жасап , оны қалпына келтіреді.
Протопластқа микроорганизмдерді, бөгде пластидтерді, метафазадағы хромосомаларды өте жеңіл енгізуге болады.Сонымен қатар, онан интактілі органоидтарды бөлуге болады. Протопластқа гендерді тура тасымалдап енгізу арқылы жаңа қасиеттері бар трансформацияланған өсімдіктерді алуға болады.
Протопластар бір-бірімен қосыла алады, осының нәтижесінде түр және туыс аралықтарында жыныстық жолмен будандаса алмайтын соматикалық гибридтер пайда болады. Протопластан ядроны алып тастап, оны басқа түрдің протопластысымен қосуға болады. Бұл жағдайда, ядро және цитоплазмалық геномдардың әрекеттесуін зерттеуде жақсы обьект болып саналатын, цибридті (гибридке қарама-қарсы) алуға болады.
Жеке бөлініп алынған протопласт көптеген физиологиялық құбылыстарды зерттеуге қолайлы.Клетка қабығын алып тастау, плазмолемма мембранасын тікелей зерттеуге жағдай туғызады.Жекеленген протопласт плазмолемма мембранасының бетіндегі зарядтарды, өткізгіштігін, ионды насостың жұмыс істеуін және тағы басқа қасиеттерді анықтайды.
Өсімдік клеткасының протопластысын механикалық және ферменттердің көмегімен жекелеп бөліп алуға болады. Механикалық бөлу жолы көп қолданылмайды, себебі зақымдалмаған протопластының шығу мөлшері өте аз. Кеңінен қолданылатын әдіс- энзимді бөлу тәсілі. Бұл тәсілде клетка қабығын ерітетін пектиназа және целлюлаза ферменттері қолданылады. Протопластыны бөлетін буферлі ерітіндінің pH мәні 5.5 - 6,0 аралықтарында болуға тиісті. pH мәнінің жоғары немесе төмен болуы, протопластының ісінуін немесе бүрісіп қалуын тудырады.
Құрал жабдықтар және реактивтер: Микроскоп,термостат,центрифуга,Фукс-Розенталь камерасы, Петри табақшасы, бюкстер, жабынды және зат шынылары, 90 г/л маннит, 190 мг/л KNO3 ,147 мг/л CaCl2 H2O, 37 мг/л MgSO4 7 H2O,
2.5 %целлюлаза, 0.3 % пектиназа, 0.3 % нейтралды қызыл ертінді, 0.5 % Эванс көгі, флуоресцеиндиацетат (ФДА) ертіндісі (2.5 мг флуоресцеин,1 мл ацетонда).
Жұмыстың орындалуы:
Жұмыстың орындалуы екі кезеңнен тұрады. Бірінші кезеңде-протопластыны бидай жапырағының мезофил клеткаларынан жекелеп бөліп алады. Мезофилді жапырақ бөлігін жүйкелерден тазартып бөліп,онан салмағы 0.2 г, ені 1 см болып келетін ұзынша кескін алады.Бұл кескінді ені 1 мм бөлшектерге тарамдай көлденең бөледі.Осындай тарамдалған мезофилді жапырақты, 5 мл көлемдегі бөлу ортасына салады. Бөлу ортасы 2.5 % целлюлаза және 0.3 % пектиназа ферменттерінен тұрады.Кесінді салған ферментті ертіндіні 30°С термостатта 2.5-4 сағат аралығында инкубациялайды. Инкубациялық кезең өткеннен кейін, яғни клетка қабығы жойылғаннан кейін, протопласт суспензиясын капрон немесе сүзгіден өткізіп,5 минут аралығында 100g жылдамдықта центрифугалайды. Алынған протопласт, бөлу ортасы ертіндісімен 3 рет жуады.
Жұмыстың екінші кезеңі - протопластың тіршілік қабілеттілігін анықтау. Протопластың бұл қасиеті,. оның вакуолінің нейтралды қызыл ерітіндіні жинақтау деңгейімен айқындалады. Ол үшін, протопласт суспензиясын 0.3 % нейтралды қызыл ерітіндімен араластырады. Қоспаның соңғы концентрациясы 0.06 % болу керек.5 минут өткеннен кейін протопластны микроскоп арқылы қарап, Фукс-Розенталь камерасын пайдалана отырып, тіршілік қабілеті бар протопластың санын есептейді, тәжірибеде мұндай протопласт саны 200-ден кем болмайды.
Бояғыш ретінде 0.5 % Эванс көгін немесе 0.01 % феносафранин ерітінділерін де пайдалануға болады. Бұл бояғыш заттар өлі клеткаларды боямайды.
Протопластың тіршілік қабілетін флуоресцеиндиацетат (ФДА)ерітіндісімен бояу арқылы да анықтауға болады. Бұл бояу ерітіндісінің молекулалары плазмолемма арқылы жылдам өтіп, тірі протопласт эстераза ферментін ыдырату арқылы флуоресцеин түзеді (флуорохроматикалық тест). Флуоресцеин протопласт ішінде жиналады. Жасыл жарықтандыру беретін люминесценциялы микроскоппен қарағанда,. флуоресцеин жиналу ерекшеліктері бойынша протопластың тіршілік қабілетін анықтауға және ажыратуға болады.
Жұмыс орындалғаннан кейін, тәжірибедегі тіршілік қабілеті бар протопластың жалпы санын проценттік шамада есептеу қажет.
ФОТОСИНТЕЗ
Фотосинтез клетканың бүкiл метаболизмiнде негiзгi роль атқарады. өйткенi бұл процесс тiрi организмдер тiршiлiгiнiң алғашқы қайнар көзi болып табылады Фотосинтез кезiнде пигменттiк жүйе сiңiрген жарық энергиясын, энергияға бай метаболиттердiң химиялық потенциалына айналдырып, клеткада көмiрсу, май, белок түрiнде жиналу салдарынан тiрi жүйеде жалпы энергия мөлшерi арта түседi. Бұл процеспен қатар, көмiрсудың клетка метаболизмiне тiкелей қатысуы да жүредi. Фотосинтез процесiнде сiңiрiлетiн көмiртегi атомдары лабильдi аралық өнiмдердiң энергиясы есебiнен, көмiртегi тiзбегiне байланысады да, клеткадағы әр түрлi органикалық қосылыстардың синтезi үшiн көмiртегiлiк қаңқа болып табылады. Демек, фотосинтез энергетикалық және пластикалық алмасу реакцияларымен үздiксiз байланысады. Сондықтан да, жасыл өсiмдiк клеткаларының метаболизмiнiң негiзiн құрайды.
Фотосинтез ферменттердiң басқаруымен жүретiн күрделi тотығу-тотықсыздану процесi. Бұл процесте клетка хлоропластысы күн энергиясын пайдалана отырып, көмiрқышқыл газы мен судан органикалық қосылыс түзедi.
Хлоропласт екi мембраналы органоид, оның сұйықпен толған iшкi бөлiмiн строма деп атайды. Строма iшiнде жеке тиллакоид-мембраналы түтiкшелердiң жиынтығынан тұратын, гран деп аталатын мембраналы жүйе орналасқан. Фотосинтез процесi тиллакоид мембраналарында жүредi, себебi жарықты сiңiретiн және фотосинтез процесiн жүргiзетiн фотосинтездік пигменттер мен ферменттер жүйесi, осы тиллакоид мембраналарында орналасқан.
3.1. Фотосинтез аппаратының пигменттік жүйесінің сипаттамасы.
Фотосинтез процесiне тiкелей қатысатын өсiмдiктер пигменттерiнiң негiзгi топтарына мыналар жатады: тетрапиролды табиғаты бар қосылыс - хлорофилл, порфириндер - магний, полиизопрендер тобына жататын каротиноидтар, тетрапиролды ашық құрамы бар балдырлардың қосымша пигментi - фикобиллин.
Пигменттердiң әр тобының бiрнеше пигменттiк түрлерi болады. Солардың iшiнде жоғары сатыдағы өсiмдiктерде маңызы зор болып табылатындары: протохлорофилл, хлорофилл а және б, каротиндер, ксантофилдер (лютеин, виалоксантин, неоксантин т.б.).
Фотосинтездiң әрбiр кезеңi мен жұмысы пигменттiк жүйелердiң сипаттамасын қажет етедi. Себебi, пигменттер фотосинтез механизмiн зерттеуде маңызды роль атқарады.
Пигменттiк жүйе сипаттамасын құруда мынандай ерекшелiктерге көңiл бөлiп, зерттеу қажет: хлорофилдердiң сандық мөлшерiн, олардың қатынасын (хлорофилл а/хлорофилл б), каротин, ксантофилл мөлшерлерi мен қатынастарын (кр/кс) және жалпы жасыл пигменттердiң сары пигменттерге қатынастарын (хлорофилдер/каротиноидтар) анықтау керек.
Пигменттiк жүйелердiң негiзгi сипаттамасының бiрi сiңiру спектрлерi мен флоуресценция болып табылады. Олар пигменттердiң жеке түрлерi туралы, олардың күйi, әрекеттесуi, биосинтез процесi жайлы ақпаратты сақтап тұрады. Әсiресе бұл жағдайда, төменгi температурада сiңiру спектрлерi мен флоуресценция сипатын бiлу ерекше маңызды. Төменгi температуралы спектрлердiң тiркелуi соңғы жылдары өсiмдiк ұлпасындағы пигменттердiң нативтi формаларын сипаттауда және жеке фотожүйелердiң пигменттiк құрамын зерттеуде кеңiнен қолданылуда.
Дифференциалды спектрофотометрия пигменттiк жүйелердi зерттеудiң аса сезiмтал әдiсi болып табылады. Бұл әдiс қазiргi кезде пигменттердi, цитохромдарды және электронды тасымалдаушы тiзбек компоненттерiнiң сандық және сапалық сипаттамасын беру үшiн колданылады. Пигменттердiң түзiлу немесе ыдырау процестерiн зерттеуде хлорофиллаза ферментiнiң белсендiлiгiн анықтауда негiзгi көрсеткiш болып табылады. Сонымен бiрге хлорофилл - белок комплекстерiнiң берiктiлiгiн зерттеу де маңызды.
Пигменттердiң мөлшерiн анықтау үшiн фотометриялық әдiс қолданылады. Бұл әдiс бойынша хлорофилдi а және б түрлерiне бөлмей-ақ, оның жалпы мөлшерiн анықтауға болады. Каротиноидтардың мөлшерiн нақты анықтау үшiн, оларды хлорофилдерден алдын ала толық бөлiп алу қажет, себебi бұл пигменттердiң сiңiру механизмдерi хлорофилдерден өзгеше, яғни көк-күлгiн спектрлерге сәйкес келедi.
Пигменттердi анықтауда хроматографиялық әдiстер де қолданылады. Фотометриялық әдiстiң хроматографиялық әдiспен үйлесуi, хлоропластардың пигменттiк жүйесiне толық сапалы және сандық сипаттама беруге мүмкiндiк жасайды.
Төменде фотосинтездік пигменттi және ферменттi жүйелердi зерттеудегі кейбiр жұмыстар берiлiп отыр.
+ Жапырақтағы органикалық көміртегі мөлшерінің өзгеруі арқылы фотосинтез қарқынын анықтау.
Фотосинтез процесiнде көмiрқышқылы газының құрамындағы көмiртегi органикалық заттардың көмiртегiне айналады, сондықтан жапырақтарда органикалық көмiртегiнiң жиналуын белгiлеу арқылы фотосинтездiң қарқындылығын анықтайды. Ол үшiн жапырақтағы органикалық көмiртегi екi рет зерттеледi. 1-2 тәулiк қараңғыда тұрған өсiмдiктiң жапырағындағы бастапқы органикалық көмiртегiнiң мөлшерiн анықтап, одан кейiн сол жапырақты өсiмдiктен бөлiп алып, суға қойып, 2 сағат жарықта ұстап, қайтадан органикалық көмiртегiн анықтайды. Сол екi көрсеткiштiң айырмасы фотосинтездiң арқасында түзiлген органикалық көмiртегiнiң мөлшерiн белгiлейдi. Алынған көмiртегiнiң мөлшерiн жапырақтың көлемiне және тәжiрибе уақытына есептеп фотосинтездiң қарқындылығын табады - мгС/дм2 сағат.
Бұл тәсiлдiң негiзi - калий бихроматын қолданып, қышқыл ортада органикалық көмiртегiн жандыру. Тотығуды сумен ерiтiлген күкiрт қышқылында (1:1) дайындалған калий бихроматының 0,4Н ерiтiндiсiмен жүргiзедi. Көмiртегi тотығып, көмiр қышқыл газына айналады. Тотығу реакциясы мына теңдеу бойынша өтедi:
К2Cr2O7+8H2SO4+3C=2K2SO4+2Cr2(SO4)3+3H2O+3CO2
Тотығуға жұмсалған К2Cr2O7 мөлшерiн анықтап, тотыққaн көмiртектiң мөлшерiн табуға болады. Одан артық қалған К2Cr2O7 мөлшерiн Мор тұзының 0,2Н ерiтiндiсiмен титрлеп анықтайды. Бұл реакция мына теңдеу бойынша жүредi:
K2Cr7O7+6FeSO4+7H2O=Cr(SO4)3+3Fe(SO4)3+K2SO4+7H2O
Құрал жабдықтар және реактивтер: қараңғыда ұсталған өсiмдiк жапырақтары, Эрленмейер колбасы, бюретка, воронка, шыны таяқша, О,4Н калий бихроматы (К2Cr2O7), O,2H Мор тұзы, дифениламин.
Жұмыстың орындалуы: тәжiрибе жүргiзу алдында өсiмдiктi 1-2 тәулiк қараңғыда ұстайды, оның нәтижесiнде жапырақтар органикалық заттардан, яғни фотосинтездiң ассимиляттарынан босатылады.
Жапырақтан дөңгелек 1-2 кесiндi алынып, көлемi 100 мл Эрленмейер колбасына салынады. үстiне бюретка арқылы 10 мл калий бихроматының 0,4 н ерiтiндiсi құйылады. Қайнауы бiркелкi болу үшiн капилляр салады. Колбаның аузын воронкамен жабады да, отқа қойып 5 мин бiрқалыпты қайнатады. Осы мерзiмде органикалық заттар толық жанып болады.
Органикалық заттарды жандырған кезде хром қоспасы мол болу керек, ол жеткiлiксiз болса, сұйықтықтың түсi жасыл болып кетедi. Жандырғаннан соң К2Cr2O7 концентрациясы О,2 н төмен болмау керек, солай болса, қалған калий бихроматын О,2н Мор тұзымен титрлегенде одан 10 мл шамасында жұмсалады. Егерде титрлеуге Мор тұзы 5 мл кем жұмсалса, онда хром қоспасының жандыруға аз алынғанын көрсетедi.
Суыған колбаның iшiндегiсiн көлемi 250 мл Эрленмейер колбасына ауыстырып, колбаны және воронканы дистилденген сумен бiрнеше рет тиянақты шайқап, үстiне құяды, оған 100-150 мл су жұмсалады.
Одан кейiн колбаға 2-3 мл 85% Н3РО4, 10 тамшы дифениламин қосылады. Сонан соң колбаны ептеп айналмалы қозғалыспен араластырып отырып, О,2 н Мор тұзының ерiтiндiсiмен титрлейдi.
Дифениламин бихроматтың ерiтiндiсiнде тотығады, түсi көк-күлгiн болады, соның арқасында сұйықтықтың түсi қызыл-қоңыр болып кетедi. Титрлеген кезде Мор тұзының мөлшерi молайған соң Cr[6+] иондары тотықсызданып Cr[3+] айналады, сонда ерiтiндiнiң түсi бiртiндеп алдымен көк түске айналады, аяғында бәрi Cr[6+] иондары тотықсызданған соң көк-күлгiн түстi болып кетедi. Тотықсыздандырғыштың (FeSO4) мөлшерi азырақ артылғанда дифениламин тотықсызданады. Ол күйде оның түсi жойылады да, ерiтiндiның түсi Cr[3+] иондарының арқасында жасыл болып көрiнедi. Ерiтiндiнiң түсi күлгiн түстен шұғыл жасылға айналуы реакцияның аяқталғанын белгiлейдi. Бұл өзгерiс Мор тұзының бiр тамшысынан пайда болғандықтан аяғында өте абайлап титрлеу керек. Реакцияның аяғын айқын белгiлеу үшiн фосфор қышқылы қосылады. Фосфат артық Fe[3+] иондарын байланыстырып, олардың индикаторға керексiз әсерiн жояды, сондықтан жоғарыдағы айтылған түс өзгерiсi айқын көрiнедi.
Кесiндi алынған жапырақтарды суға салып, сабағын осы жерден кесiп алады. Сөйтiп 2 сағат жарықта немесе лампаның астында ұстайды. Одан кейiн тағы да 1-2 дөңгелек кесiндi алып, айтып өткендей, калий бихроматында жандырып, Мор тұзымен титрлейдi. Осымен қатар бақылау тәжiрибе жүргiзiледi. Ол үшiн тек қана 10 мл 0,4н калий бихроматын 5 мин қайнатып, онымен жоғарыда айтылған операцияларды қайталайды.
Тәжiрибе колбасын және бақылау колбасын титрлеуге жұмсалған Мор тұзы мөлшерiнiң айырмасы арқылы көмiртегi мөлшерiн анықтайды. Оны мына формуламен есептейдi:
(A-B)·K·0,6·100
С мг/дм[2] сағат = -------------------------
S
A- бақылау колбасын титрлеуге жұмсалған Мор тұзы ерiтiндiсiнiң мөлшерi, мл.
В- тәжiрибе колбасын титрлеуге жұмсалған Мор тұзы ерiтiндiсiнiң мөлшерi, мл.
К - Мор тұзының титрiне түзету коэффициентi.
S - жапырақ кесiндiсiнiң көлемi - см[2] (оны дм[2] айналдыру үшiн 100-ге көбейтедi).
Бұл жұмысқа қажеттi реактивтер төменгi тәсiлдермен даярланады.
1. 0,4н калий бихроматы, сумен ерiтiлген күкiрт қышқылында (1:1) дайындалады. К2Cr2O7 грамм-эквивалентi 49,031. Алдымен калий бихроматының 0,2н су ерiтiндiсi дайындалады. Оны фарфор стаканына құйып алып, үстiне көлемi бiрдей сұйылтпаған күкiрт қышқылын, тартып алатын шкаф iшiнде құяды. Сөйтiп калий бихроматтың соңғы концентрациясы 0,4н болады.
2. Мор тұзының 0,2н ерiтiндiсi, г-экв. 392,14 Мор тұзының өлшендiсiн алғанда тек көгiлдiр кристалдарын таңдап алу керек, қоңырлауын қалдырып, Мор тұзын сұйылтпаған күкiрт қашқылы қосылған дистилденген суда ерiтедi. Қышқыл 1 л суға 20 мл есебiнен қосылады. Мор тұзының титрi КМnO4 арқылы белгiленедi, ал перманганаттың титрi Na2C2O4 немесе H2C2O4 арқылы анықталады.
КМnO4 ерiтiндiсiн дайындау, г-экв КМnO4 - 31,608. Өлшендiнi суға езiп, 1 сағат қайнатады. Тұнба түссе, оны шыны фильтр арқылы сүзу керек.
Перманганаттың титрiн анықтау. Перманганатты шыны краны бар бюреткаға құяды. Кранды вазелин орнына сұйылтпаған H2SO4-мен майлайды. Na2C2O4 дәл өлшендiсi (0,20-0,25 г) конус формалы колбада 100 мл ыстық суда (80-90) ерiтiледi. 10 мл сұйылтылған күкiрт қышқылы (1:1) қосылады да, 0,2н перманганатпен үздіксіз шайқап, әлсiз қызғылт түске дейiн титрлейдi. Перманганаттың бiрiншi тамшылары өте баяу түссiзденедi, сондықтан оны өте ақырын титрлеу керек. Қызғылт түс бiр минут бойы сақталса, титрлеу аяқталғаны.
a2
K = -----------------------
V·0,0134004
К - титрдiң түзету коэффициентi
а - оксалаттың өлшендiсi, г
V - 0,2н КМnО4 жұмсалған мөлшерi, мл
0,0134004 г - дәл 0,2 н КМnО4 ерiтiндiсiнiң 1 мл-не сәйкес оксалаттың мөлшерi.
Мор тұзының ерiтiндiсiнiң титрiн анықтау. Мор тұзының 25-30 мл-не 3 мл фосфор қышқылын қосып, перманганатпен титрлейдi. Қызғылт түс пайда болғаннан кейiн 30 сек бойы жоғалмаса, титрлеу аяқталады.
V K1
K= --------------
V1
K - титрдiң түзету коэффициентi
V - 0,2н КМ О4 жұмсалған мөлшерi, мл
К1 - перманганат титрiнiң түзету коэффициентi
V1 - Мор тұзының мөлшерi, мл
* Дифениламин. Дифениламиннiң 0,5 г өлшендiсi 100 мл сұйылтпаған күкiрт қышқылда және 20 мл суда ерiтiледi.
3.3. Спектрофотометрді қолданып жасыл пигменттердің мөлшерін анықтау.
Өсiмдiктер пигменттерi жарық сәулесiн түгелдей сiңiрмейдi, олардың таңдағыштық-талғағыштық қасиетi болады, яғни белгiлi күн сәулесiн қабылдайды. Бұл қасиет әрбiр пигменттiң құрамындағы белгiлi атом топтарына, яғни хромофор топтарына байланысты.
Фотосинтезге қатысы бар пигменттердiң бәрiнде хромофор топтары қос байланыстар мен сыңар байланыстардың жүйесi болып келедi, соның iшiнде оңай қозатын - электрондар көп болады. - байланысты түзетiн - электрондары тез полярланады да орнынан қозғалады.
- электрондар үшiн көзге көрiнетiн спектр кванттарының энергиясы жеткiлiктi. Сондықтан барлық пигменттердiң хромофор топтарында дағдыдағыдай қос байланыстар болады.
Пигмент молекуласының жарық энергиясын сiңiруi оның энергетикалық күйiнiң өзгерiсiмен байланысты. Фотометриялдық талдаудың негiзi қосылыстың немесе оның ерiтiндiсiнiң өзiне сiңiрiп алған жарық мөлшерiн анықтау. Соның арқасында сол қосылыстың концентрациясын анықтауға болады.
Спектрофотометрде пигменттердiң оптикалық тығыздығын (Д) өлшейдi. Әрбiр пигмент немесе оның ерiтiндiсi толқын ұзындығын белгiлi жарықта қабылдайды. Мысалы 80% ацетонда ерiтiлген а хлорофилiнiң ең жақсы сiңiретiн жарықтың толқын ұзындығы - 663 нм, в хлорофилi - 645 нм; 100% ацетонда ерiтiлген а хлорофилi 662 нм жарықты сiңiредi, в хлорофилi - 644 нм. 96% этанолда ерiтiлген а хлорофилi толқын ұзындығы 655 нм жарықты сiңiредi, в хлорофилi - 649 нм т.с.с.
Осы принципке сүйенiп, пигменттердiң жалпы қоспасында олардың жеке концентрацияларын анықтауға болады. Пигменттер ерiтiндiсiнiң оптикалық тығыздығы екi толқын ұзындығында өлшенiп, кейiн әрбiр пигменттер концентрациясын мына формуланы пайдаланып есептейдi.
Са мг/л =12,7 ∙ Д663- 2,69 ∙ Д645
Св мг/л =22,9 ∙ Д645 - 4,68 ∙ Д663
Са+в мг/л =8,02 ∙ Д663 +20,2 ∙ Д645
Құрал-жабдықтар және реактивтер: фарфор келiсi, кварц құмы, вакуум насосы, сЇзгi қағаздар, воронка, колба, спектрофотометр, CaCO3, 80% ацетон, өсiмдiк жапырақтары.
Жұмыстың орындалуы: Сабағы мен iрi жүйкелерi алып тасталынған жапырақтан 200 мл өлшеп алады. Оны фарфор келiсiне салып, құм және CaCO3 қосып 80%-к ацетонда езедi. Әбден жақсы ұсақталған соң экстрактыны №3 шыны сүзгiш воронка арқылы вакуум насосын пайданалып сүзедi. Сүзгiштi 2-3 рет ацетонмен шайып алып, экстрактыны 25 мл өлшемдi колбаға құяды да, өлшеу белгiсiне дейiн 80% ацетонмен жеткiзедi. Экстрактының оптикалық тығыздығын СФ -де 645 нм немесе 663 нм толқын ұзындығында өлшейдi. Бақылау кюветаға 80% ацетон құйылады.
Алдын ала а хлорофилiнiң жарықты сiңiру максимумы тексерiледi. Мысалы, 663 нм орнына ол 665 болып шықса, онда в хлорофилiнiң максимумы соған сәйкес 647 нм толқын ұзындығында өлшенедi. Пигменттiң концентрациясы анықталған соң жапырақтағы мөлшерi мына формуламен есептелiнедi.
C·V
A = -------------мг/г
P·1000
C - пигмент концентрациясы, мг/г
V - пигмент экстрактысының көлемi, мл
P - жапырақ өлшендiсi, г
1 г жапырақта әдеттегiдей хлорофилдiң мөлшерi 0,5 мг-нан 3 мг-ға дейiн болуы мүмкiн, а/в = 2,5 - 3
3.4. Хроматографиялық тәсілмен жапырақтағы негізгі пигменттерді сорғыш қағазбен бір-бірінен бөлу және олардың мөлшерін анықтау.(Д.И.Сапожников бойынша)
Әр түрлi қоспалардан физикалық-химиялық әдiспен жеке қосылыстарды бөлiп алу әдiсiн хроматография деп атайды. Қазiргi заманда бұл әдiс биохимиялық және физиологиялық зерттеулерде негiзгi тәсiлдердiң бiрi. Хроматография әдiстерi 3 топқа бөлiнедi:
1. Адсорбциялық хроматография
2. Бөлiп таратқыш хроматография
3. Тұнбаға түсiру хроматографиясы.
Адсорбциялық хроматография тағы екi түрге бөлiнедi: молекулалық және ион алмасу хроматографиясы.
Жапырақтың пигменттерiнiң бiр-бiрiнен қағаз бетiнде ажырату тәсiлi адсорбциялық молекулалық хроматографияға жатады. Қағаз пигменттердi молекулалық салмағының ықпалымен қоспадан сорып алады. Әрбiр пигменттiң молекулалық салмағы бiрдей болмайды, сондықтан әр пигмент қағазда өз орнын алады.
Адсорбциялық қасиетi күштi пигменттер сорғыш қағазда ең алдымен адсорбцияланады. Мысалы, хлорофилдердiң сорғыш қағазбен әрекетi сары пигменттерге қарағанда күштiрек, сондықтан олар қағаз бетiнде ерiткiштiң әсерiмен алысқа жылжымайды да, старт сызығына жақын орналасады. Себебi сорғыш қағаз полярлы қасиетi бар целлюлозадан тұрады, хлорофилдiң де полярлы қасиетi мол. Ал полярлы қасиетi жоқ сары пигменттер старт сызығынан едәуiр алысқа жылжиды, әсiресе каротин. Сөйтiп, пигмент-сорбент (целлюлоза) арасындағы байланыстың мықтылығына пигменттердiң полярлы қасиетi әсер етедi.
Пигменттердi бiр-бiрiнен алу үшiн полярлы емес ерiткiштердi қолданады
Құрал-жабдықтар және реактивтер: фарфор келiсi, бор ұнтағы, сүзгiш воронка, Бунзен колбасы, вакуум насосы, сорғыш қағаз, Na2SO4, этанол және ацетон, қолданылатын өсiмдiк жапырақтары.
Жұмыстың орындалуы. Пигменттердiң экстрактысын шығарып алу үшін, сабақ пен iрi жүйкелерден жекеленіп алынған жапырақтан 500 мг өлшенiп алынады. Одан кейiн, жапырақтың кесiндiлерi бұрыннан суытылып қойылған фарфор келiсiнде сусыз Ha2SO4 (1 г) және азырақ бор ұнтағы қосылып езiледi. Әбден жақсы ұсақталған жапырақ ұнтағы № 3 шыны сүзгiш воронкаға салынады да, үстiне 3-5 мл этанол мен ацетонның (3:1) суық қоспасы құйылады. 5 мин тұндырылғаннан соң Бунзен колбасын пайдаланып, вакуум-насоспен сүзiледi. Жапырақтың ұнтағы этанолмен тиянақты жуылып, экстрактың көлемi спиртпен 10 мл-ге жеткiзiледi.
Пигменттердi сорғыш қағазға түсiру. Сорғыш қағаздың көлемi 16 х 16 см. Астыңғы шетiнен 2 см бос жер қалдырып, қарындашпен ұзындығы 12 см сызық сызу керек, ол пигменттердi түсiретiн орынды белгiлейдi. Сол сызықтың үстiне 1 мл пигменттердiң экстрактын енгізу керек. Әрбiр жолы пипетка мен ерiтiндi енгізілгеннен кейін, сол жерді вентиляторды қолданып кептiру қажет, содан соң, қайтадан ерiтiндiнi 1 мл бiткенше енгізу керек.
Пигменттер түсiрiлiп болғаннан соң қағазды жақсы кептiрiп, цилиндр түрiнде бүктеп, төменгi және үстiңгi жағынан скрепкамен бiрiктiрiп, хроматография жүргiзетiн камераға тігінен қояды. Камераның түбiне қойылған Петри табақшасына 30 мл ертінді қоспасы құйылады, оның құрамына бензол мен петролей эфирi кiредi (2:1). Бұл қоспа ерiткiш ретiнде пайдаланылады, сорғыш қағаз қойылғанда ерiткiштiң деңгейi пигменттер сызығынан 1-1,5 см төмен болуы керек. Камера үстiне қара матамен немесе қара қағазбен тиянақты жабылады, әйтпесе пигменттер жарықта тотығады. 30-40 минут өткен соң ерiткiш бiршама (14 см) көтерiледi де, пигменттер бiр-бiрiнен ажырайды, хроматограмманы шығарып кептiру керек.
Пигменттер қағаздың бетiнде мынадай ретпен орналасады:
* каротин
* лютеин
* виолаксантин
- хлорофилл а
- хлорофилл в
- старт сызығы.
Әрбiр пигменттi қарындашпен белгiлеп, қайшымен кесiп алады. 4 пробиркаға пигментi бар қағаз тiлiмiн майдалап турап, үстiне 5 мл этанол мен ацетонның қоспасын (1:3) құяды. 15 минут өткен соң пигменттер қағаздан толық ерiткiшке көшедi, бұл процестi элюация дейдi, алынған пигмент ерiтiндiсiн элюат деп атайды.
Элюаттардағы пигменттердiң мөлшерiн CФ-де анықтайды, жарықтың мынадай толқын ұзындықтарын пайдаланып:
хл а - 665 нм
хл в - 645 нм
каротин - 450 нм
ксантофилдер - 445 нм
Одан кейiн пигменттердiң жапырақтағы мөлшерiн мына формуланы қолданып есептейдi:
С ∙V
A = -------------- мг/г ылғалды салмағына
p1000
c - пигменттiң концентрациясы, мг/"1000 мл
V - элюаттың көлемi, мл
р - сорғыш қағазға енгiзiлген жапырақтың салмағы
А - 1 г ылғалды жапырақ салмағындағы пигмент мөлшерi.
3.5. Хлоропластардың тотықсыздандыру активтілігін 2,6-дихлорфенолдың жарықта тотықсыздануы арқылы анықтау.
1937 ж. ағылшын ғалымы Р. Хилл бөлiнiп алынған хлоропластардың жарықтың әсерiмен бiр қатар қосылыстарды тотықсыздандырып, оттегiн бөлiп шығаратын қабiлетiн ашты.
Содан кейiн, хлоропластардың жарықта электрон акцепторлары (A) барында О2 бөлiп шығаруы Хилл реакциясы деп аталады:
H2O+А AH2+1/2 O2
Кешiрек американ ғалымдары бөлiп алынған хлоропластардың жарықта пиридиннуклеотидтерді, соның iшiнде НАДФ-ты тотықсыздандыратын қабiлетiн көрсеттi:
H2O + НАДФ НАДФ. Н2 + O2 + H2O
Қазiргi уақытта бөлiнiп алынған хлоропластардың, фотосинтездiң бәр кезеңдерiн жүзеге асыратыны дәлелдеген. Хлоропластардың тотықсыздандыру қабiлетiнiң активтiлігiн ,электрон акцепторларын тотықсыздандыру арқылы тiкелей анықтауға болады. Мысалы, хлоропластардың фотохимиялық активтiлігiн 2,6 - дихлорфенолиндофенолдың (2,6 - ДХФИФ) тотықсыздануының жылдамдығына қарай табуға болады.
2,6 - ДХФИФ тотыққан түрiнде (6,5 рН) түсi болады, тотықсызданған күйiнде түссiз қосылысқа айналады.
Бояудың түссiз түрiне айналу жылдамдығына қарай реакцияның қарқындылығын анықтайды. Бояудың оптикалық тығыздығын (Д) СФ-де толқын ұзындығы 620 нм өлшеп, оның мөлшерiн анықтайды.
Хлоропластардың фотохимиялық активтiлігiн анықтау үшiн, суспензияның 1 мл-де 5-10 мкг хлорофилл болуы керек.
Құрал-жабдықтар және реактивтер: пробиркалар, сперктрофотометр, дихлорфенол (ДХФИФ), хлорофилл суспензиясы.
Жұмыстың орындалуы: Екi пробиркаға 4 мл-ден хлоропласт суспензиясы және 1 мл-ден ДХФИФ 1∙10-4 ерiтiндiсi құйылады. Екеуiнде де алғашқы мөлшерiн анықтау үшiн оптикалық тығыздығы тез өлшенедi (t0) одан кейiн пробирканың бiреуi жарыққа қойылады (тәжiрибе), екiншiсi - қараңғыға (бақылау). Екеуi де 2 минут iшiнде әр 30 сек сайын СФ-де 4 рет өлшенедi (t1 t2 t3 t4). CФ-де өлшегенде бақылау кюветасына 4 мл суспензия мен 1 мл су құйылған қоспа алынады. Оптикалық тығыздығы өзгеруi арқылы хлоропластардың жарықтағы және қараңғыдағы активтiлігi бiлiнедi (t4 - t0).
Бояудың мөлшерi мына формуламен есептеледi:
Д
С = ----------------
Ed
Д - оптикалық тығыздық
E - миллимольды экстинкция коэффициентi (17,7)
d - СФ- кюветасының қалыңдығы (1 см)
Әрбiр пробиркадағы бояудың бастапқы (Д0) және соңғы (Д4) оптикалық тығыздығын жоғарыда көрсетiлген формулаға қойып, бояудың алғашқы (C0) және соңғы (C4) концентрациясын есептеуге болады.
Сонда, С4 - С0 бояудың 2 мин iшiнде 4 мл хлоропласт суспензиясындағы тотықсызданған мөлшерiн көрсетедi. Жарықта ол көрсеткiш едәуiр жоғары болады. Одан қараңғыда тотықсызданған (реактивтер күшiмен тотықсызданған) бояудың мөлшерiн алып тастайды. Қалған мөлшерiн 1 мг хлорофилге бiр сағатқа есептеп, хлоропластардың фотохимиялық активтiлігi анықталады.
3.6. Жұқа қабатты хроматография әдісімен пигменттерді бөлу.
Құрал жабдықтар және реактивтер:фарфор келісі, хроматографиялық камера, шыны пластинка,даяр силуфол пластинкасы, пипетка, пробиркалар, сахароза,. ацетон, бензол,петролеин эфирі, этил спирті.
Жұмыстың орындалуы:
Пигмент экстрактасын алу. 0,5 жапырақ өлшендісін фарфор келісінде сусыз Na 2SO4 және бор қосып езіп, ацетон қосады. Ацетонды экстракт көлемі 10 мл болу керек.
Жұқа қабатты сорбентті пластинка дайындау үшін, капронды мата немесе диаметрі 0,25 мм сүзгіден өткен сахарозаны сорбент ретінде пайдаланады.Сорбентті пластинкаларды даярлау бір қатар қиындықтарды тудырады,сондықтан мүмкіншілік болса, жұмысты орындауда даяр силуфолды пластинкаларды қолдану керек.
Сұйық сорбентті жасау үшін бірдей мөлшерде сахароза мен метанолды ( 13 г сахароза+ 12 мл метанол) қосады. Оны, аузы тығынмен тығыздалып жабылған Эрленмейер колбасында 1-2 минут шайқайды. Одан кейін, үстіне крахмал қосып (3 %) 1 минут тағы шайқайды.
Хром қоспасымен жуылып кептірілген 13 х 18 см көлемдегі шыны пластинканы горизонтальді етіп орналастырады. Осы пластинкаға сахароза мен метанол қоспасын үстінгі бетіне жая құяды, 0,3-05 мм қалыңдықта. Сорбенті бар пластинканы 10 минут ауада кептіріп, онан кейін, 40 С[0] температурада термостатқа 2 сағатқа қояды.
Белгілі көлемдегі ацетонды экстрактыны пластинка шетінен 2 см қашықтықта 2 см-лік сызық пішінінде, микропипеткамен сорбент бетіне тамызады. Пигмент ерітіндісін жеке тамшы түрінде, сорбенттің беткі қабатына тигізбей тамызу керек. Пигмент ерітіндісі бар сорбентті пластинканы кептіріп, 10 минутқа храмотографиялық камерада тігінен орналастырады.
Екі өлшемді хроматограмманы алу үшін, храмотография камерасында еріткіштердің 2 жүйесі қолданылады:
1 бағытта - петролейн эфирі (70-100 С[0])- этил спирті ( 30:1).
2 бағытта- бензол - петролейн эфирі ( 2:1 немесе 3:1). Әрбір қоспаның жалпы көлемі 60 мл болуы керек. Хроматограмманы әрбір қоспада 20-30 минут айдайды, пигмент анық бөлінгеннен соң камерадан шығарып ауада, қараңғыда кептіреді.
Элюция және пигментті сандық анықтау. Жеке боялған сорбентті белдеуді шыны пластинкадан скальпель көмегімен бөліп алып, шыны фильтрге жинайды. Пигменттер бірден фильтрге ацетон және этил эфирімен элюацияланады. Элюатты пробиркаға жинап, жеке пигменттердің оптикалық тығыздығын және спектрді сіңіруін СФ-4 немесе СФ-14 те өлшейді.
3.7. Дифференциалды центрифугалау әдісімен хлоропластарды бөліп алу және ондағы хлорофилдің мөлшерін анықтау.
Қазіргі уақытта жекеленіп бөлініп алынған хлоропластарда фотосинтез механизміне байланысты зерттеу жұмыстарын жүргізуге болады, яғни хлоропластының фосфорлау және тотықсыздандыру қабілеттілігін, активтілігін, химиялық қасиетін, құрылысын т.б. зерттеуде. Қазіргі кезде хлоропластыны бөлу үшін дифференциалды центрифугалау және тығыздық градиентінде центрифугалау әдістері қолданылады.
Дифференциалды центрифугалау әдісі арқылы хлоропластыны бөліп алу үшін, арнайы орта қажет. Сол ортада жапырақтың өлшендісін ұнтақтап гомогенат алады. Гомогенат центрифугада лайықты жылдамдықпен айналдырылғаннан соң, хлоропластының фракциясы бөлініп алынады. Бөлуші орта осмостық қысым тұрғысынан хлоропластарға изотониялық болуы үшін NaCl, сахароза қосылады.
Сулы ортада бөлгенде хлоропласт фотохимиялық активтілігін сақтайды, бұл жағдайда ламмелярлы құрылыс бұзылмайды, бірақ көмірсулы циклдағы ферменттер суда еритін комплексті бөлімін жоғалтады.
Хлоропластның фосфорлаушы қабілеттілігін және тотықсыздандыру активтілігін анықтауда сулы орта қолданылады. Хлоропластны жекелеп бөлуші орта изотониялы және химиялық инертті болуы қажет, оның pH мәнін белгілі бір мөлшерде фосфат, трис-, тицинбуферін немесе басқа буферлер жүйесін қосу арқылы анықтайды. Хлоропластны жекелеп бөлуде, көп жағдайда мынандай құрамдағы орталар қолданылады:
* 0,35 М NaCl 0,05 M трис HCl буферінде, рН 8,0;
* 0,30 M NaCl 0,06 M фосфатты буферде, рН 6,9;
* 0,40 M сахароза 0,01 M KCl 0,05 M фосфатты буферде, рН 6,9.
Хлоропластның қасиетін сақтау үшін, бөлетін ортаға сульфгидрилді қоылыстарды ( цистеин, глютатион, альбумин, фикол, полиэтиленгликоль) қосады.
Құрал жабдықтар және реактивтер: Центрифуга, фарфор келісі, пробиркалар, сахароза, цистеин, глютатион, альбумин, трис-HCl буфері (pH-8), фосфат буфері (pH- 6.9), KCl, NaCl.
Жұмыстың орындалуы. Басқа жұмыстардағы сияқты, бұл жұмыстың орындалуы да 0-4 С0 жүргізіледі. Жапырақтың 2 г өлшендісін алып, 20 минут тоңазытқышқа қояды. Содан кейін, оны суық фарфор келісінде 10 мл орта қосып, 1-2 минут ішінде ұнтақтап, жаншып езеді. Гомогенат екі қабат мата арқылы сүзіліп, суық центрифуга пробиркаларына құйылып, минутына 800 айналыммен (1000 g) 5 минут айналдырылады. Тұнбаны алып тастап, супернатантты қайтадан центрифугада минутына 2500 айналыммен 15 минут айналдырып, хлоропластарды бөліп алады, олар тұнбаға түседі. Тұнбаны ортамен жуып, тағы да центрифугада 2500 айналымда 15 минут айналдырады. Хлоропластлы гомогенат көлемін ортаны қосу арқылы 30-40 мл жеткізеді.
Алынған хлоропласт препаратын 0-3 С[0] температурада ұстау керек. Бұл жағдайда бірнеше сағат ішінде хлоропластның активтілігі сақталады.
Хлоропластарды жекелеп бөлуде қолданылатын екінші әдіс, бұл сахароза тығыздығы градиентінде дифференциалды центрифугалау әдісі.Центрифуганың шыны пробиркасына пипетка көмегімен қабырғасынан жылжытып, сатылы қатарда сахароза градиенттерін жібереді (0,05 M фосфор буферіндегі pH 7,2):
жоғарғы қабат - 0,8 М сахароза, көлемі - 7 мл
Ортаңғы қабат - 1,0 М сахароза, көлемі - 10 мл
Төменгі қабат - 1,5 М сахароза, көлемі - 5 мл.
Сахароза градиенттерінің үстіне 6 мл хлоропласт суспензиясын жібереді. Пробирканы теңестіріп, центрифуга 2500 айналымда 20 минут аралығында айналдырады. Хлоропласт фракцияларын шприц көмегімен жеке пробиркаларға ( көлемі 3 мл) жинап, оның ақырғы конценрациясына дейін 0,5 М сахарозаны қосып, микроскоп арқылы қарайды.
1- фракция - хлоропласт фрагментінің негізін құрайды.
2-фракция- орташа және ірі хлоропластар фрагменттері.
3-фракция- аздаған орташа хлоропластар бар, ірі бүтін хлоропластылар фрагменті.
Хлоропласт суспензиясында хлорофильді анықтау үшін, 2 мл суспензияға 8 мл 100 % ацетон қосады. Ерітінді №2-№3 шыны фильтр арқылы сүзіліп, онан кейін көлемі 10 мл-ге дейін 80 % ацетонмен жеткізіледі. Ерітіндінің оптикалық тығыздығы спектрофотомерде 652 нм толқын ұзындығында өлшенеді, бақылау үлгісі ретінде 80 % ацетон қолданылады. Хлорофильдің конценрациясы Арнон формуласымен есептеледі:
Д652 1000
Cмг/л= --------------
34,5
10
1 мл суспензиядағы хлорофилдің мөлшері : C= -----------
1000 ∙ 2
Хлорофилдің 1 мл суспензиядағы мг мөлшерін анықтауда жүргізілетін көп сериялы тәжірибелерде оптикалық тығыздықты мынандай тұрақты коэффициентке K= 0,145 көбейту арқылы есептейді.
10
К= ------------ = 0,145
34,5 ∙ 2
ТЫНЫС АЛУ
Клетканың тiршiлiгiне қажеттi энергия көзi, ондағы қоректiк заттар болып есептеледi. Тотығу-тотықсыздану реакцияларының нәтижесiнде клеткадағы қоректiк заттар ыдырап, энергия бөлiнедi, және клетканың тiршiлiк қызметтерiне қатысатын химиялық активтi метаболиттер пайда болады.
Органикалық заттардың тотығуы, екi тыныс алу процестерiнiң жүру жолдары арқылы сатылы жүредi. Тыныс алудың гликолитикалық жүру жолы үш кезеңнен тұрады: гликолиз, Кребс циклiнен және электронды тасымалдаушы тiзбектен. Бұл кезеңде оттегiнiң жалпы сiңiрiлуi 50-90%-ке дейiн. Тыныс алудың пентозды - фосфатты жолында 10-40%-ке дейiн оттегi сiңiрiледi.
Жеке тыныс алу циклдерiнiң жалпы тыныс алу құбылысына қатысы әр түрлi iшкi және сыртқы факторларға тәуелдi: ұлпа түрiне, жасына, қызметiне, минералды қоректенуiне, экологиялық әсер етушi факторларға және т.б. Қазiргi кезде тыныс алу процесiн анықтайтын физиологиялық және биологиялық әдiстер әр түрлi деңгейлерде жүргiзiлiп жүр: молекулалық, клеткалық, ұлпалық және өсiмдiктiң жеке дене мүшелерi деңгейiнде.
Тыныс алу процесiнiң клетка деңгейiндегi зерттеу жұмыстары митохондрияны зерттеумен тiкелей байланысты. Себебi, тыныс алу субстраттарының шешушi тотығу кезеңдерi митохондрияда жүредi. Бұл кезеңдер электронды тыныс алу тiзбегiндегi НАД.Н+H+ және ФАД.Н2 коферменттерiнiң тотығуымен байланысты. АТФ молекулаларының түзiлуi де, электронды тасымалдаушы тiзбек (ЭТТ) арқылы электрондардың тасымалдануына қатысты. Сондықтан да, тыныс алу энергетикасына байланысты бiрқатар зерттеу жұмыстарын, өсiмдiк клеткаларынан жекеленiп бөлiп алынған митохондрияларды зерттеу арқылы анықтайды. Энергия алмасушы зерттеуге қажеттi жекеленген митохондрияларды алудағы ең негiзгi жағдай - олардың зақымдалмауын қадағалау. Осыған байланысты зақымдалмаған, жекеленген митохондрияларды бөлiп алуда мынандай ережелердi сақтау керек:
1. Митохондрияны бөлiп алу операциялары 0-2°С төменгi температурада жүредi.
2. Ұлпадан митохондрияны бөлiп алу өте жылдам жүргiзiледi.
3. Клетка шырынының рН мәнiн сақтау үшiн және митохондриялардың гипотониялық ерiтiндiлерге түсуiн болдырмау үшiн, клеткаларды экстракциялауда митохондрияны бөлушi ортаның құрамы мен мөлшерiн анықтау қажет.
Митохондрияларды бөлiп алуда дифференциалды центрифугалау әдiсi қолданылады. Митохондрияны жекелеп бөлу жұмысы мынандай кезеңдерден тұрады.
1. Өсiмдiк ұлпаларын механикалық жолмен немесе гомогенизатор және пресс арқылы белгiлi бiр ортада жаншып, экстракты алынады.
2. Екi рет центрифугалау.
3. Тұнбаға түскен митохондрияны алғашқы қолданған орта арқылы жуу.
4. Жуылған митохондрия тұнбасы гомогенизацияланады.
Қазiргi кезде тыныс алу процестерiн физиологиялық және биохимиялық тұрғыда зерттеу молекулалық деңгейде жүргiзiлуде. Зерттеу деңгейлерi және зерттеу әдiстерi алға қойылған мақсатқа байланысты iрiктеледi. Егер де, зерттеу - молекулалық деңгейде жүргiзiлсе, онда белгiлi-бiр дәрежеде тазартылған ферменттiк препараттарды қолдану арқылы iске асады. Осының нәтижесiнде, жалпы тыныс алу процесiнiң жеке кезеңдерiне байланысты тотығу реакцияларының қосалқы және соңғы метаболиттерi туралы ақпараттарды алуға болады.
Тiрi организмерде өздiгiнен жүретiн барлық реакциялардың жүру жылдамдығы төмен. Бұл процестердiң жылдамдықтары спецификалық биологиялық катализаторлардың - ферменттердiң қатысуымен жоғарылайды. Ферменттер әр түрлi реакциялардың жылдамдығын бақылап, жалпы организмдегi зат алмасу құбылыстарын реттейдi.
Тыныс алу процесiнiң жүруiн митохондрия мембраналарында орналасқан ферменттiк жүйелер басқарады.
Тыныс алу құбылысын катализдейтiн ферменттер төрт топқа бөлiнедi:
1. Сутегiн активтендiретiн (дегидрогеназа) ферменттер
2. Оттегiн активтендiретiн (оксидаза) ферменттер
3. Сутегi электронын аралық тасымалдаушы ферменттер
4. Қосымша ферменттер.
Ферменттер арқылы жүретiн тотығу-тотықсыздану реакцияларына түсетiн тыныс алу субстраттары даярлық кезеңдi қажет етедi. Даярлық кезеңiнде субстрат молекулалары активтенiп, тотығу-тотықсыздану жүйесiнiң әсер етуiне қолайлы болады. Субстратты даярлау қосымша топты құрайтын ферменттердiң қатысуымен жүзеге асады. Бұл ферменттердiң ролi, негiзгi тотығу-тотықсыздану процестерiне қатысатын ферменттерiнiң қызметiне қосымша қызмет көрсету болып саналады. Алдын ала даярлық кезеңнен өтпеген тыныс алу субстраттары тотығу-тотықсыздану реакцияларына түспейдi, түскен жағдайда олардың реакцияға, өзгерiске түсу жылдамдықтары өте төмен болады.
Өсiмдiк организмiндегi тыныс алу процесiне қатысатын ферменттер тобы өте күрделi, белгiлi бiр қызметтi басқаруда бiр ғана фермент қатысып қоймай, химиялық табиғаты және әсер ету механизмдерi әртүрлi бiрнеше ферменттер қатысады.
Өсiмдiктердiң тыныс алуындағы ферменттiк жүйе, тек көптүрлiлiк принципiне сүйенiп қана қоймай, ферменттердiң молекулалық формаларының (изоэнзимдер) көптүрлiлiгiмен күрделенедi, мұның өзiнiң өте үлкен биологиялық маңызы бар. Осындай гетерогендi қасиетке байланысты өсiмдiктердiң тыныс алу аппаратының жұмыс iстеу қабiлетi жоғарылап, тыныс алу тiзбегiнде электрондарды әртүрлi жолдармен тасымалдау түрлерi пайда болады. Бұл принцип өсiмдiктегi катализдiк аппаратты белгiлi-бiр ерекшелiктермен қамтамасыз етедi, мұның өзi организмнiң тiршiлiк етуiнде, өзгергiштiкке бейiмделу қасиеттерiн тудырады. Өсімдiктерде кездесетiн катализдiк жүйенiң көптүрлi болуына байланысты, тыныс алу құбылысына қатысатын барлық ферменттердi анықтау әдiстерiн беру қиындық тудырады. Сондықтан да, тыныс алу процесiн катализдейтiн ең маңызды және негiзгi ферменттердiң өкiлдерiн анықтайтын әдiстер берiлiп отыр.
4.1.Бояркин әдісімен пероксидазаның активтілігін анықтау.
Пероксидаза екi түрлi қызметтi атқарады: пероксидазалық және оксидазалық. Пероксидазаның құрамында гем бар.
Пероксидазалық реакция жүргенде фермент әр түрлi субстраттарды тотықтырады: 1. барлық фенолдарды, 2. ароматты аминдердi, 3. иодты сутегiн, 4. кейбiр тез тотығатын қосылыстарды, мысалы, аскорбин қышқылы, нитриттер, т.б.
Бұл қосылыстарды пероксидаза сутек асқын тотығының қатысымен тотықтырады. Сутек асқын тотығы электрондарды өзiне қосып алып, тотықтырғыш қызметiн атқарады.
Бояркин әдiсiнiң негiзi тәжiрибелi ерiтiндiнiң белгiлi оптикалық тығыздыққа жететiн уақытын өлшеу. Субстрат ретiнде бензидин пайдаланылады, ол тотыққан кезде түсi көк қосылысқа айналады.
Құрал-жабдықтар және реактивтер: фарфор келiсi, колбалар, сүзгiш воронка, центрифуга, фотоэлектроколориметр (ФЭК), ацетат буферi, бензидин, сутегiнiң асқын тотығы (H2O), өсiмдiктiң тамыры мен жапырақтары.
Жұмыстың орындалуы: пероксидазаның активтiлігi өсiмдiктiң тамырында және жапырағында салыстырылады, сондықтан 50-100 мг тамыр және жапырақ өлшендiсi алынып, екi фарфор келiсiнде ацетат буферi қосылып езiледi. Одан кейiн гомогенаттар екi 25 мл-лiк өлшемдi колбаларға құйылып, буфермен өлшеу белгiсiне жеткiзiледi.Гомогенат 5-10 минут тұндырылған соң 10 минут 300 айналым/мин центрифугаға салынады немесе сүзгiш қағаз арқылы сүзiледi. ФЭК-дiң қалыңдығы 2 см екi кюветаға әрқайсысы 2 мл сүзінді, 2 мл буфер ерiтiндiсi, 2 мл бензидин ерiтiндiсi құйылады. Кюветалар ФЭК-ға қойылады, олар арқылы өтетiн қызыл сәуленің мөлшерi теңестiрiледi, сонда гальванометрдiң тiлi нольге келедi. Содан кейiн ФЭК-дiң оң жақтағы барабаны 0,250 көрсеткiшiне қойылады, сол кезде гальванометрдiң тiлi нольден қозғалады. Сол жақтағы кюветаға 2 мл су құйылады, ал оң жақтағы кюветаға 2 мл 0,03%-к сутек асқын тотығы құйылады. Сутек асқын тотығы кюветаға құйыла бастағанда секундомердi қосады. Тәжiрибе сұйықтықтың оптикалық тығыздығы 0,250 жеткенде, гальванометрдiң тiлi нольге келедi, сол мезгiлде секундомер тоқтатылады. Анықтау осылай 3 рет өткiзiледi, орташа мәнi алынады.
Ферменттiң активтiгi мына формуламен есептеледi:
Д ()
A = -----------------
td
Д - оптикалық тығыздық = 0,250
d - кюветаның қалыңдығы, 2 см
t - уақыт, сек
- сүзінді көлемi мен өлшендiнiң арасындағы өзара қатынасы, 25 мл/0,05 г = 500
- сүзіндіні қосымша сұйылту дәрежесi
- реакциялық қоспадағы шайманың сұйылту дәрежесi = 4.
Сөйтiп, тәжiрибе нәтижесi өсiмдiктiң 1 г салмағының 1 сек iшiнде оптикалық тығыздықтың өзгертуiн көрсетедi.
Реактивтер дайындау:
ацетат буферi, рН 5,4; 0,03% Н2О2
бензидиндi дайындау: көлемi 200 мл колбаға шамасы 100 мл дистилденген су құйылады, оған 2,3 мл (2,4 г) мұзды сiрке қышқылы және 184 мг бензидин қосылады. Колбаны баняда үзбей шайқап тұрып, 50-60° дейiн ысытады. Бензидин толығымен ерiген соң (10-15 мин) колбаға 5,45 г Na(CH3COO)2 қосылады, ол ерiген соң колбаны суытып, сумен өлшеу белгiсiне жеткiзедi. Сұйықтықты қараңғы жерде 7-10 күн сақтауға болады.
4.2. Полифенолоксидазаның активтілігін анықтау.
Полифенолоксидаза оттегiнiң қатысуымен орто-дифенолдардың тотығуын катализдейдi, нәтижесiнде орто-хинондар мен су түзiледi. Полифенолоксидазаның құрамында мыс бар, фермент қызметiнiң негiзiнде шамасы мыс атомының қайтымды тотығуы жатады:
4Cu+ + 4H+ + O2 = 4Cu++ + 2H2O
Мыс оттегiмен комплекс түзуі мүмкін. Бояркин әдiсiнiң негiзi тәжiрибелi ерiтiндiнiң белгiлi оптикалық тығыздыққа жететiн уақытын өлшеу. Субстрат ретiнде пирокатехин пайдаланылады. Пирокатехин полифенолоксидазаның қатысуымен орто-хинонға айналады. Бiрақ бұл орто-хинон түссiз қосылыс, оның мөлшерiн анықтау мүмкiн емес. Сондықтан, реакциялық қоспаға пара-фенилендиамин қосылады, ол орто-хинонмен реакцияға түсiп, түстi күлгiн қосылыс түзедi, оның оптикалық тығыздығы ФЭК-де жасыл жарықта өлшенедi.
Құрал-жабдықтар және реактивтер: фарфор келiсi, колбалар, сүзгiш воронка, центрифуга; ФЭК, фосфат буферi, парафенилдиамин, пирокатехин, өсiмдiк тамыры мен жапырақтары.
Жұмыстың орындалуы: Полифенолоксидазаның активтiгi өсiмдiктiң тамырында және жапырағында салыстырылады, сондықтан 500-1000 мг тамыр және жапырақ өлшендiсi алынып, екi фарфор келiсiнде фосфатты буфер қосылып езiледi. Одан кейiн гомогенаттар екi 25 мл-лiк өлшемдi колбаларға құйылып, буфермен өлшеу белгiсiне жеткiзiледi. Гомогенат сүзгiш қағаз арқылы сүзiледi немесе центрифуганы пайдаланады (3000 айн/мин).
ФЭК-дің қалыңдығы 2 см екi кюветасына әр қайсысына 2 мл сүзінді, 2 мл буфер ерiтiндiсi, 2 мл парафенилендиамин ерiтiндiсi құйылады. Кюветалар ФЭК-ға қойылады, олар арқылы өтетiн жасыл сәуленiң мөлшерi теңестiрiледi. Одан кейiн ФЭК-дің оң жақтағы барабаны 0,250 көрсеткiшке қойылады, сол кезде гальванометрдiң тiлi нольден қозғалады, сол жақтағы кюветаға 2 мл су құйылады, ал оң жақтағы кюветаға 2 мл пирокатехин, ол құйыла бастағанда секундомер қосылады.
Тәжiрибе сұйықтықтың оптикалық тығыздығы 0,250 жеткенде, гальванометрдiң тiлi нольге келедi, сол мезгiлде секундомер тоқтатылады.
Анықтау осылай үш рет өткiзiледi, орташа мәнi алынады. Ферменттiң активтiгi мына формуламен есептеледi:
Д ()
A = -----------------------------
td
Д - оптикалық тығыздығы = 0,250
d - кюветаның қалыңдығы, 2 см
t - уақыт, сек
- шайма көлемi мен өлшендiнiң арасындағы өзара қатынасы, 25 мл/0,5 г = 50
- шайманы қосымша сұйылту дәрежесi
- реакциялық қоспадағы шайманың сұйылту дәрежесi = 4.
Сөйтiп, тәжiрибе нәтижесi өсiмдiктiң 1 г ылғалды салмағының 1 сек iшiнде оптикалық тығыздықтың өзгертуiн көрсетедi.
Реактивтердi даярлау:
фосфатты буфер, рН 7,0 -7,4;
пирокатехиннiң 0,1%-к ерiтiндiсi;
0,02% парафенилдиамин тәжiрибе жүргiзудiң алдында 0,01 н қымыздық қышқылы ерiтiндiсiнде дайындалады.
4.3. Спектрофотометрді қолданып аскорбиноксидазаның активтілігін анықтау.
Аскорбиноксидаза аскорбин қышқылының тiкелей тотығуын катализдейдi, аскорбин қышқылы сутектiң екi протонынан айырылады да дегидроформасына айналады. Сөйтiп, аскорбин қышқылы сутектi тасымалдаушы ретiнде тыныс алу метаболизмiне қатысады.
Аскорбин қышқылы ультракүлгiн сәулесiн сiңiредi, = 279 нм. Тәжiрибе басында сұйықтықтың оптикалық тығыздығы жоғары болады, ал тотығу реакциясының арқасында оның оптикалық тығыздығы төмендейдi.
Бұл әдiстiң негiзi оптикалық тығыздықтың 10 мин iшiнде төмендеуiн анықтау.
Құрал-жабдықтар және реактивтер: фарфор келiсi, колбалар, сүзгiш воронка, центрифуга, спектрофотометр (СФ), фосфат буферi, тұз қышқылы, магний сульфаты, аскорбин қышқылы, өсiмдiк тамыры мен жапырақтары.
Жұмыстың орындалуы: 0,2-1 г өсiмдiк өлшендiсiн суық фарфор келiсiнде суық фосфат буферiн (pH 7,4) қосып езедi. Гомогенатты көлемi 25 мл өлшемдi колбаға құйып, буфермен белгiсiне жеткiзедi. Одан кейiн гомогенатты жақсылап араластырып, сүзгiш қағаз арқылы сүзедi.
Ферменттiң активтiгiн анықтау үшiн СФ-дiң екi кюветасына мына қосылыстар құйылады:
Бақылау кюветасы:
0,005 M HCL - 0,1 мл
0,005 M MgSO4 - 0,1 мл
Фосфатты буфер, рН 6,2 - 1 мл
сүзінді- 1 мл
дист. су - 0,8 мл
Тәжiрибе кюветасы:
0,005 M HCL - 0,1 мл
0,005 M MgSO4 - 0,1 мл
Фосфатты буфер - 1 мл
сүзінді- 1 мл
аскорбин қышқылы 1,2 10[4] М - 0,8 мл
Аскорбин қышқылы құйған кезде секундомердi қосады. Бiрiншi өлшеу 30 сек өткен соң өткiзiледi, қалғандарын - 1 мин сайын 10 мин iшiнде, тәжiрибе нәтижесi мына формуламен есептеледi:
Д·d·V1·n1
A = ----------------------------,
n·V
A - ферменттiң активтiгi
Д - оптикалық тығыздықтың төмендеуi
n - өлшеп алынған өсiмдiк салмағы
d - сүзіндінің жалпы көлемi (25 мл)
V - сүзіндінің кюветадағы көлемi (0,8 мл)
V1 - кюветадағы сұйықтықтың көлемi (3 мл)
n1 - 0,8 мл гомогенаттағы өсiмдiк өлшендiсi.
4.4. Гликолиз ферменті альдолазаның активтілігін анықтау
Альдолаза ферментi фруктоза-1,6 - дифосфатты 3-фосфоглицерин альдегидiне және фосфодиацетонға ыдырату реакциясын катализдейдi.
Альдолазаны энзимдi әдiс арқылы анықтау, қосымша фермент ретiнде глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназаны (ГАФД) қолдануға негiзделген.
Құрал-жабдықтар және реактивтер: 0,1 М триэтаноламиндi буфер рH 8,0 2мМ фруктозо-1,6-дифосфат, 50 мМ НАД+; 50 мМ натрий арсенаты, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; спектрофотометр, өсiмдiктен экстракциялау және тазарту арқылы алынған белок фракциясы.
Жұмыстың орындалуы: Спектрофотометрдiң кюветаларына 2мл 0,1 М триэтаноламин буферiнрH 8,0, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (белсендiлiгi 30 бiрлiкте), 0,2 мМ фруктоза-1,6-дифосфат, 3мМ НАД+ және 5мМ натрий арсенаты құйылады. Зерттелетiн затты құйғанда, кюветадағы сұйықтықтың жалпы көлемi 3 мл болуы керек. Реакция 30-50 мкл альдолаза ерiтiндiсiн қосқаннан кейiн жүредi, жарық толқынының 340 нм ұзындығында оптикалық тығыздықтың артуы байқалады.
Альдолазаның активтiлiгiн мына формула арқылы анықтайды:
А=Е·V/6,22·n,
Мұнда, А -альдолазаның активтiлiгi (мкмоль НАД·Н·мин[-1]·1 мг белок[-1])
Е - оптикалық тығыздықтың өзгерiсi
V - кюветадағы белок көлемi
6,22 - 340 нм толқын ұзындығындағы пиридиндi нуклеотидтердiң тотықсыздануындағы микромолярлы коэффициентi.
4.5. Кребс циклінің ферменті малатдегидрогеназаның
активтілігін анықтау.
Малатдегидрогенеза (МДГ) ферментi негiзiнен митохондрия матриксiнде кездеседi. Бұл фермент Кребс циклiнде алма қышқылын (малат) қымыздық-сiрке қышқылына дейiн (ҚСҚ) тотықтырады.
НАД[+] ---------НАД·Н+H[+]
Малат---------------------------------------- ҚСҚ
МДГ
Берiлiп отырған тәжiрибедегi жұмыс малатдегидрогенезаның активтiлiгiн екi бiрдей субстратты (алма және қымыздық-сiрке қышқылын) қолдану арқылы анықтауға негiзделген.
Құрал-жабдықтар және реактивтер: Спектрофотометр, бөлiнiп алынған митохондриалды фракция, 0,1% тритон детергент х-100, трис-HCl буфер рН 7,5; MgCl2·6Н2O, НАД·Н, қымыздық-сiрке қышқылының калий тұзы.
Жұмыстың орындалуы: Спектрофотометр кюветасына 2,6 мл трис - HСl буферiн (рН 7,5), 0,1 мл MgCl2·6Н2O, 0,1 мл НАД·Н коферментi және 0,1 мл экстрактының митохондриялды фракциясын қосады. Бақылау кюветасына қымыздық-сірке қышқылының калий тұзын қоспай тұрып, оның оптикалық тығыздығын 340 нм толқын ұзындығында бiрнеше рет өлшейдi. Онан кейiн, кюветаға 0,1 мл қымыздық сiрке қышқылының калий тұзын қосып, 3 мин аралығында 340 нм толқын ұзындығында оптикалық тығыздықтың төмендеуiн анықтайды. МДГ активтiлiгiн алдыңғы жұмыста (4.4.) көрсетiлген формула бойынша есептейдi.
4.6. Тыныс алу коэффициентін анықтау
Құрал-жабдықтар : эвдиометр, өнген бидай тұқымдары.
Жұмыстың орындалуы: Өнген бидай дәндерін немесе 1-2 өскінді эвдиометрдің үстіңгі бетіне салып ( көлемі 50 мл) өскіннің астыңғы жағын мақтадан жасалынған тығынмен эвдиометрге бекітеді.
Эвдиометрді кіші кристализаторға орналастырып, сынаппен жабады. Эвдиометрдің ішкі бөлігіне жұқа каучукті түтікше орналастырады, оның екі жақ ұшы да ауамен байланысып тұруы үшін: бір жақ үшы эвдиометр түтікшесінің ішінде, екіншісі сыртында болады. Эвдиометрдегі сынаптың биіктігі 2 см тең болу керек. Содан кейін түтікшені шығарады да, иілген шыны түтікше арқылы эвдиометрге су құяды. Катализатордағы және прибордағы сынап деңгейі бірдей болу үшін, приборды штативке бекітеді. Эвдиометрдегі температура ауа температурасымен теңескеннен кейін, сулы-ауалы менисктің төменгі шеті арқылы алғашқы есептеуді жүргізеді. Дәл осындай жағдайда дайындалған, тек ішінде өсімдігі жоқ бақылаушы эвдиометрді, тәжірибелік эвдиометрге паралельді орналастырады. Бақылаушы эвдиометрдің көлемі бірінші эвдиометрден 2-3 есе үлкен болуы керек, яғни 100-150 мл.
Бақылаушы эвдиометр тәжірибе кезіндегі ауа қысымының өзгеруіне байланысты, газдар көлемінің өзгеруінің көрсеткіші болады. Бақылаушы эвдиометрдегі өзгерістердің проценттік көрінісі, бұл бүкіл тәжірибе кезінде алынған нәтижелер қателіктерінің түзетімі болып табылады.
Тәжірибенің ұзақтығы 12-24 сағат аралығында, қараңғыда жүргізіледі. Тәжірибе аяғында екінші рет есептеу жұмысын өткізеді, онан кейін эвдиометрге пинцетпен қаллий сілтісінің кішкене бөлшегін салып, оны 5 минут аралығында араластырып отыру қажет. Қалий сілтісі СО2 газын сіңіреді, одан эвдиометрдегі сынап деңгейі жоғарылайды. Эвдиометрді көмірқышқыл газы толық сіңірілгенге дейін және ондағы температура сыртқы ортаның температурасымен теңескенге дейін 15 минуттай қозғамайды, онан кейін үшінші есептеу жұмысы жүргізіледі. Тыныс алу коэффицентін мына формула бойынша есептейді:
V2- V3
RQ = ----------------
V1K-V3
Мұнда, V 2- тәжірибе аяқталғаннан кейінгі екінші есептеу қорытындысы ( мл).
V 3- эвдиометрге калий сілтісін енгізгеннен кейінгі үшінші есептеу қорытындысы ( мл).
V 1 - тәжірибенің басында өткізілген бірінші есептеу қорытындысы.
К- бақылау тәжірибесінде қысымның өзгеруін түзету.
Есептеу мысалы: Алғашқы есептеу эвдиометр бойынша 48,2 көрсетсе, калий сілтісін енгізгенге дейінгі екінші есептеу 46,3 мм-ге, ал үшінші есептеуде 42,6 мл көрсетеді. Барометрлік қысымның өзгеруіне байланысты, бақылаушы эвдиометрдегі газдың көлемі 2,23 % төмендеуінен көрсетсе, К = 0,9768-ге тең болады. Қысымның өзгеруіне байланысты түзету коэффициентін (К) былай есептейді: 100 мл газдың алғашқы көлемі, қысымның өзгеруіне байланысты 97,68 мм-ге дейін кішірейеді, ал 1 мл газ көлемі осы жағыдайда 0,9768 - ге дейін өзгереді, Сондықтан, осы ақырғы сан эвдиометрдегі газдың алғашқы есепке алынған көлеміне көбейтілетін түзету саны болып есептеледі.Алынған шамаларды қойып, формула бойынша тыныс алу коэффициентін анықтайды.
46,3-42,6
RQ = --------------------------- = 0,83
48,2 0,9768 - 42,6
+ Тыныс алу қарқынын бөлінген көмірқышқыл газының мөлшері арқылы анықтау.
Тыныс алу қарқынын бөлінген көмірқышқыл газының мөлшері арқылы анықтайды. Тыныс алуда бөлінген көмірқышқыл газының мөлшерін Петтенкофер түтігі бойынша анықтайды.
Түтік диаметрі 100 мл барий сілтісінің ерітіндісі сиятындай болуы керек. Сіңіретін түтікті U- пішіндес (2) түтікпен жалғастырады. U-пішіндес түтік ішінде өнген бидай тұқымы салынып, оны (3) Тищенко шыны ыдысымен жалғайды. Тищенко шынысы натрон извесінен толтырылады, өнген бидай арқылы өткен ауа, Тищенко шынысына көмірқышқыл газынан босайды да, ауа аспиратор арқылы үш бөлімі сумен толған Вульф (4) шынысына өтеді.
Құрал жабдықтар және реактивтер: Петтенкофер приборы,пипеткалар, колбалар, воронка, 0,1 н барий сілтісі; 0,1 н тұз қышқылы; 0,5% фенолфталеин ерітіндісі.
Жұмыстың орындалуы: 25-50 г өнген бидай тұқымы U- пішінді түтікке салынады. Бидай салынағн түтіктің бір ұшын натронды извес салынағн Тищенко шыны сауыттарымен, ал екінші ұшын Петтенкофер түтікгімен жалғайды (12 суретте көрсетілгендей). Петтенкофер түтігіне Мора Пипеткасымен 50 немесе 100 мл 0,1 Н барий сілтісін құяды. Петтенкофер түтігінің екінші ұшын Вульфа шыны сауытымен жалғайды. Осындай ретпен жиналған аппарат 1 минутта ауаның 30-40 копіршігін сорады. Барий сілтісі көмірқышқыл газын сіңіріп, оны көмірқышқыл барий түрінде тұнбаға түсіреді. Тәжірибе 1 сағат мөлшерінде жүргізіледі. Тәжірибе аяқталған кезде Петтенкофер түтігінің екі жағын қысқыш арқылы бекітіп, түтік ішіндегі тұнбалы ерітіндіні араластыра отырып 100 мл колбаға құйып, тығын мен жауып қояды. Тұнбаға толық түскеннен кейін, Мора пипеткасы арқылы 10 мл барий сілтісін алып оны 0,1 н тұз қышқылымен, фенолфталеинді қосып титрлейді. Осыған параллельді тұқым салмай, бақылау тәжірибесі жүргізіледі.
Бір сағатта 100 г өнген бидай тұқымының тыныс алуында бөлінген көмірқышқыл газының мөлшері мына формула бойынша есептеледі:
(a-в) К 2,2 V 100
-----------------------
V1 C
Мұнда, (а-в)-бақылау және негізгі тәжірибедегі 0,1 н HCl ерітіндісінің титрлеуге кеткен мөлшері.
K- титрдің түзету коэфициенті (0,1 HCl)
V- Петтенкофер түтігіндегі Ва (ОН)2 көлемі (мл).
V1- титрлеуге алынған Ва (ОН)2 көлемі (мл).
C-U-пішіндес түтікке салынған бидай тұқымының салмағы.
2,2-титрлеуге кеткен, тұз қышқылының көлемін есептеу коэффиценті ( мг; СО2); 1 мл 0,1 н тұз қышқылының ерітіндісі 2,2 мг СО2 қатынасына тең.
Өсімдіктердің тыныс алуы кезінде бөлген көмірқышқыл газын Петтенкофер түтігі арқылы ғана емес, ішіне сілті салынған U-пішіндес түтік арқылы да анықтауға болады. Бөлінген көмірқышқыл газы U- пішіндес түтіктің ішінде сіңіріледі, сондықтан да оның мөлшерін тәжірибеге дейін және тәжірибеден кейін түтікті өлшеу арқылы есептеуге болады. Өсімдіктердің тыныс алуын, жоғарыда көрсетілген әдіс арқылы анықтау үшін, бидай тұқымынан басқа да өсімдіктерді, немесе олардың жеке дене мүшелерін пайдалануға болады.
4.8.Диск-электрофорез арқылы малатдигидрогенеза ферментінің изоферменттік құрамын анықтау.
Полиакриламидті гелді қолданып диск-электрофорез арқылы белокты бөлу әдісін 1959 жылы Реймонд және Вейнтрауб (Raymond, Weintraub, 1959) алғашқы болып енгізген, кейін басқа ғалымдар (Davis,1964: Гофман, 1965 ; Мухамеджанов ,1967) бұл әдісті модификациялады. Қазіргі кезде бұл әдіс энзимологияда кеңінен пайдаланылып жүр.
Құрал-жабдықтар және реактивтер:
центрифуга, электрофорез қондырғысы, 0.01 М фосфатты буфер ( Рн 7.4), сефадекс Г-25, 0.1 н HCI, трис-оксиметиламинометан, акриламид, метиленбисакриламид, рибофлавин, гликокол, сахароза, никотинамиддинуклеотид (НАД), алма қышқылы, фенозинметасульфат, тетразольді нитракөк.
Жұмыстың орындалуы:
Зерттеу жұмысын жүргізу үшін қызғалдақ немесе басқа өсімдіктердің пиязшығы алынады. Малатдегидрогенеза (МДГ) ферментінің изоферменттік құрамын электорфорез әдісі бойынша анықтау жұмысы үш кезеңде жүргізіледі:
* өсімдіктен ферментті экстрактыны алу
* диск-электрофорез арқылы ферментті бөлу
* инкубациялық қоспада ферменттің изоферменттік құрамын анықтап, бояу.
Өсімдіктен фермент экстрактысын алу.
Пиязшықты төменгі температурада (2-4С) жеке мүшелерге бөлшектеп, 15-20г өсімдікті 30 мл 0.01 М фосфатты буферде (Рн 7.4) гомогенизациялайды. Алынған гомогенатты 15 минут 8000 мин/айн. центрифуга арқылы жеке фракцияларға бөледі. Центрифуга пробиркасының түбінде өсімдік қалдықтары тұнбаға түсіп , оның үстіндегі ерітіндіні басқа пробиркаға құйып, ондағы белокты күкірт қышқыл аммоний арқылы тұнбаға түсіреді. Белок тұнбасын қайтадан 15 минут 8000 мин/айн. центрифуга арқылы бөледі. Центрифуга пробиркасының түбіндегі тұнбаға түскен белокты үстіңгі сұйықтан бөліп алып, оны 10 мл 0.01 М фосфатты буферде ерітеді.
Төменгі молекулалы қоспалардан бөлу үшін сефадекс гелі арқылы (гелді түтіктен) өткізіп, тазартады. Тазартылған белокты диск-электрофорез арқылы полиакриламидті гелде бөледі.
Диск-электрофорез арқылы ферменттерді бөлу.
Электрофорезді жүргізуге қажетті полиакриламидті гелді даярлайтын негізгі ерітінділер алдын - ала жасалынып, тоңазытқышта сақталады.
Негізгі ерітінділер:
А) 0.1 н тұз қышқылы - 48 мл
трис-оксиметиламинометан - 36.6 г
дистилді су - 100 мл.
С) акриламид - 28 г
метиленбисакриламид - 0.735г
дистилді су -100мл.
Е) рибофлавин - 4 мг
дистилді су -100мл.
Д) сефадекс (Г-25) - 3г
дистилді су -100 мл.
Бұл негізгі ерітінділерден, электрофорезді қояр алдында, электрофорездің шыны түтіктерін толтыратын жұмысқа қажетті ерітінділер даярланады.
Жұмысқа қажетті ерітінділер:
* Ұсақ саңылаулы гелді даярлау үшін:
А- 1 көлем
С - 2 көлем
Е - 1 көлем
су - 4 көлем
0.05 % күкірт қышқыл аммоний
* Ірі саңылаулы гелді даярлау үшін:
А - 1 көлем
Е - 2 көлем
* Электрофорезді жүргізуге қажетті буферлі ерітіндіні (Рн - 8.3)
даярлау үшін:
трис - 6г
гликокол -28.8 г
дистилді су - 1 л
Электрофорезге қажетті гель түтіктерін (ұзындығы - 75 мм, диаметрі- 5 мм) органикалық шыныдан жасалған арнайы қондырғыға тігінен орналастырып, ішіне жоғарыда көрсетілген ерітінділерді пайдаланып, 65 мм биіктікке дейін кіші саңылаулы гелмен толтырады. Гель толық полимерленгеннен соң, оның үстіне 0.1 мл ірі саңылаулы гелдің ерітіндісін құяды. Бұл гель толық полмерленген кезде 40% сахарозамен (1:1) араласқан тазартылған белок ерітіндісі гель түтіктерінің ішіне енгізіледі. Түтіктерді 13 суретте көрсетілгендей электрофорез қондырғысының үстіңгі ыдысындағы саңылауларына бекітіп, электрофорез қондырғысының үстіңгі және астыңғы ыдыстары Трис-гликокол буферімен толтырылады (сурет13).
Электрофорез қондырғысын толық жинағаннан кейін, қондырғы амперметр арқылы тоқ көзіне қосылып, электрофорез 2 сағат аралығында жүргізіледі. Бір түтіккен берілетін тоқ күші 3 ма, кернеу 400в.
Инкубациялық қоспада ферменттің изоферменттік құрамын анықтап, бояу.
Электрофорездік бөліну толық аяқталғаннан соң қондырғы тоқ көзінен толық ажыратылып, қондырғының үстіңгі ыдысындағы шыны түтіктер суырылып алынады. Өте жіңішке болат сымды түтік қабырғасы мен гель арасынан өткізе отырып, гелді түтіктен шығарады. Түтіктен босаған гелді малатдегидрогеназа ферментін анықтайтын инкубациялық қоспаға салады (басқа да дегидрогеназа ферменттерін анықтап, бояйтын инкубациялық қоспалар бар).
Малатдегидрогеназа ферментін анықтайтын инкубациялық қоспа құрамы мынандай: 0.5 мл НАД (9 мг/мл), 0.5 мл алма қыщқылы (30мг/мл), 0.2 мл феназинметасульфат (50мг/мл), 0.2 мл тетрзольді нитракөк (3мг/мл), 4.6 мл 0.1 М фосфатты буфер (рН 7.4). Инкубациялық қоспаның жалпы көлемі 6 мл.
Инкубациялық қоспадағы гелдерде 25-30 С температурада, 20 минут аралығында малатдегидрогеназаның изоферменттік формалары көк түсті жолақ түрінде боялып шығады (сурет 14).
МИНЕРАЛДЫ ҚОРЕКТЕНУ
Өсiмдiктердiң қалыпты өсуiне минералды элементтер қажет. Минералды қоректену өсiмдiктер физиологиясының бiр бөлiмi. Бұл бөлiм минералды элементтердiң тамыр арқылы жалпы организмге өтiп физиологиялық, биохимиялық әсер ету механизмдерiне байланысты мәселелердi зерттейдi.
Өсiмдiктердiң өсуi мен дамуына қажеттi минералды элементтер екi топқа бөлiнедi: макро және микроэлементтер. Бұл элементтер клетка метаболизмiнде, физиологиялық тұрғыда жан-жақты роль атқарады: бiрiншiден, ферменттiк реакцияларға кофактор немесе активатор ретiнде қатысады, екiншiден, метаболизмде негiзгi роль атқаратын көптеген органикалық заттардың құрылысына кiредi (белоктар, нуклеин қышқылдары, липидтер, пигменттер және т.б.), үшiншiден, протоплазманың құрылымының көптеген қасиеттерiн анықтайды және т.б. Минералды элементтердiң физиологиялық, биохимиялық ролiн зерттеп бiлу, өсiмдiктердiң қоректенуiне байланысты көптеген теориялық және практикалық мәселелердi шешуге жол ашады. Осыған байланысты, бұл тарауда, өсiмдiктер физиологиясында минералдық қоректенудi анықтайтын кейбiр әдiстер мен тәжiрибелер берiлiп отыр.
5.1. Өсімдіктерді толық және толық емес сулы қоректік ортада өсіру әдісі.
Вегетациялық өсiру тәсiлi - өсiмдiктердiң қоректенуiндегi белгiлi бiр элементтердiң жеке әсерiн немесе қоректiк ортада басқа да элементтермен бiрiге әсер етуiн анықтайтын қолайлы әдiстердiң бiрi. Сол себептi, осы жұмыста өсiмдiктердi толық және толық емес сулы қоректiк ортада өсiрудiң тәсiлi берiлiп отыр.
Құрал-жабдықтар және реактивтер: ерiтiндiлерге арналған шыны ыдыстар, таразы, тегiс табақшалар, пинцет, қайшы, ине, сызғыш, тығындар, дәке, жуан жiп, фильтр қағаз, ағаш таяқша, өсiмдiктердi өсiруге арналған ыдыстар, қағаздан жасалған қапшық, бұрғы, өсiмдiктер және өсiмдiк тұқымдары, Ca(NO3)2; KH2PO4, MgSO4; Kcl; Fe2Cl6; NaH2PO4; NaCl; CaSO4·2H2O.
Жұмыстың орындалуы:
Жұмыстың жалпы орындалуы мына жоспар бойынша жүредi.
1. Дайындық жұмысы: ыдыстарды бор қышқылы немесе хромпикпен жуып, залалсыздандыру, себiлетiн тұқым сапасын анықтау, қоректiк қоспаларға арналған ерiтiндiлердi дайындау және есептеу;
2. Тәжiрибе қоюға даярлану: әртүрлi жағдайдағы тәжiрибеге арналған қоректiк қоспа дайындау, өсiмдiктердi егу, өсiмдiктердегi алғашқы өзгерiстердi көрсететiн тәжiрибе нәтижелерiн жазу үшiн кестелер құру;
3. Тәжiрибенi қою: жалпы тәжiрибенi және жеке өсiмдiк көлемдерiн суретке түсiру, өсiмдiктердiң жер бетi бөлiктерiн және тамыр жүйесiн өлшеу, жалпы өсiмдiктiң сулы және құрғақ салмағын анықтау;
4. Өсiмдiктердi бақылау және оларды күту; өсiмдiктердiң мүшелерiн өлшеу (сабақ, жапырақ), сiңiрiлген су мөлшерiнiң көлемін анықтау, ерiтiндiлердi ауыстыру және желдету, өсiмдiктi байлау, өсiмдiк дамуының жекеленген кезеңдерiн күнделiкке жазу; тәжiрибе нәтижелерiн таблицаларда және диаграммаларда салыстырмалы түрде көрсету.
Тәжiрибе отыз немесе одан да көп күнге созылады. Тәжiрибелер лабораторияларда немесе студенттердiң жазғы практикасы өтетiн биологиялық станцияларда жүргiзiледi. Қысқы уақытта, табиғи жарық жеткiлiксiз болған жағдайда, тәжiрибе қосымша электрлiк жарықтануды қолдану арқылы жүзеге асады.
Тәжiрибеде жеке өсiмдiктердi қоректiк ортада өсiру үшiн 0,5-1 литр көлемдегi, аузы кең шыны ыдыстарды алып, олардың аузын жайпақ тығындармен жауып, тығында үш саңылау жасалынады: бiрiншiсi - өсiмдiктi орналастыруға, екiншiсi - қоректiк ортаға ауаны үрлеуге арналған шыны түтiкке, үшiншiсi - өсiмдiктi байлап бекiтуге қажеттi ағаш таяқшаға арналған.
Өсiмдiктi өсiретiн ыдыстардың сыртын екi қабатты, қағаздан немесе дәкеден жасалынған қапшықпен жабады. Мұндай қапшықтар суретте көрсетiлгендей, iшкi жағынан қара түстi (тамыр жүйесiн қараңғылау үшiн), сырт жағынан ақ түстi (жарықты шағылыстыру үшiн) дәкемен жабылады.
Осындай жолмен дайындалған және әртүрлi қоректiк орта құйылған ыдыстарға өсiмдiктердi отырғызып, бiрнеше апта бойы бақылаулар жүргiзiледi. Бақылаудағы өсiмдiктер толық қоректiк ортада өсiрiлсе, тәжiрибелiк өсiмдiктер үшiн қоректiк орта құрамындағы кейбiр қосылыстар алынып тасталынады. Толық қоректiк қоспа ретiнде, лабораториялық зерттеулерде белгiлi, кеңiнен қолданылып жүрген Кноп қоспасын пайдалануға болады (Кноп қоспасынан басқа, өсiмдiктердiң қалыпты өсуiн қамтамасыз ететiн басқа да, толық қоректiк орталар бар). Өсімдіктер биотехнологиясында өсімдік клеткаларын жасанды қоректік ортада өсіруде кеңінен пайдаланылып жүрген кейбір қоспа түрлері 6-7 кестелерде беріліп отыр.
Кноп қоспасының құрамы 1- кесте
Тұздардың аты
Химиялық формуласы
1 л судағы г. мөлшерi
1
Азотқышқылды кальций
Ca(NO3)2
1,00
2
Бiрiншiлiк фосфор қышқылды калий
KH2PO4
0,25
3
Күкiрт қышқылды магний
MgSO4·7H2O
0,25
4
Калий хлоридi
KCl
0,125
5
Темiр хлоридi
Fe2Cl6
0,0125
Кноп қоспасынан немесе басқа қоспалардан, өсiмдiктiң өсуiне қажеттi кейбiр элементтердi алып тастау арқылы, толық емес қоректiк ортаны алуға болады. Мысалы, қоспадан KH2PO4 (фосфор элементiн), немесе KСl (калий элементiн) немесе Ca(NO3)2 (азот элементiн) алып тастау арқылы, толық емес қоспалардың түрлерi дайындалады. Толық емес қоректiк ортаның құрамы қойылатын тәжiрибенiң мақсатымен және бағытымен анықталады. Бұл тәжiрибенiң негiзiн пайдалана отырып, өсiмдiктердi толық және толық емес сулы қоректiк орталарда өсiру арқылы, минералды қоректену процесiне байланысты әртүрлi варианттардағы тәжiрибелiк жұмыстарды қоюға болады.
Минералды қоректенудi зерттеуде, ересек өсiмдiктермен қатар өсiмдiк тұқымдары да қолданылады. Өнген өсiмдiк тұқымдарын толық және толық емес қоректiк сулы орталарда өсiру үшiн, аузы парафинделген көп саңылаулы дәкемен жабылған ыдыстар пайдаланылады. Тәжiрибе схемасы бойынша, 15 суретте көрсетiлген ыдыстар толық және толық емес қоректiк қоспалармен толтырылып, парафиндi дәке бетiндегi саңылауларға өңген тұқымдарды (бидай, бұршақ, зығыр, лобия т.б.), ұзындығы 1,5 см болып келетiн тамырлары арқылы орналастырады, тамыр сулы ортаға батып тұруы қажет. Күнделiктi бақылаулар жүргiзу арқылы, қоректiк ортаның (жеке элементтердiң) өсiмдiкке тигiзетiн әсерiн анықтауға болады. Минералды заттардың өсiмдiкке тигiзетiн әсерiн, олардың дене мүшелерiнiң ұзындықтарын, көлемдерiн, салмақтарын салыстырмалы өлшеу арқылы анықтайды. Сонымен қатар, өсiмдiктердiң даму сатыларын және әртүрлi физиологиялық процестердiң жүру қарқынын зерттеуге байланысты, минералды қоректенудiң бұл процестерге, жалпы метаболизм және даму бағыттарына тигiзетiн әсерiн де зерттеуге болады.
5.2. Микроэлементтері бар сулы қоректік ортада тәжірибелерді қою.
Микроэлементтер өсiмдiк тiршiлiгiнде маңызды роль атқарады. Өсiмдiктер өсетiн қоректiк ортада олардың жетiспеуi, өсiмдiктердiң өнiмдiлiгiн төмендетiп, өсiп-дамуын тежейдi. Микроэлементтердiң өсiмдiктерге тигiзетiн әсерiн зерттеу Їшiн, қоректiк сулы ортада әртЇрлi тәжiрибелер қойылып жүргiзiледi. Тәжiрибенiң нәтижесi көптеген факторлерге тәуелдi: тұқымның тазалығына, өну қарқынына, ерiтiндiлердi даярлайтын тұздар мен дистилденген судың тазалығына, температураға т.б.
Құрал-жабдықтар және реактивтер: алдын ала даярланған өсiмдiктi өсiруге арналған ыдыстар, өсiмдiк тұқымдары, Кноп қоспасы (қоспа құрамы алдыңғы жұмыста берiлдi), микроэлементтер (H3BO3, MnSO4).
Жұмыстың орындалуы:
Алдын ала залалсыздандырылып, жуылған ыдыстарға 2-шi кестеде көрсетiлген әртүрлi құрамдағы қоректiк орталар құйылады. Онан кейiн ыдыстың бетi көп саңылаулы парафинделген дәкемен жабылады. Әрбiр ыдысқа қоректiк орта құрамын және тәжiрибе үлгiлерiн көрсететiн этикетка жапсырылады.
Залалсыздандырылған, жуылған бiркелкi өнген 50-100 тұқымды таңдап алып, ыдыс бетiндегi дәке саңылауларына тамырлары арқылы орналастырады (тамыр ұзындығы 1-1,5 см болу керек).
Тәжiрибе мына схема бойынша қойылады. 2-кесте
Қоректiк ортаны
Микроэлемент мөлшерi 1 л/мг
Ыдыстар саны
Құрамы
Бор
марганец Mn
Толық қоректiк орта (B және Mn-сiз) бақылау (контроль)
-
-
3
Толық қоректiк орта +B +Mn (тәжiрибе)
0,3
0,4
3
Толық қоректiк орта +B (тәжiрибе)
0,3
-
3
Толық қоректiк орта +Mn (тәжiрибе)
-
0,4
3
Тәжiрибеде қолданылатын микроэлементтер бор қышқылы - H3PO4 немесе бура - NaB4O4 (микроэлемент - бор) және күкiрт қышқылы марганец - MnSO4 (марганец микроэл ементi) түрiнде енгiзiледi.
Тәжiрибенi бақылау кезiнде, өлшеу және фенологиялық бақылау жұмыстары жүргiзiлiп отырады. Микроэлементтер жоқ (бор және марганец) толық қоректiк орта бақылау үлгісі болса, микроэлементтер бар қоректiк орта тәжiрибелiк үлгі болып саналады.
Бақылау және тәжiрибелiк өсiмдiктер арасындағы айырмашылықтарды (ұзындық, көлем, салмақ) салыстыру нәтижесiнде микроэлементтердiң өсiмдiктердiң өсуiне тигiзетiн әсерiн анықтайды.
5.3. Өсімдіктердің әртүрлі қышқылды ортада аммоний (NH4+) иондарын сіңіруі
Өсімдіктер С, Н және О2 элементтерінен басқа, өсуге қажетті элементтерді топырақ ертіндісінен тамыры арқылы сіңіреді. Минералды элементтер көп жағдайда ионды түрде сіңіріледі.
Өсімдіктердің иондарды сіңіру прроцесін екі түрге бөледі: апопластикалық (иондардың клетка аралық кеңістіктер арқылы өтуі) және симпластикалық өту (иондардың плазмодесма арқылы бір клетканың пртоплазмасынан екінші клетканың пртоплзмасына өтуі). Апопластылық өту тамырдың иондарды жалпы сіңіру мөлшерінің 4-6 % ғана құрайды, бұл өту жолы пассивті жүреді. Тамырдың анатомиялық құрылысында иондардық апопластылық өтуі эпиблема клеткалары мен Каспар белдеуіне дейінгі аралықта ғана жүреді. Каспар белдеуінің сүректелген суберинді клетка қабықтары иондардың ары қарай апопластылық өтуіне кедергі келтіреді.
Элементтердің ионды сіңірілуінің екінші жолы, цитоплазма арқылы өтуі. Иондар химиялық грдиентке байланысты бір клетканың цитоплазмасынан, екінші бір клетканың цитоплазмасына клетка аралық саңылаулардағы плазмодесма жүйелері арқылы өтеді. Цитоплазманың мембранасы арқылы кіреді. Иондардың мембрана арқылы тасымалдануы активті (энергия жұмсау арқылы) және пассивті (керісінше энергия жұмсалмайды, химиялық градиентке байланысты) жүреді.
Тамыр - өсімдіктің сіңіру дене мүшесі болып есептелгенімен, оның клеткаларында кейбір органикалық қосылыстардың синтезі жүреді. Тамыр клеткаларына енген иондар (әсіресе N, P, S, К т.б.) клетка метаболизмінде күрделі өзгерістерге түседі.
Сондықтан да, тамыр арқылы иондардың сіңірілуі, өсімдіктердің өсу ортасындағы жағдайларына тікелей байланысты: жарыққа, температураға, қоректік ортаның рН мәніне, қоректік ортаның отегімен қамтамасыз етілуіне және қоректік ортадағы иондардың сандық мөлшері мен қатынасына т.б.
Иондардың әртүрлі орта жағдайында, тамыр арқылы сіңірілу ерекшеліктерін зерттеу үшін, қоректік ортадағы анықталатын элементтердің концентрациялары қоректік ортаға өсімдіктерді салғанға дейін және өсімдіктерді салғаннан кейін өлшеу арқылы анықтайды.
Бұл үшін белгілі - бір құрамдағы қоректік орта даярланып, оған белгілі - бір уақыт аралығында зерттелетін өсімдікті тамыр жүйесі арқылы орнластырады. Элементтің иондарының сіңірілу шамасын қоректік ортаның концентрацияларын өсімідікті салмай тұрып және өсімдікті салғаннан кейін өлшеу арқылы анықтайды. Концентрацияның өзгеруін тамырдың 1г. салмағында, 1 сағаттағы өлшем бірлігінде алады.
Құрал -жабдықтар және реактивтер:
Қоректік орта құрамы: (1 литр суда 0,1 г Са (NO3)2; 0,25г КН2РО4; 0,012г MgSO4; 0,01г NH4NO3; 0,017г KCl), фосфатты буфер рН - 12; натрий фенол; 1% натрий нитропруссид ертіндісі, натрий гидрохлориді, 500 мл цилиндр, 1 мл пипетка, 3 л колба, стакандар, таразы ФЭК.
Тәжірибе үшін 10-20 күндік жүгері немесе бидай өскіндері алынады.
Жұмыстың орындалуы:
Аммоний (NН4+) иондарының сіңірілуін зерттеу үшін өсімдііктің өсуіне қажетті қоректік ортаны құрайтын тұздардың бастапқы ертінділері даярланады. Ол үшін 1 литр дистилдгнен суда 5 түрлі ерітінді жасалынады: Са (NH3)2 100г/л; KH2PO4 - 25 г/л ; MgSO4 - 12,5 г/л; NH4NO3 10 г/л; KCl - 17 г/л.
Цилиндрге 200 мл су құйып, онан кейін әрбір тұз ертіндісінен 1 мл құйып, жалпы көлемді сумен 500 мл дейін жеткізеді. Даярланған қоректік ортны бөліп екі стаканға құйып, қышқылды немесе сілтіні тамлшылата отырып, бұл стакандарға ерітінділердің рН мәнін 7 және 5 - ке теңейді. Бұл стакандардағы ертінділерді (рН - 7 және рН-5) 100 мл көлемде басқа 4 стаканға құяды. Әртүрлі рН- мәндеріндегі екі стакандағы ертінділерді бақылау үлгісі ретінде қалдырып, қлған екі стаканға рН-7, екіншісі рН-5, алдын-ала жуылып, сорғыш қағазбен кептірілген алынған 3-7 дана буылған өсімдік тамырларын салып, таразыда барлық стакандардың салмағын өлшейді (бақылау және тәжірибелік). Экспозиция уақыты, яғни өсімдіктердің қоректік ортада болуы 30-60 минут. Осы уақыт аралығында өсімдік иондарды сіңіріп, суды буламайды, қоректік ортаның көлемі өзгереді. Тәжірибенің уақыты аяқталғаннан соң, өсімдіктер салынған стакандар қайтадан өлшенеді. өсімдіктерді қоспадан алып, тамырларын фильтр қағаздың көмегімен құрғатып, өсімдіктің негізгі бөлімінен кесіп алып, тамырдың салмғын өлшейді.
Стаканның кеміген салмағын, суды қосымша құю арқылы алғашқы өлшемге теңестіреді. Онан кеін, өсімдік салынған стакандардағы қоректік ортадағы азотты амоний тұзының (NH4NH3) концентрациясын Любошинский және Зальт әдістерінің көмегімен анықтайды.
Бұл әдіс мынаған негізділген : амоний және натрий гипохлоридтері қосылған кезде, көк түсті индофенол түзіледі. Катализатор ретінде натрий нитропруссидін қосқанда реакцияның жүру жылдамдығы, көк түстің пайда болу қарқындылығы, ондағы 0,02-0,4 мгк/мл арлығында азотты аммоний мөлшеріне қатынасты.
Жұмысты орындар алдында 8-10 нүктелі калибровка қисығын құру қажет. Ол үшін 25 мл колбалар алынып, оған зерттелетін ертінділер құйылады, оларда азоттың ортша концентрациясы 0,02-0,4 мгк/мл мөлшер арлығында болуы керек. Онан кейін, әрбір колбаға 2,5 мл натрий фенолын, 2,5 мл фосфор буферін, 0,05% натрий нитропруссидін және 0,5мл натрий гипохлоридін құйып, әрбір колбадағы ертінді көлемін су қосу арқылы колбаның жоғарғы белгісіне дейін жеткізеді. Әрбір колбадағы ертінділерді шйқап араластырып, 30 минут қараңғыға қояды. Осы уақыт аралығында көк бояу түсінің пайда болуы жоғарылап, тұрақтанады, бірнеше сағат бойы сақталады. 30 минуттан кейін ертінділерді қызыл фильтрді қолдана отырып, ФЭК-де оптикалық тығыздығын анықтап, осыған байланысты ертінді стандартында азот концентрациясын көрсететін график сызылады (калибровка қисығы).
Тәжірибе қойылған (өсімдіктер салынған) қоректік ортадағы аммоний формасындағы азоттың концентрациясының калибровкалы (0,02-0,4 мкг/мл) деңгейіндегі мөлшерін анықтайы. Ол үшін 25 мл колбаларға өсімдіктерді салған қоректік ортадан ертінділер алып, оған жоғарыда көрсетілгендей ретпен қажетті реактивтерді қосып, суды қосу арқылы колбадағы ертінді көлемін колба белгісіне дейін жеткізіп, шайқап, 30 минуттан кейін ФЭК-де ертінділердің оптикалық тығыздығын өлшейді. Колибровка қисығын пайдалана отырып, тәжірибе қойған азотты аммоний ертіндісінің концентрациясын табады. Стандартты алғашқы ертінді мен тәжірбелік ертіндідегі азотты аммонийдің концентрация айырмашылықтарын тауып, 50 мл қоректік ортадағы өсімдік тамырларының сіңірген азотты аммоний мөлшерін анықтайды (1 гр тамыр массасының 1 сағат уақытта сіңіру мөлшері алынады). Тәжірибеде әртүрлі рН мәнді ортада, сіңірілген азотты аммоний мөлшері салыстырылып, оның нәтижелері төмендегідей кестеде көрсетіледі.
Өсімдіктердің әртүрлі қышқылды ортада аммоний (NH4+) иондарын сіңіруі
3-кесте
Вари-ант
Тар
Тамыр салма
ғы
Ертінділердің оптикалық тығыз -- дығы
өлшеу колбасындағы азотты аммонийдің концентрациясы
Сұйылту
Азотты аммо-нидің концентрациясы
50 мл қоректік ортадағы азотты аммонидің мөлшері
Сіңірілген азотты аммоний мкг. Г-1. ч.-1
5.4. Тамырдың қоректік ортадан тотыққан азотты қосылыстарды сіңіру қызметін зерттеу.
Азот- төрт органогенді элементтің біреуі. Топырақтан өсімдік ала алатын азотты қосылыстарға NH4+ және NH3- жатады. Топырақта азоттың тотыққан және тотықсызданған түрлері әртүрлі қатынаста болады. Жақсы қопсытылған, онша қышқыл емес топырақтарда нитратты қосылыстар басымырақ кездеседі.
Өсімдік клеткасына енген нитрат тотықсызданып, басқа органикалық қосылыстардың құрамына кіреді, немесе өсімдік ұлпаларында жиналып, азоттың қорын жасайды.
Ассимиляцияланған нитраттың тотықсыздануы екі кезеңнен тұрады: нитратредуктаза ферментінің катализдеуі нәтижесінде екі электронды нитраттың нитритке тотықсыздануы және нитрит редуктазаның көмегімен 6 электронды нитриттің аммониге дейін тотықсыздануы жүреді.
Жоғары сатыдағы өсімдіктерде нитраттың ассимиляциялануы жер үсті дене мөшелерінде де және тамырларында да жүреді.
Осыған байланысты тамырдың NО3- иондарын ассимиляциялау қабілетін салыстырмалы түрде анықтау үшін, төмендегі тәжірибелік жұмыс беріліп отыр.
Құрал-жабдықтар және реактивтер: пробиркалар, колбалар, фильтр қағазы, фотоколориметр, Тунберг түтігі, вакуум насосы, фосфат буфері рН 7,2, 0,1А алма қышқылы; 0,1 М КN3 ; Кноп қоспасы; Грисс реактиві (- нафтиламин және сульфенил қышқылы 1:1)Жүгерінің, асқабақтың, бұршақтың 10-20 күндік өскіндері.
Жұмыстың орындалуы: нитрит реакциясының активтілігін, анаэробты жағдайда өсімдік ұлпаларында жиналған нитрит мөлшеріне байланысты анықтайды.
Өсімдіктің 0,2 г жапырағы мен тамырын көлемі 5 мм2 шамасындағы кесінділерге бөліп, оларды дәкеге орап Тунберг түтікшесіне салады. Алдын ала түтікше ішіне 9 мл мынандай құрамындағы инкубациялық қоспа құйылады: 5 мл фосфат буфері ( 0,6М рН - 7,2), 1 мл 0,1 М алма қышқылы, 1 мл 0,1 М КNО3 және 2л дистилденген су. өсімдіктерді түтік ішіндегі инкубациялық қоспаға салғаннан кейін, түтікті жақсы майланған тығынмен жауып, тығын және түтік саңылауларын бір-біріне үйлестіреді. Вакуум нсосы арқылы түтік ішіндегі ауаны 3 минут аралығында сорып алады да, тығынды бұрап түтік саңылауын жабады. Біраз уақыт өткеннен кейін, тығындыны тағы бұру арқылы, ондағы саңылауды түтік саңылауымен қайтадан үйлестіреді. Сөйтіп түтік ішіне ауа жібереді. Түтік ішіне енген ауа ертіндіге, онан ұлпа кесінділеріне өтеді.
Инфильтрациядан кейін ұлпа қарайып, түтік түбіне шөгеді. Осы жолмен ұлпаның өткізгіштік қабілетін жоғарлатады: инкубациялық қоспадағы малат және нитрит, клеткада нитритті реактивтердің жұмысына қолайлы жағдай туғызады.
Аэробты ортадан кейін, түтік ішінде - қайтадан анаэробты жағыдай жасайды (жоғарыда көрсетілген тәсілмен). Анаэробты жағдайдағы Тунберг түтігін 37оС 30 минут аралығында термостатқа орналастырады. Осы уақыт ішінде түтікті жайлап шайқау арқылы, оның ішіндегі ертіндіні араластырады. Осы кезде ұлпада жиналған нитрит жуылып, ертіндіге шығады.
Нитрит (NO2-) концентрациясын Грисс реактиві арқылы анықтайды. Бұл реактивті нитритті анықтау алдында ғана нафтилаланин мен сульфенил қышқылын қосу арқылы дайындайды. Грисс реактиві нитритпен қызғылтым түске боялған азотқосылыс түзеді. Реакция екі кезеңде жүреді: алғашқыда сульфенил қышқылы НNO2- мен әрекеттесіп диазоқосылысын, онан кейін түзілген диазоқосылысы - нафтиламинмен әрекеттесіп ақырғы өнімді береді.
Тунберг түтігіндегі инкубациялық ортада үш қайта 1 мл-лік ертінділер алынып, әрбір ерітіндіге 1 мл Грисс реактивін қосады. Осымен қатар, бір мезгілде бақылау үлгісі (контроль) алынады. Ол 2 мл инкубацияға қолданылмаған ертіндіден және 1 мл Грисс реактивінен тұратын нитритті анықтау реакциясын, нитритті жоғалтпау үшін, өте тез жүргізу қажет. Грисс реактивінің әсерінен боялған ерітінділердің, боялу қарқындылығын 50 нм толқын ұзындығында ФЭК-те өлшейді. Калибровка қисығы арқылы ертіндідегі NO2 концентрциясын табады.
Нитритті реакцияның активтілігін өсімдіктің 1 г массасының, 1 сағат аралығында нитритті тотықсыздандыруына потенциалды жағдайы алынады.
VІ. ӨСУ ЖӘНЕ ДАМУ
Өсу және даму барлық тірі организмдерге тән, олар тіршілік әрекетінің ең айқын көріністерінің бірі. Бұл құбылыстар организмдегі жалпы зат алмасу процестерінің жиынтығына және қарқынына тікелей байланысты.
Өсімдіктердің өсуі түзуші ұлпа клеткаларының бөлінуі мен созылуы нәтижесінде жүреді. Өсу процестері кезінде өсімдік денесінде мынандай ерекшеліктерді байқауға болады: клетка санының артуы, клетка көлемінің ұлғаюы, клеткада жаңа құрылымдардың пайда болуы, өсімдік салмағының артуы, өсімдіктін жеке мүшелерінің өлшемдерінің ұлғаюы, мүше сандарының көбеюі.
Клетканың өсуі үш кезеңнен тұрады: 1) ұрықтық, 2) созылып өсу,
3)жіктелу.
Эмбриондық кезеңде цитоплазма көлемі және ядро ұлғаяды, клетка көлемі белгілі шамаға жеткен кезде клетка митоз арқылы екі жас клеткаға бөлініп, клетка саны артады.
Клетканың созылып өсу кезеңінде оның көлемі ұлғайып, клеткаға тән құрылымдар және вакуольдер толық қалыптасады. Бұл кезде клетка қабығы керіліп клеткада судың белгілі бір мөлшері жиналады. Мұндай клеткалардың көлемдері алғашқы меристемалық клеткаларға қарағанда ондаған немесе жүздеген есе ұлғаяды, ересек клеткаларға айналады.
Жіктелу немесе дифференциалдану кезеңінде ересек клеткалардың құрылысы өзгеріп, олардан тұрақты ұлпалар қалыптасады.
Жеке өсімдіктің ұрықтанудан бастап тіршілігінің аяғына дейінгі барлық өзгерістерді қамтыйтын кезеңдерін өсімдіктің жеке дамуы немесе онтогенезі деп аталады. Өсімдіктің жеке дамуы бірнеше сатылардан тұрады: эмбриондық (зиготаның қалыптасуы), жастық- балауса (ұрықтың өнуі, вегетативті дене мүшелерінің қалыптасуы), жыныстық жетілу (гүлдеу), көбею (тұқым мен жемістің қалыптасуы), қартаю.
Өсімдіктің өсуі мен дамуына ішкі және сыртқы жағдайлар әсер етеді,
әсіресе фитогормондардың тигізетін әсері ерекше.
6.1. Асқабақтан жекеленіп алынған тұқым жарнақтарының метаболизміне фитогормондардың әсер етуі.
Тұқымның өсуі, ондағы жалпы метаболизм процестерінің активтілігінің артуымен тікелей байланысты. Тұқым жарнақтарының өсуінде қор заттарының жұмсалуын жүзеге асыратын және тұқым жарнағын жасыл жапыраққа айналуын қадағалайтын жаңа ферменттер жүйесі пайда болып, олардың активтілігі артады. Бұл поцестердің жүруін ұрықтың ось бөлімі қадағалайды,фитогормондар бұл процесте үлкен роль атқарады. Тұқымның өсуінде фитогормондар ұрықтың ось бөлігінен тұқым жарнағына өтіп, ондағы қор заттарын ыдырататын ферменттердің активтілігіне әсер етеді. Ыдырау өнімдері ұрықтың ось бөліміне өтіп, оның өсуін қамтамасыз етеді.
Асқабақтың жекеленген тұқым жарнақтары фитогормондардың экзогенді әсер етуіне өте сезімтал, себебі тұқым жарнақтарын тұқымнан бөлгеннен кейін эндогенді гормондардың қоры азаяды. Осындай тұқым жарнақтарына цитокининмен экзогенді әсер етсе, олардың өсу активтілігі артады. Цитокинин клетканың ішкі құрылымының жасалынуына және тұқым жарнағындағы зат алмасу процессіне әсерін тигізеді. Цитокинин тұқым жарнақтары клеткаларының қор заттарды пайдалану қарқынын жоғарлатады және хлоропласт онтогенезіне; оның бөлінуіне әсерін тигізеді. Цитокинин клетка митохондрияларының жасалуын, эндоплазма торларының дамуын белсендіреді.
Цитокинин тұқым жарнақтарының өсуіндегі, олардың жасыл жапырақтарға айналуындағы клеткалардың мамандана бөлшектенуін тудыратын физиологиялық программаларға қатысатын, әртүрлі ферменттердің синтезделуін қадағалайды. Цитокинин тұқым жарнағында әртүрлі биоплимерлердің синтезделуін ыдырататын, пирофосфатты гидролиздеуге қатысатын эндопептидаза ферментінің автивтілігін жоғарлатады, осыған байланысты клеткада биополимерлердің синтезделуін қамтамасыз етеді. Цитокинин органикалық қышқылдардың алмасуына қатысып, малик-энзимді және фотосинтездің негізгі ферменттерінің бірі рибулозобифосфаткарбоксилаза ферменттерін активтендіреді.
Цитокинин клеткадағы белоктың биосинтезінің әр түрлі кезеңдерін стимуляциялайды. Гормон РНК синтезін белсендіреді, клеткадағы рибосом санын полисомдардың пайда болуын жоғарлатады. Цитокининнің жоғарыда көрсетілген процестерге тигізетін әсеріне, қарама-қарсы әсерді абцисс қышқылы көрсетеді (АБК). Цитокинин және абцисс қышқылдары аралығында айқын антогонизм байқалады. Абцисс қышқылы тұқымның өсуіндегі көптеген процестерді тежейді: белок биосинтезін, хлорофилл синтезін, фементтердің активтілігін тежейді және т.б.
Цитокинин және абцисс қышқылдарының әсер етуі, олардың концентрациясына тікелей байланысты.
Құрал-жабдықтар және реактивтер: центрифуга, спектрофотометр, кондуктометр, фарфор келісі, таразы, термостат, вакуум-насос, фототермокамера, бұрғы, пробиркалар, бюкстер, Бунзен колбасы - цилиндрлер, фильтр қағаз, 6 БАП (10 мг/ л жђне 100 мг/л) АБЌ (1 мг/л), CаCO3, 80% этанол, 0,005 М фосфатты буфер рН - 7,4, 1% крахмал, нитросалицил қышқылы, 50мМ трис - НСl буфері рН 7,5, 5 мМ дитиотрейтол (ДТТ), MgCl, 03мМ НАД Ф, алма қышқылы.
Жұмыстың орындалуы:Бұл жұмыста асқабақтың тұқым жарнағына әртүрлі фитогормондармен (абцисс қышқылы - БАП және 6 бензиламинпурин - БАП) әсер ете отырып, жекеленген тұқым жарнақтардағы кейбір ферменттердің (амилаза және малик-энзим) активтілігін анықтау қажет. Бұл тәжірибе бірнеше кезеңдерден тұрады.
1-тәжірибе. Асқабақ тұқымының тұқым жарнағын бөліп алып, оның өсуін анықтау.
Асқабақ тұқымын Петри табақшасына төселген ылғалданған қағаз үстінде, қараңғы ортада, 25оС температурада 96 сағат аралығында өсіреді. Өсірілген тұқымнан, Тұқым жарнағтарын бөліп алып, Петри табақшасында, 25оС термостатта ұстайды. 24 сағат өткннен кейін, тұқым жарнағын зерттелетін ертінділерге көшіріп 28оС температурадағы фотокамерада 48 сағат бойы жарықта ұстайды. Зерттелуші ертінділер ретінде: дистиллденген су, АБҚ- 7мг/л; 6-БАП-10 мг/л; 6-БАП-100 мг/л алынады. Әр түрлі ертінділерге арналастырылған тұқым жарнақтарының санын, олардың салмағын таразы арқылы өлшеп, тұқым жарнағының орташа салмағы анықталады.
2- тәжірибе. Тұқым жарнақтарында хлорофилдің мөлшерін анықтау.
200 мг тұқым жарнағын алып, оны фарфор келісінде (аз мөлшерде СаСО3 және шыны ұнтақтарын қосып) этанол ертіндісінде экстракциялайды. Алынған экстрактыны шыны фильтрде сүзіп, суспензияны 25 мл көлемдегі колбаға құяды да, этанол ертіндісін қосымша құю арқылы суспензия көлемін колба белгісіне дейін көтереді.
Осындай жолмен алынған ертіндінің оптикалық тығыздығын 622-642 нм толқын аралықтарында спектрофотометрде өлшеп, хлорофилл мөлшерін мына формула бойынша анықтайды.
С а+в =7,12 Е 662 +16,8 Е642 мг/л
Хлорофилл мөлшерін 1 гр өсімдік массасына шағып, табады.
3- тәжірибе. Клетка мембранасының өткізгіштігін анықтау
Бұрғының көмегімен тұқым жарнағынан 60 дөңгелек кесінді алынады. Әрбір варианттан 10 дөңгелек кесіндіні бюкстерге салып, бетін дәкемен жабады. Бюкстерді 15 мин. аралығында судың астына қойып жуады да, 3 рет дистелденген сумен шайқағаннан кейін, тұқым жарнақтарын фильтр қағазымен құрғатады.
Бюкстерге 10 мл дистилденген су құйып, бетін қақпақпен жауып, 1 сағатқа 25оС термостатқа қояды. Дөңгелек кесінділердегі жалпы электролиттердің мөлшерін анықтау үшін, бюкстерді 15 мин қайнап жатқан суға қойып, инкубациялайды. Инкубацияланудан кейін бюкс ішіндегі заттарды сүзеді, бөлме температурасында сүзіндінің электр өткізгіштігін кондуктометрлік әдіс арқылы анықтайды. Әрбір варианттағы жалпы мөлшерден электролиттердің шығу процентін есептейді.
4- тәжірибе: Малик-энзим активтілігін анықтау
Малик-энзим НАД Ф және Mg2+ иондарының қатысуымен малатты декарбоксилдендіріп, пируватты және тотықсызданған НАД Ф түзеді.
Малат НАД Ф, Mg2+ пируват + СО2
Фермент көптеген биосинтетикалық прцестерде малаттың денгейін реттеуде ерекше роль атқарады.
Құрғақ тұқымдарда фермент активтілігі байқалмайды, фермент активтіліктері тұқымның өсуімен байланысты.
Әр түрлі варианттан 5 тұқым жарнағын таңдап алып, таразыда өлшейді. Тұқым жарнақтарын фарфор келісінде құрамында ДТТ бар 5 мл трис - НCl буферінде (суық температуралық камерада 2-4[о]С) гомогендейді. Алынған гомогенатты 30 мин. 20000g центрифугалап, алынған ерітіндіде ферменттің активтілігін анықтайды. Ол үшін 0,2 мл реакция қоспасына 0,1 мл фермент ертіндісін және 2,5 мМ малат ертіндісін қосады. Бақылау үлгісі (контроль) бар кюветаға малат қосылмайды. Тәжірибелік және бақылау кюветаларындағы ертінділердің оптикалық тығыздығын бірнеше рет 5-7 мин. сайын 340 нм толқын ұзындығында спектрофотометр арқылы өлшейді. Ферменттің активтілігін көрсететін бірлік ретінде 1 минутта оптикалық тығыздығы 0,01-ге жоғарлататын фермент мөлшері алынады. Ферменттің меншікті активтілігі ретінде, 1 мин. аралығында, 1 мг белокта, ертіндінің оптикалық тығыздығын 0,01-ге жоғарлататын фермент мөлшері алынады. Ферменттің активтілігін әрбір вариант бойынша есептейді.
5- тәжірибе. Амилазаның активтілігін анықтау
Асқабақтың 1 г тұқым жарнақтарын өлшеп алып, оны мұзбен суытылған форфор келісіне салып, үстіне 40 мл фосфор буферін құйып, жаншып езеді. Алынған экстрактыны 15 мин 10000 g центрифугалайды. Центрифугалауда бөлінген ертіндіні, ферменттің активтілігін анықтауға пайдаланады.
- амилаза әсерінен крахмал жоғары молекулалы декстран- мальтозаны түзеді. Түзілген мальтозаны ары қарай - амилаза гидролиздейді. Мальтоза 3,5-динитросалицил қышқылымен (ДНС) боялған түс береді, түстің пайда болуы қарқындылығы қанттың мөлшеріне тікелей байланысты.
Ферменттің активтілігін анықтау 3 вариантта жүргізіледі:
1.реактивтерді бақылау: 0,5 мл 1% крахмал ертіндісі; мл 0,005 М фосфатты буфер, 1 мл ДНС
2.бақылау; 0,5 мл буфер; 0,5 мл суспензия, 1 мл ДНС
3. тәжірибе: 0,5 мл 1% крахмал ертіндісі, 0,5 мл суспензия (екі ертіндіні араластырып 5 мин 37[о]С термостатта ұстайды), сонан кейін 1 мл ДНС қосылады.
Барлық пробиркаларды 5 мин шамасында қайнаған суда қыздырып, әрбір пробиркаға 10 мл су құйылып ертінділердің оптикалық тығыздықтары 535 нм толқын ұзындықтарында өлшенеді.
Мальтоза мөлшерін калибровка қисығы арқылы анықтайды. Ферменттің активтілігін көрсетуде 1 г өсімдік массасында 1 мин. реакцияны жүргізетін мальтозаның мг-дық мөлшері алынады.
Бұл жұмыстағы барлық тәжірибелер толық жасалынғаннан кейін, жұмыс нәтижелерін төмендегідей кестеде көрсетеді.
Жекеленген асқабақтың тұқым жарнақтарына фитогормондардың әсер етуі.
4-кесте
Тәжірибелік варианттар
Бақылау (контроль)
Н2О
6-БАП
10мг/л
6-БАП
100 мг/л
АБҚ
1мг/л
- Бір тұқым жарнағының салмағы
-Хлорофил-дің саны (мг/л салмағы)
- Клетка мембранасының өткізгіштігі (электролиттердің толық шығуының % мөлшері)
- Малик-энзимнің активтілігі (1г салмақтағы өлшем бірлігі немесе 1 г белоктағы өлшем бірлігі)
Амилаза активтілігі (1г салмақтағы 1 минутта бөлінген мальтозаның МГ мөлшері)
6.2. Тамырдың өсу белдеулеріндегі клеткаларда индолил -сірке қышқылын (ИСҚ) жұқа қабатты хроматография әдісі
бойынша анықтау.
Жұқа қабатты хроматография әдісінің, басқа әдістерден көп айырмашылығы бар.
Ауксинді бөлу және зерттеу үшін әртүрлі хроматография әдістері қолданылады. Өсімдіктердегі индол өнімдерін идентификациялауда электрофорез және қағаз арқылы жүргізілетін хроматография әдістері қолданылып жүр. Кейінгі кезде, өсу гормондарын бөлуде және анықтауда силикагельді жұқа қабатты хроматографиялық әдіс, жаңа әдіс ретінде ұсынылып отыр. Басқа әдістермен салыстырғанда жұқа қабатты хроматография арқылы бөлуде, пайда болған қосалқы заттар ауксиннің бөлінуіне аз әсер етеді. Бүл әдісті қолдануда хроматографияға кететін уақыт біршама қысқарып, бөліну аз қашықтықта жүреді, бөліну кезінде пайда болған таңбалар тым жойылып кетпей мөлшері кішірек болады.
Қағаз арқылы хроматографиялауда заттардың бөлінуі бір-бірімен қосылмайтын екі сүйық фазаларда, әртүрлі таралу коээфициенттерінде жүреді. Жұқа қабатты хроматография адсорбцияға негізделген. Заттардың жылжу жылдамдығы, қозғалмайтын фазаның заттарды сіңіру қабілетіне байланысты, сонымен қатар қозғалатын (ерітінді) және қозғалмайтын (силикагель) фазаларының қызметтерінің қатынасына және хроматография колонкасының ішіндегі еріткіш көлемімен еріткіштің ағыс жылдамдықтарының ара қатынасына да байланысты.
Жұқа қабатты хроматография үшін, силуфол ИУ- 254 пластинкасының үстінде силикагель қабаты қолданылады, оның құрамында люминесценті индикатор болдаы. Шағылыстыратын төсеніші өсу гармондарының бөлінуіндегі таңбалардың пайда болу, көріну қарқынын арттырады, байланыстырушы зат ретінде крахмал қолданылады. Силикагель жоғарғы активті қышқыл қабат. Бұл қабат онша гидрофобты және нейтралды емес , қышқыл заттарды бөлу үшін қажет. Силикагель арқылы барлық қосылыстарды бөлуге болады.
Силикагель қышқыл реакциялы (фенолды, қышқылды) қосылыстарды бөлуге өте қолайлы. Дайын силуфольды пластинканы (тақтаны) қолданумен қатар, тазартылған силикагельді пайдалану арқылы заттарды бөлудің сандық қорытындыларын алуға болады. Хроматографиялық тақталарды алу үшін құрамында гипс бар силикагельдің " MERK" ( ФРГ) және " G" ( ФРГ) маркаларын пайдаланады, стандартты шыны тақталарға силикагельдің жұқа қабатын жағу әдістері көптеген монографияларда және әдістемелерде жазылған.
Құрал жабдықтар және реактивтер : микроскоп, хромотографиялық камера, фарфор келісі, силуфол пластинкалары, Петри табақшасы, пипеткалар, пробиркалар, заттық және жабындық шынылар, воронка, фильтр қағазы, спирт, эфир, изопропанол, аммиак, метилацетат, хлороформ, 2% HCl, натрий бисульфиді, индолил сірке қышқылы.
Жұмыстың орындалуы: жұмыста зерттеу объектісі ретінде жүгерінің (бұршақтың, лобияның, бидайдың т.б.) алдын ала өсірілген өскіндерін қолданады:тұқымды суға салар алдында, сабынды ерітіндімен және ағынды сумен 1 сағат жақсылап жуады, 6-8 сағаттан кейін ісінген тұқымды көктеу үшін ыдысқа дұрыстап қатармен салып, үстін ылғалды фильтр қағазымен жабады (тұқымның өсуі бір бағытқа бағытталуы керек, 2 қатардың арасындағы қашықтық 2-3 см). Фильтр қағазының ұштарын кюветада құйылған суға жібереді, бұл жвғдайда қағаздың ылғалдылығы сақталады. Кюветаның үстін шынымен жабады. Шыны және кюветаның қабырғасының арасында ауаның бос кіруі үшін кішірек саңылау қалдырады. Тұқымды суға салған уақыттынан бастап, 2 тәуліктен кейін, олардың тамырлары 1,5-2,5 сантиметрге жетеді. Олады қоректік өсу ортасына отырғызады. Ол үшін,. Кноп қоспасының әртүрлі концентрациялы ертінділері пайдаланылады. (Ca (NO3)2, KH2PO4, MgSO4, KNO3, FeCl3. Концентрациялары г/л, 0,25, 0,125, 0,25) . Тәжірибелік жұмысты орындау үшін 5-6 күндік өскіндерді таңдайды, бірдей ұзындықтардағы өскіншелерді 3 тамыр белдеулеріне бөледі (бөліну, созылу, тамыр түкшелері бар белдеулерге).
Тамырды өсу белдеуіне бөлу әдісі: Әр өсімдіктің тамырлары өсу белдеуінің ұзындығын анықтау үшін, басқа әдістермен қатар тамырдың миллиметрлік кесіндісінде клетка санын санау әдісі қолданылады ( Браун бойынша).
Тамырдың ұштарын 1 мм мөлшерінде кесіп, 69 % -ттік спирт пен фиксациялайды немесе 5 % хромқышқылымен. Спирттегі кесінділерді 10 сағат аралығында дистилденген сумен жуып, онан кейін 24 сағат хромды қышқылмен мацерациялайды. 10 кесіндіге 2 мл хромды қышқылды құйып, бір тәуліктен кейін пробиркадағы кесінділерді қатты сілкілеп, шайқап,бір-бірінен ажыраған клетка қоспасын алады.Оны микроскоппен қарап, 1 мм кесіндідегі клетка санын анықтайды. Санау алдында пробиркаға 5-10 мл дейін көлемде су қосады. Клеткаларды Фукс- Розенталь камерасының көмегімен санайды. Бөлу белдеуінде көп мөлшерде ұсақ клеткалар орналасады. Клетка санының азаюы,. ұзындығының бір уақытта ұлғаюы олардың созылу фазасына өткендігін сипаттайды. Клетка санын 1 мм ұзындықта тұрақты дәрежеге дейін біртіндеп төмендеуі, тамыр түктері бар белдеудің пайда болғанын көрсетеді. Бұл бедеуде клетка өсуін тоқтатады. Осы мағлұматтарды пайдалана отырып, әр объект үшін тамырдың өсу белдеулерінің ұзындығын анықтайды .
Бөлу және оларды өлшеу суық бөлмеде 0+5 С0 температурада жүргізеді.
Тамыр кесінділерінде табиғи ауксиндерді анықтау үшін бумен фиксациалайды. Бұл үшін стерилизатор түбіне су құяды.Өсімдік материалын сумен жанаспайтындай етіп салады, оны фарфорлы ыдысқа немесе дәкеге орап, оның ұшын стерилизатдың шетіне байлайды Ыдысты қақпақпен жабады және суды 15-20 минут қайнатады. Су буымен өлтірілегн материалды алады да 60 С[0] - та құрғақтып кептіреді.
Хроматографиялық камераны даярлау: Камера орнына кіші көлемдегі 3-5 л шыны ыдысты қолдануғада болады, ені мен биіктігі 15 х 40 см көлемде қиылған фильтр қағазын U әрпі түрінде сосудтың ішкі бетіне орап салады да, алдын ала ыдыс ішіне құйылған ерітіндімен сулайды. Осындай жағдайда ылғалданған қағазды камера қабырғаласына жапсырып қояды. Жасалған операция камераның қанығуы деп аталады. Қаныққан камерамен жұмыс істеу кезінде, жұмыс істеу уақыты қысқарады және бұл кезде Rf көлемі нақты анықталады. Хромотография жүретін ыдыстың бетін шеті вазелинмен майланған қақпақпен жабу керек. Ыдыс түбіне таңдалған еріткіш құйылады. Камераданы тәжірибеге дейін, 1-2 күн бұрын даярлайды .
Еріткішті таңдау: Еріткішті таңдау да, онда бөлінетін заттың Rf шамасы жақсы байқалуы керек. Жиі пайдаланылатын хроматографиялық қоспаларға, мынандай қоспалар: изопропанол - аммиак (25 % ерітіндісі)-су (85 бөлік +5 бөлік+ 15 немесе 10 бөлік+1 бөлік+ 1 бөлік) жатады. Берілген қоспаны қолдану кезіндегі, анализ уақыты 2 сағаттай болады. Басқа ерітінділерді де алуға болады, индолды қосылыстарды жақсы бөлетін ертіндіперге , мынандай құрамдағы сілтілі қоспалар: метилацетат-изопропанол 25 % аммиак ( 45:35-20) және хлороформ-метанол-мұзды сірке қышқылы ( 72-20-5) қолданылады.
Материалды экстракциалау: ( Кефели және Турецкий әдісі). Алдын ала асқын тотықтарынан тазартылған эфир, табиғи ауксиндерді алуға пайдаланылады.Эфирді тазарту үшін,. 1 л эфирді 100 мл қаныққан бисульфат натрия ерітіндісімен шайқап, бөлуші воронка арқылы эфирді бөліп алады да, эфирді 4-5 рет дистилденген сумен шайқайды. Осындай жолмен тазартыллған 1 литр эфирге, 10 мл 2 %-і HCl құйып оны қышқылдандырады. Экстракцялау үшін фарфор табақшасына 3 гр құрғатылған өсімдік материалын салып , 1:0 қатынасында суды қосып ылғалдайды, содан кейін үстіне эфир құяды. Материал толық эфирде батуы керек. Материалды эфирде 3-5 минут ұстайды 10 минуттан соң тағы эфир құйып тұндырады. Эфир ұшпау үшін ыдыстың Петри табақшасымен жабады. Экстрациялауды, форфор табақшаға құйылған эфир түссіз болғанша, 4-5 рет қайталайды. Фарфор ыдысындағы эфирді суық ауа ағынынды ұшырып, қалған құрғақ қалдықты 1-2 мл 96 % спиртпен ерітеді. Спиртті ерітіндіні шыны мақта арқылы сүзеді. Тоңазытқышта спиртті сүзінді 1-2 күнге дейін сақталады.
Силуфол пластинкасын жуу: Силуфол пластинкаларында әдетте заттардың бөлінуіне бөгет жасайтын және ультракүлгін сәуледе жарқылдайтын әртүрлі қосылыстар болады. Сондықтан, қолдану алдында 96 %-ті спиртте мұқият жуылады. Бұл үшін, үлкен ыдықа аз мөлшерде этанол құйып (ыдыс биіктігі 15 см болу керек, пластинканы тігінен орналастырып, ыдыстың бетін қақпақпен жабады. Жылжу жылдамдығына байланысты спирт хроматографиялық пластинканың ұшына жеткен кезде, оны камерадан суырып алады. Бөлме температурасында кептіріп, күндізгі ультракүлгін сәуледе қарайды. Егер пластинкада дақ байқалса қайтадан жуады.
Затты енгізу: Спиртте алынған өсімдік экстрактысын микропипетка көмегімен 0,1 мм қашықтықта, пластинканың төменгі жағынан15-20 мм жоғарырақ сызықта енгізеді. Енгізілген дақтың диаметрі 2 мм-ден аспауы керек. Келесі тамшыларды енгізу алдында дақ кептіріледі.
Калибровка қисығын даярлау үшін, төмендегі кестеде көрсетілгендей индол сірке қышқылының стандартты ертінділерін дайындап, олардың оптикалық тыыыығыздықтарын спектрофотометрде өлшеп, соның негізінде калибровка қисығы құрылады.
Калибровка шкаласын алу үшін ИСҚ ( 8 мг/10мл) стандартты ерітінділерді дайындау.
5-кесте
Пробирка нөмірі
Қоспа, мл
Құрамы
ИСК ерітіндісі
Су
ИСК, мкг/мл
ИСК мкг/0,05 мл
1.
1,00
0
800
40
2.
0,75
0,25
600
30
3.
0,50
0,5
400
20
4.
0,25
0,75
200
10
5.
0,125
0,875
100
5
6.
0
1,0
0
0
Силуфол пластинкасына микропипетка көмегімен 5-40 мкг дейін ИСҚ, старт сызығыңа бір-бірінен 15 мм ара қашяқтықта енгіледі , осымен қатар басқа пластинкаға 0,05 мл мөлшерде зерттелетін зат енгізіледі. ИСҚ стандартты ерітінділері мен зерттелетін зат енгізілген пластинкалар бір камерада, біркелкі жағдайда еріткіш арқылы айдалады.
Табиғи ауксиндерді бөлу. Хроматографиялық камераны ішіне алдын ала қаныққан, таңдалған еріткіштің аз мөлшерін құйып, пластинкапарды салады. Пластинкаға енгізілген дақтар, әрқашан еріткіштен 10 мл жоғарғы деңгейде болуы керек. Хроматографиялық камера үшін, тәжірибе алдында таза еріткіштерден, ондаған хроматограммаларға жететін, жаңа қоспалар дайындап, камераға құяды Бір мезгілде оған камераның мөлшеріне байланысты пластинкалар салынады. Камераны 20-22 С[0] температурағы шкафқа салады. Қараңғыланған бөлмеде, бөлінудің жоғарғы әдісі бойынша жұмыс жүргізіледі. Жоғарғы еріткіш хроматограмма бойынша 120 мм жол жүргеннен кейін (шамамен 2 сағат ) хроматограмманы камерадан алып, суық ауа ағыны астында кептіріп, бөлінген дақты идентификциалайды.
Индолил сірке қышқылын (ИСҚ) идентификациялау.Индол туындылары көптеген реактивтермен түсті реакция береді. Дақтың шығуы үшін Прохазки, Ван Урка немесе Сальковского реактивін қолданады.
Ван Урка реактиві 1 г парадилитиламинобензальдегидті 50 мл 25 % -тік HCl және 50 мл % -ті этанол қоспасында ерітеді. Ван Урка реактивімен пульверизатормен пластинкаларға шашыратып, 50 С [0] - та 20 минуттай қыздырады, содан кейін патша арағыың буының үстінде, индол туындыларының боялған дақтарының пайда болуына дейін ұстайды.
Сальковсикй реактиві. Бұл реактив ( Сальковский сальпері депте аталады) 1 мл 0,5 М FeCl, 50 мл 35 %-тік хлор қышқылынан тұрады. Силуфол пластинкаларына Сальковсикй реактивіншашыратқаннан кеійін, бояу түсінің қарқындылығы ( қызылдан малина түске дейін) 30-40 минуттан кейін жасыл жарық фильтрлі қолдана отырып, калориметрде ( л = 430 нм) анықталады.
Прохазки флуоуресцентті реакциясы 25 мл формалин ( 35 %-ті ) ерітісінен 25 мл таза 25 %-тік HCl және 50 мл этанолдан ( 95 %-тік) қоспа дайындалады. Берілген реактивпен хроматограмманы өңдегеннен кейін пластинкаларды 100 С[0] - температурада 5 минуттай қыздырады. Ультракүлгін жарықта (сары-сарғыш-жасылтым) флуоресценция анықталады. Экстрактыны зерттеу кезінде қысқа және ұзын толқынды ультракүлгін жарықта хроматограммаларды идентификациялау флуоресценерленген белдеулердің маркировкасынсалыстыру қажет.
Синтетикалық ИСҚ (белгілеуші ретінде) және зерттелетін экстракт енгізілген пластинкаларды жоғарыда көрсетілген әдістермен бір уақыттаөңдейді.
Заттарды идентификациялау үшін олардың қозғалыс коэффицент шамаларын пайдаланады.
Зерттелініп отырған заттың қозғалысының жылдамдығы
Rf = еріткіштің жылдамдығы
Заттың өткен қашықтығымен, осы уақыттағы еріткіштің өткен қашықтықтарының ара қатынасы Rf арқылы есептейді.
Rf-тың барлық көрсеткіші 100 коэффициентіне көбейтіледі (Rf х 100). Анализ жасалған ерітіндіде қосалқы пайда болған заттар бар,осы балласты заттар, белгілі жағдайда анықталатын заттардың Rf көрсеткішін өзгертуі мүмкін. Осыған байланысты табиғи ИСҚ және синтетикалық ИСҚ үшін РФ көрсеткіштері сәйкес келмейді. Өсімдіктегі табиғи ИСҚ мөлшерін анықтау үшін,.хроматограммалық пластинкаларды ультрахемископтың УИ-1 ультракүлгін сәлесінде қарап, осы ультракүлгін сәуледе ИСҚ орналасу шекарасын белгілейді. Әрбір жеке қосылыстың бөлек аймақтарға түсуін бақылау керек. Осыдан кейін идентификацияланған белдеулерді пластинкадан қырып алып, 0,01 М NaHCO3 ерітіндіде ерітеді. Ерітіндіні центрфугалау арқылы гелден бөліп алады. Құрамында табиғи ИСҚ бар ерітіндінің оптикалық тығыздығын спектрофотометрде 278-280 нм толқын ұзындықтарында өлшейді. Ерітіндінің құрамындағы анықталатын заттың мөлшерін синтетикалық ИСҚ негізінде құрылған калибровка қисығын пайдалана отырып анықтайды.
6. Студенттердің оқытушымен өтетін өздік жұмыстарының (СОӨЖ) тақырыбы мен мазмұны.
Студенттердің оқытушымен өтетін өздік жұмыстарының (СОӨЖ) орындаудағы әдістемелік нұсқау.
Центрифугалау әдісі
Центрифугалау әдісі әртүрлі меншікті салмақтағы бөлшектерден
тұратын сұйық ортада қоспаларды бөлу үшін қолданылады. Центрифугалау сүзуді алмастыратын әдіс. Центрифугалау әдісі фильтр сүзгішті бітейтін ұсақ дисперсиялық заттарды бөлу үшін және фильтр сүзгіште заттардың адсорбциялануын болдырмау үшін ерекше қолданылатын, маңызды әдістердің бірі.
Центрифугалық әдіс биологиялық зерттеулерде үлкен маңыз атқарады, әсіресе клетка бөлімдерін және цитоплазма органоидтарын жеке фракциялауда: ядролық, пластидті, митохондриялық, рибосомалық және т.б. фракцияларды бөлуде.
Бұл әдістің негізінде жоғарғы меншікті салмақтағы ірі бөлшектерді төменгі жылдамдықпен бөліп, ары қарай жылдамдықтың өсуіне байланысты кіші бөлшектерді біртіндеп бөлу әдісі жатыр. Тұнбаға түсу жылдамдығы клетка бөлшектерінің қасиетіне және сұйық фазаның қасиетіне тікелей байланысты.
Клетка компоненттерін іріктеп, тұнбаға түсіруде центрифуга жылдамдығын анықтаумен қатар, бөлу ортасын анықтау өте қажет.
Соңғы кездерде таза клеткалық фракцияларды алуда градиент тығыздығында центрифугалау кеңінен қолданылып жүр.
1.1.1.Центрифугалаудың теориялық негізі
Қозғалмай тұрған пробиркаға оның салмағына қарай жердің тарту күші ( g) әсер етеді, центрифуганың айналуы кезінде, неғұрлым орталықтан тебетін күш артқан сайын, солғұрлым жердің тарту күші азаяды. Сондықтан да, орталықтан тепкен күшті анықтауда, жердің тарту күшін ескермейді:
Р = m :: r :: ω², ( 1).
Орталықтан тебетін күшті анықтау үшін мына теңдеуді қолданамыз:
Р 1 = 1,117 :: m :: r :: N 2 :: 10-5 (2).
Мұнда Р 1 - орталықтан тебетін күш ауырлық күшімен (g)көрсетіледі ;
g - ауырлық күшін жылдамдату (981 см/сек2);
m - айналған массаның салмағы;
r- айналу радиусы см;
N- бір минуттағы айналу саны;
ω - бұрыштық жылдамдық, рад/сек
Радиан-бұрыш, бұл бір айналымның радиусына тең доға, яғни 2PI рад. Осыдан, бұрыштың айналымы 1 секундтағы ротор айналымының жылдамдық деңгейіне тең, 2PI -дің көбейтіндісі түрінде.
Сондықтан да, орталықтан тебу күші (g) мына формула арқылы есептеледі:
2 PI 2 N2 :: r
60 :: 981
бұл теңдеу жоғарыда көрсетілген теңдеуге сәйкес келеді (2).
Әртүрлі центрифугалауда, центрифугалау жағдайларын салыстыруда, центрифуганың айналу санын көрсетумен шектелмей, олардың салыстырмалы орталықтан тебу күшін (R) көрсету қажет .
Егер m = 1 десек, онда (2) теңдік мынандай күйге көшеді:
R= 1,117 :: r :: N 2 :: 10 - 5 .
Салыстырмалы орталықтан тебетін күш, бөлу факторы немесе саны (g) деп аталады.
Есептеу: егер пробирканың түбі айналу осінен 15 см қашықтықта болса, центрифуганың айналу жылдамдығы 1 минутта 3000 айналым болғанда, салыстырмалы орталықтан тебетін күш пробирка түбінде мынаған тең:
R = 1,117 :: 15 :: 30002 10 - 5 = 1508 g
Орталықтан тебетін күшті пробирканың ортадағы деңгейіндегі сұйықтық есептейді, ол үшін айналу радиусы ретінде, айналу осімен пробирка орталығындағы сұйықтықтың ортасына дейінгі деңгей қашықтығы алынады.
Орталықтан тебу күшін анықтау үшін (g), логарифмді масштабта құрылған номограмма қолданылады. (сурет 1).Ол үшін, түзу сызық арқылы радиустың айналу мөлшерімен, центрифуга роторының N oсіндегі 1 минуттағы айналу жылдамдығын қосу қажет.Сол сызықтың шкаламен қиылысқан жерінде g саны анықталады. Назар аударатын ерекше жағдай, ол g шкаласының сол жағы- айналым жылдамдық шкаласының сол жағымен, оң жақ - оң жағымен сәйкес келуі керек.
Бұл теңдеу, тәжірибеде суспензияның бөліну мүмкіншілігін бағалауда, бөлшектердің тұнбаға түсу уақытын және центрифуга жылдамдығын анықтауда қолданылады.
1.1.2.Центрифугамен жұмыс істеу
Центрифуганың құрылыс ерекшеліктеріне байланысты бірнеше типтері бар.Солардың ішінде, биологияны оқыту мақсатындағы лабораториялық зерттеулерде, кіші көлемдегі центрифугалар кеңінен пайдаланылады;
А) горизонтальды ротормен;
Б) бұрышты ротормен
Мұндай центрифугалар аз көлемді сұйықтықтағы бөлшектерді, 1 минутта 2000-8000 айналым жылдамдығымен центрифугалайды. Бөлу факторы 6000 g. Бастапқы айналдыру және тоқтату уақыты 10 минутқа дейін.Центрифуга электр қуаты арқылы жұмыс істейді. (220 в), қабылдау күші 125 Bт.
Центрифугамен жұмыс істеу:
* Центрифуганы электр жүйесіне қосу алдында, центрифуга тұтқасын <<0>> жағдайына, айналу жылдамдығын << выкл>> жағдайына қою қажет.
* << Сағатпен жұмыс>>. Электр сағаттың тұтқасын бұрау арқылы сағат тілін белгілі бір керекті уақыт бөліміне қойып, центрифугалау уақыты белгіленеді.
* Центрифуганың қосу тұтқасын <<2>> жағдайына қарай бұрап, 50-60 секунд ішінде ары қарай бұрау арқылы, ротордың айналымын жоғарылату қажет.
* Жұмыстың аяқталу соңында центрифуганың қосу тұтқасын <<0>> жағдайына қарай қайтадан бұрау қажет. Центрифуга роторының толық тоқтауынан кейін, центрифуганың қақпағын және ротор қақпағын ашып, оның ішіндегі пробиркалар алынады.
* Центрифуганы электр жүйесінен ағытып пробиркалар алынады. Центрифуганың пластмассадан тұратын пробиркаларын қараңғыда 20 процентті фенол немесе 2-4 М динитрофенолда сақтау қажет. 2-3 ай ішінде бір рет центрифуганы техникалық тексеруден өткізу керек.
1.2.Фотометриялық зерттеу әдісі
Фотометрия қазіргі кезде, кеңінен қолданылып жүрген органикалық және бейорганикалық қосылыстарды сандық, сапалық талдайтын негізгі әдістердің бірі. Кейінгі уақытта фотометриялық әдіс, аналитикалық мақсаттардан басқа, экспериментальды химия мен биологияда әртүрлі биологиялық құбылыстардың механизмін зерттеуде,оның ішінде кейбір реакциялардың кинетикасын, биополимерлердің құрылысын, тотығу-тотықсыздану құбылыстарындағы кейбір компоненттердің өзгерулерін, фотосинтез және тыныс алу құбылыстарындағы электрондардың, электронды- тасымалдау жұйесі бойынша тасымалдану ерекшеліктерін зерттеулерде кеңінен қолданылып жүр.
Фотометрия әдісінің басқадай химиялық әдістерге қарағанда артықшылығы бар:
* анализдің тездігі;
* фотометриялық әдістің өте жоғарғы сезгіштігі.
Фотометриялық анализдеу арқылы концентрациясы өте аз
(10 [ - 6] - 10 [ - 7] моль/л) заттарды анықтауға болады. Фотометриялық анықтауда, анықталатын минимум (өте аз мөлшердегі зат, фотометрия арқылы табуға болатын) 0,01 - 0,001 мкг/см[2] аралығында болады.
* Фотометриялық әдістің анықтау дәрежесінің нақты дәлділігі.
1.2.1.Фотометрияның теориялық негізі
Фотометрия - химиялық анализ (фотометрия мен қатар спектрометрия т.б. қолданылады), ол белгілі бір заттың немесе ерітіндінің сіңірген жарық мөлшерін өлшеуге негізделген. Егер бірдей қабатты зат арқылы (мысалы, ерітінді) қарқыны J0 монохроматикалық жарық өтсе, ерітіндінің жарықты жартылай сіңіруіне байланысты, еретіндіден өткен жарықтың қарқыны J1 кемиді.
Ертіндіден өткен жарық қарқынның кемуі, жарық жолында, белгілі бір ұзындықтағы жарық толқынын сіңіре алатын молекулалардың мөлшеріне тікелей байланысты. Сондықтан да, сіңірілген жарық энергиясының мөлшері, оның табиғатына, ерітіндінің концентрациясына, ерітінді қабатының қалыңдығына және түсетін жарық толқындарының ұзындығына тәуелді.
Заттардың сандық мөлшерін фотометрия әдісі арқылы анықтау, Бугер-Ламберт- Бер заңдылықтарына негізделген.
Белгілі бір зат арқылы өткен жарықтың қарқынын өлшеу мына теңдеу арқылы есептеледі:
Jсіңірілген = J0 - J t
Фотометриялық анықтауларды жүргізудің кейбір нұсқаулары төменде көрсетіліп отыр:
Нөлдік ерітіндіні таңдау
Нөлдік ерітінді қасиетін сандық анықтауда немесе ерітіндіні салыстыруда, зерттелетін ерітіндінің оптикалық тығыздығы алынады. Оған, әдетте таза еріткіштер (су, ацетон, спирт) пайдаланылады. Бұл жағдайда, тәжірибидегі ерітіндінің оптикалық тығыздығы, тек ондағы еріген заттың концентрациясы арқылы анықталады.
Фементті реакцияның жылдамдығын анықтауда, егер тәжірибедегі ерітінді тұнық болмаған жағдайда (мысалы, хлоропласт суспензиясында, гомогенат белокты ерітінділермен жұмыс жүргізгенде), нөлдік ерітінді ретінде тура сондай ертінді алынады, бірақ реакцияға керекті реагенттер қосылмайды. Оның орнына су немесе буферлі ерітінді енгізіледі. Бұл жағдайда реакцияда болатын өзгерістер әсерінен оптикалық тығыздық өзгереді (тотығу- тотықсызданудың нәтижесінде реагенттердің оптикалық тығыздығы төмендейді, не жоғарлайды, боялған комплекстер түзіледі.)
Неғұрлым нөлдік ерітіндінің оптикалық тығыздығы жоғары болса, солғұрлым фотометрикалық анықтаулар сезімтал келеді. Бұл заңдылық негізінде дифференциалды спектрофотометрия әдісі жатыр.
Жарықты сіңіру заңдылығының негізгі ауытқу жағдайлары
Егер, зерттелетін зат немесе ерітінді Бугер-Ламберт-Бер заңдылығына тәуелді болса, онда фотометриялық әдіс қолданылады. Яғни, оптикалық тығыздық мөлшері, зерттелетін зат концентрациясы мен оның қабатының қалыңдығына пропорционалды болады.(2-сурет) Бұл жағдайда, графиктегі абсцисс осінде ерітіндідегі зат концентрациясы (C), ал координат осінде оптикалық тығыздық (Д), координат басынан басталатын түзу сызық түрінде көрсетіледі .
Фотометриялық анализ, қатынастар бұзылған жағдайда қолданылмайды. Жарықты сіңіру заңдылығының ауытқу себептері мыналар:
* Монохроматты жарық ағынының жетіспеушілігі;
* Химиялық өзгерістер нәтижесінде зат концентрациясының өзгеруі (полимерлеу, диссоциация деңгейінің өзгеруі, комплексті байланыстың түзілуі), зат жағдайының өзгеруі (деформация т.б.).
Фотометриялық анализді қолдану мүмкіншілігі.
Фотометриялық анализдің негізгі 2 түрі бар: колориметрия және
спектрофотометрия. Заттың колориметриялық анализі, ерітіндінің оптикалық тығыздығын фильтрден бөлінетін кең диапозонды толқын ұзындығында өлшеу арқылы жүргізіледі. (полихроматты сәулеленуде).
Спектрофотометрияда монохроматты сәулелену (ені 2-3 нм) призмалық монохроматорды қолдануға негізделген. Бұл әдіс оның дәлділігін жоғарлатады,сонымен қатар жарықты сіңіру қасиеті жақын,бірақ толық сіңіруі әртүрлі болып келетін қоспадағы заттарға анализ жасауға мүмкіндік береді. Осыған байланысты спектрофотометриялық әдістің қолдану мүмкіндігі зор және жоғарғы дәлділігімен- нақтылығымен ерекшеленеді.
Спектрофотометриялық өлшеудің нақты дәлділігі, қолданылатын зат құрылымына және зат концентрациясына т.б. тәуелді. Оптикалық тығыздықтың орташа деңгейі (интервалы) 0,2-0,8 бірлік шамалары аралығында жатады. Оптикалық тығыздық өте жоғары, не төменгі мәнде болғанда қателік проценті артады. Үлкен ұзындықтағы кюветаларды қолданғанда, анықтаудағы салыстырмалы қателік төмендейді. Яғни, зерттелетін зат қабатының қалыңдығы артады. Дифференциалды спектрофетометрия әдісі жоғарғы дәрежелі дәлдікпен ерешеленеді. Мұнда нөлдік ерітінді ретінде, еріткіш емес, оптикалық тығыздығы зерттелетін затқа жақын ерітінді алынады. Қазіргі уақытта спектрофотометриялық әдіс экспериментальды биологияда кеңінен қолданылуда, мысалы:
* заттардың әртүрлі сәуле спектрін сіңіруін зерттеуде
* сіңіру спектрі бойынша заттардың химиялық табиғатын анықтауда
* көрінетін және жақын ультракүлгін аймақта заттың концентрациясын анықтауда (пигмент, активті фермент тобы, нуклеин қышқылы, әртүрлі кофакторлар).
* Ферменттік процестің кинетикасын зерттеуде, реакцияларда оптикалық тығыздықтың артуы немесе кемуіне байланысты ферменттердің активтілігін анықтауда (цитохромоксидаза, аскорбиноксидаза, дегидрогеназа активтілігін).
Соңғы жылдары фотометриялық әдістің жаңа модификациялары жасалынды,соның бірі дифференциалды спектрофотометрия.
1.2.2. Дифференциалды спектрофотометрия
Дифференциалды спектрофотометрия әдісі жоғарғы деңгейдегі дәлділігімен, сезімталдығымен ерекшеленеді және қазіргі кезде спектрді сіңіру қасиеті бар заттарға сандық , сапалық анализ жасауда кеңінен қолданылып жүр.Әдістің ерекшелігі, сіңіру спектрінің аз мөлшерін және жылдам өзгеруін тіркеу мүмкіншілігіне байланысты.Осыған сәйкес, жарықты сіңіретін басқа да компоненттерден тұратын жалпы қоспадағы белгілі бір заттарды анықтауда маңызды роль атқарады.Мысалы, митохондриялар және хлоропластылар бар суспензияда пигменттерді анықтауға мүмкіншілік береді.
Дифференциялды спектрофотометрия әдісі әртүрлі модификацияда кең түрде қолданылады, әсіресе жарық пен химиялық агенттердің әсерінен туындаған цитохром, хинон пигменттері және фотосинтездің,тыныс алудың электронды тасымалдау тізбегі компоненттерінің сіңіру спектрінің өзгерісін зерттеуде маңызды.
Әдіс мақсытының негізі спектрофотометриялық анықтаулардағыдай нөлдік сападағы таза еріткіш емес, құрамында тәжірибедегідей барлық компоненттер кіретін ерітінді алу. Тәжірибелік үлгі (проба) оптикалық тығыздығы <<0>> деп қабылданатын ерітіндімен салыстырылады.Тәжірибелік үлгінің бақылаудағы үлгіден айырмашылығы, жарық әсерінен немесе қандай да бір тотықтыратын және тотықсыздандыратын химиялық реагенттердің әсерінен өзгереді. Осындай әдіспен бақылау мен тәжірибелік үлгілердің арасындағы оптикалық тығыздықтың айырмашылығын табады.
Дифференциалды спектрді өлшеу құралы (прибор), жарықтың күшті көзі монохроматорды қосады. Монохромат жарығының сәулесі арнайы призманың көмегімен қарқындылықты тең екі тарамға бөледі.Жарықтың бір тарамы тәжірибелік,екіншісі бақылау кюветалары арқылы өтеді.
Өлшеу құралында жарық ағынының айырмасы тіркеледі:
( Д = Д 2 - Д 1 ).
Егер тәжірибелік үлгінің оптикалық тығыздығы өзгермесе, онда екі кюветадан өткен жарықтың қарқындылығын салыстырғанда, толқын шкаласының бойында оптикалық тығыздықтың айырмашылығы 0-ді көрсетеді. Егер тәжірибелік cынақтың оптикалық тығыздығы, тотығу-тотықсыздану әсерінен зерттелетін зат анықталған спектр аймағында өзгерсе, онда cол толқын ұзындығында тәжірибелік және бақылау үлгілерінің оптикалық тығыздығының айырмасы тіркеледі. Бұл айырмашылықтың оң болуы да (бақылау үлгісімен салыстырғанда тәжірибелік үлгінің оптикалық тығыздығы жоғары болғанда), теріс болуы да (оптикалық тығыздығы аз болғанда) мүмкін. Осыған байланысты зерттелетін заттың дифференциалды спектрінде, қалыпты спектрмен салыстырғанда,оның cіңіру максимумы әртүрлі толқын ұзындықтарында, оптикалық тығыздықтың оң немесе теріс мәндері аймағында байқалады.
1.2.3. Фотоэлектроколориметр
Фотоэлектроколориметр колориметриялық анықтауларда, оптикалық тығыздықты өлшеуде қолданылады. Фотоэлектроколориметр диафрагма мөлшерлерін өзгерту нәтижесінде, екі жарық ағындарын оптикалық компенсациялау принциптері негізінде жұмыс істейді. Анықтаулар белгілі бір спектр аймағындағы полихромат сәулелерінде жүргізіледі, яғни фильтрден бөлінген спектрлерде. Диафрагма саңылауларының мөлшерін барабан шкаласы бойынша анықтайды.Фотоэлементте пайда болған тоқ гальванометрдің жақтауы бойынша қарама-қарсы бағыттарда ағын түзеді.Осыған байланысты,фотоэлементке жарықтың біркелкі түсуінде фотоколориметрдің стрелка көрсеткіші нөлге тең болады.
Фотоколориметрмен жұмыс істеу тәртібі
Өлшеуден бұрын фотоколориметр тексеріледі. Ол үшін пердені ашып және нейтральды жарық фильтрді қосып, 20 минут қыздырады. Гальванометр арретирі ашылады. Сол жақ барабанды жарықты 95 % мөлшерінде өткізетіндей қалыпқа келтіріп, стрелканы 4 және 5 ұстағыштарды пайдалану арқылы 0-ге әкеледі.
20 минуттан кейін пердені жауып, гальванометр стрелкасының жағдайын тексереді. Егер стрелка қозғалып кетсе, потенциометр ұстағышымен 0- ге келтіреді.
Бұдан кейін жұмысқа қажетті жарық фильтірін қосып , пердені ашып, гальванометр стрелкасының барлық сатыдағы сезімталдық жағдайын тексереді.Cтрелканы сұр жарықшалармен байланысқан 4 және 5 қондырғылар көмегімен 0-ге қояды.
Оптикалық тығыздықты өлшеу үшін, сол жақ барабанды 0-ге қоямыз. Бұл кезде диафрагма толығымен ашық болады. 4-5 жарықшаларды айналдыру арқылы гальванометрдің стрелкасын 0-ге келтіреміз. Сонан кейін оң жақтағы жарық ойығына зерттелетін ерітінді орнына, еріткіші бар кюветаны орналастырады. Бұл жағдайда жарық ағынының теңелуі бұзылады да, стрелка ауытқиды.Стрелканы өлшеу барабанын (7) айналдыру арқылы қайтадан 0-ге келтіреміз.Зерттелетін ертіндінің оптикалық тығыздығының мәні сол жақ барабанның шкаласы арқылы анықталады.
1.2.4. Спектрофотометр
Спектрофотометрдің фотоколориметр сияқты бірнеше типтері бар.Бұл құрал ертінділермен қатты заттардың 220-1100 нм аралығындағы сіңіру спектрін анықтайды.Спектрофотометрде тәжірибелік үлгінінің оптикалық тығыздығы, 100% өткізгіштікте негізгі эталон болып саналатын бақылау үлгісімен салыстырмалы түрде өлшенеді.Эталон тығыздығы жарықты 100% өткізуде 0-ге теңестіреді.Бақылау және тәжірибе үлгілерін белгілі бір толқын ұзындығында сәуленің монохроматикалық жарық жолында кезекпен орналастырады.Тәжірибелік үлгі арқылы өткен жарық ағынымен,бақылау үлгісі арқылы өткен жарық ағынының қарқындылықтарының қатынасы, потенциометрдің санау шкаласы бойынша анықталады.
Айна өзіне түскен сәуле шоғын 90 градусқа бұрып,оны пластинкамен (5) қорғалған жарық өтетін саңылауға (4) бағыттайды.Жарық шоғы осындай жолмен айнадан обьективке (6),онан жарықты спектрлерге ыдырататын призмаға (7) өтеді.Призманың бір қыры күмістелген,сондықтан да,дисперсиялық шоқ қайтадан обьективке (6) және шығатын саңылауда (4) шоғырланады.Призманы (7) бұрай отырып,спектрдің белгілі бір бөлімдерін саңылауға қарай бағыттауға болады.
Mонохроматикалық шоқ саңылау арқылы (4) кварц линзаға (8),одан жарық фильтрі (9) арқылы ертінді бар кюветаға (10) қорғаныш қызметін атқаратын кварц шынысы мен пердеге (12) және жарық сезгіш фотоэлементке (13) өтеді.Пайда болған жарық ағыны кернеуді төмендетеді.Кернеу шамасы фотоэлементтен түскен жарық энергиясына тура қатынаста.Спектрофотометрде жарық ағынының абсолютті шамасы өлшенбейді,тек оның өзгерген түрі ғана анықталады.
+ Электрофорез әдісінің теориялық негізі
Биология, химия, молекулалық биологияның қарқынды дамуы, жоғарғы сезімтал және тез жүретін тиімді зерттеу әдістерінің жылдан жылға тұрақты дамуын тудырып отыр. Мұндай сезімтал жаңа зерттеу әдістері, организмде өте аз кездеестін биологиялық активті заттарды ( фермент, гармон, нуклеин қышқылы) анықтауда ерекше маңызды роль атқарады. Осыған байланысты биологияда сандық зерттеулерде, биологиялық материалды аз мөлшерде қажет ететін, тез және дәлді диагностикалық әдістер керек. Осындай зерттеу әдісінің бірі электрофорез.
Электрофорез белокты қосылысты бөлудегі ең негізгі физикалық әдіс, сонымен қоса белокты препараттың тазалығын сипаттайтын әдіс. Соңғы жылдары бұл әдіс ферменттерді бөлуде кең қолданылады.
Электрофорез әдісін қолдану мақсаттары (қағазды электрофорездің, полиакриламид геліндегі, макро- және микрофорездің) мынада. Белок молекуласының құрамында қышқылды және негізгі иондаушы топ бар, сондықтан да бос электрлі зарядтар болады. Бос электр зарядтарының мөлшері белок молекулаларындағы қышқыл және сілтілі топтардың ара қатынасымен, сыртқы ортаның рН мөлшеріне тәуелді. Минимальды электр заряды бар белоктағы рН мөлшері изоэлектр нүктесі деп аталады, жалпылап алынған JEP белгісімен белгілейді.
РН мөлшері JEP-ке тең белок ешқандай полюске қарай қозғалмайды. Егер де, белок молекуласы JEP жағдайында болмаса, онда теріс заряд мөлшері оң заряд мөлшерлеріне тең болады. Бұл жағдайда сыртқы электр өрісінің әсерінен зарядтар қарама-қарсы зарядтарға қарай жылжиды.
Белгілі бір рН жағдайында, ионды күште және тұрақты температура жағдайында әртүрлі белоктардың молекулаларында бос зарядтардың мөлшері әртүрлі, осыған байланысты белоктар әртүрлі белдеулерге немесе фракцияларға бөлінеді. Белок қосылыстарының мұндай бөліну принциптері электрофорездік әдістің көптеген варианттарының негізін құрайды. Сондықтан да, электрофорез деп зарядталған бөлшектердің электр өрісінің әсерінен ерітіндідегі қозғалысын айтады. Біркелкі электрлеу өрісінде сфералық бөлшектердің қозғалысын тудыратын күш мынаған тең:
Q E = 6 П · r · n · v
мұндағы, Q- бөлшектердің электр заряды; E- электр өріс кернеуі; r - бөлшектердің радиусы; n - ортаның қоймалжыңдылығы; v - бөлшектің жылжу қарқыны.
Тұзды буферлі еретенділерде, бөлшектердің бір-біріне әсер етуіне байланысты, зарядталған бөлшектердің жылжу қарқыны біршама төмендейді. Оны есептеу үшін оның электрокинетикалық потеницалын, бөлшектерді қоршаған ортаның тығыздығын және оның зарядын білу қажет.
Бөлшектердің жылжуы дегеніміз, оның жылжу жылдамдылығының электр өрісінің кернеуіне қатынасы:
U = __V__ = Q___ [ cм2 ]
E 6Пrn сек
Бөлшектердің жылжуына, электр өрісініңі кернеуі мен қатар ортаның рН жағдайы, ионды күші, буферлі ерітіндінің концентрациясы әсерін тигізеді. Сонымен қатар, бөлшектердің негізгі жылжуы, иондардың негізгі зарядымен анықталады. Оның өзі әлсіз қышқыл мен сілтінің диссоциациялау дәрежесімен немесе амфотерлі қосылыстардың pH дәрежесімен және молярлы салмағымен анықталады.
Осылардың негізінде мынандай қорытынды жасауға болады; бөлшектердің электрофорездегі қозғалысы көптеген факторларға тиісті: молекулалардың салмағына, мөлшеріне, пішініне, электр зарядына, концентрацияға, бөлшектердің гидротация және диссоциация дәрежелеріне, тұтқырлығына,рН дәрежесіне, температураға, ортаның ионды күшіне, электр өрісінің кернеуіне, бөлшектердің электрофорез арқылы жүрген жолы мен ұзақтығына.
Қазіргі уақытта биология, химия, медицина т.б. ғылыми салаларда ғылыми зерттеу жұмыстарын жүргізуде полиакриламид гелінің негізіндегі электрофорез әдісі кеңінен қолданылуда.
Төменде гельді-электрофорезбен жұмыс істеу әдісі көрсетіліп отыр.
1.3.1. Диск- электрофорез.
Полиакриламидті гелдің құрылысы және қасиеттері.
Полиакриламидті гель полимеризацияланған акриламид өнімінен тұрады СН2 = СН - СО - NH2. Сонымен қоса қандай да бір басқа агентті тіркеп алады, мысалы, NN - метиленбисакриламид
CH 2 = CH - CO - NH - CN 2 - NH - CO - CH = CH 2 келесі құрылыста болады:
CH2
I
NH
I
CO
І
- CH2 - CH - [ CH 2 - CH ]п CH2 - CH [ CH 2 - CH ]п CH2 -
| | |
CH CO CO
| | |
NH2 NH NH2
|
CH 2
|
NH
|
CO
I
- CH 2 - CH - [ CH 2 - CH ]п CH2 - CH -[ CH 2 - CH ]п CH2 -
| | |
CO CO CO
| | |
NH NH2 NH2
|
CH2
I
NH
|
CO
|
- CH2 - CH - - [ CH 2 - CH ]п CH2 - CH -[ CH 2 - CH ]п CH2 -
| | |
CO CO CO
| | I
NH 2 NH NH2
Полиакриламид тізбегінің өсуші қосылыстарының арасында көлденең байланыстың тузілуі арқасында, яғни полимеризация нәтижесінде винилді топ түзіледі. Мұндай гель үш деңгейлі торлы құрылыста болады.Полимеризациялаудың басында көп мөлшерде ретсіз орналасқан статистикалық полимерлі гелдің түйіршіктері түзіледі,мұнан кейін полиакриламид тізбегінің реттелуі жүреді.Бұл түйіршіктер өседі,яғни жартылай функцияналды қосылыстың түрі N1N - метиленбисакриламид тізбегі осындай жағдайда, басқа тізбектегі соңғы бос функционалды топпен әрекеттесу үшін жақындайды,сонан түйіршіктер арасында көлденең тізбектер түзіледі.
Полиакриламидті гель полимеризацияланған синтетикалық өнімдерден тұрады. Олардың мынандай қасиеттері бар: химиялық тұрақтылығы, инерттілігі, жылтырлығы, мобилді құрылысы (яғни қажетті көлемдегі саңылаулары бар гелді алуға болатын мүмкіндігі), адсорбция және электроосмосы жоқ, рН-тың өзгеруіне, темпеатураның өзгеруіне және көптеген ерітінділерде ерімеуіне тұрақтылығы.
Гелдің тұтқырлығы, икемділігі полиакриламидтің полимеризация дәрежесіне ( яғни тізбек ұзындығына) және тізбек дәрежесіне ( яғни N1N - метиленбисаакриламид қосылу санына) тәуелді. Сонымен қатар, гелдің қасиетіне акриламид және метиленбисакриламид салмақтарының ара қатынасы да әсер етеді.
Егер, ол 10 : 1 қатынасынан төмен болса, онда гель сынғыш, қатты және лайланған болады, егер де ол 100 : 1 өссе, онда гель қоймалжың өте тұрақсыз болады.
Эластикалық және жылтыр гель 30 : 1 қатынасында алынады, бұл кезде акриламид концентрациясы 3 % жоғары болуы қажет.
Гелдегі саңылаулардың мөлшері полимеризация дәрежесі және тізбек дәрежесі бойынша анықталады. Бұл параметр әртүрлі формадағы молекулаларды, молекулалық сүзгі арқылы бөлуде маңызды роль атқарады. 7,5 % полиакриламид гелінде саңылаудың орташа диаметрі 50 А тең, ал 30 % гелде 20А, полиакриламидтің сәйкес концентрациясынан керекті мөлшердегі саңылауы бар гелді алуға болады.
Тізбектеуші агенттің қызметіне байланысты әртүрлі көз қарастар бар. Кейбір зерттеушілер саңылаудың мөлшері тізбектелген агенттің концентрациясына тәуелді деп есептесе, ал екінші бір зерттеушілер тізбектелу дәрежесі гелге тек қана беріктілік, мықтылық береді деп есептейді.
Белок молекулаларының қозғалысы мен саңылаулардың орташа диаметрдегі мөлшерінің қатынасы гелдің барлық концентрациясында бірдей болмайды. Жоғарғы және төменгі концентрацияларда қатынастық ауытқу байқалады.
Диск - электрофорез көмегі арқылы белоктың молекулалық массасын мына формула бойынша анықтауға болады.
MG = K ( 1/C) 3 M/ D = 0,5
M- молекулалық масса; С- гелдің концентрациясы; М- гелдің концентрациясы кезіндегі қозғалыс С ; Д- бос қозғалыс.
Әрбір белок үшін С көрсеткішін табуға болады, М/Д = 0,5 болғанда және график құруға болады. Абсцисс осінде ( 1/С)3 концентрация көрсеткіші, ал ординат осінде белоктың молекулалық салмағы көрсетіледі. Бұл көрініс жоғарыдағы 8 суретте көрсетілген.
Көрсетілген теңдеуді полипептиттерге және аз молекулалық массасы бар белоктарға қолдануға болады.
Диск - электрофорездің құрылысы мынадан тұрады: электродтар, электрофорезге қажет толтырылған түтік, арнаулы қоректер және полиакриламидті гелі бар кішкентай колонкалар.
Гель үш компоненттен тұрады:
* Зерттелетін ерітіндісі бар ірі саңылаулы стартты гель ;
* Зерттелетін заттың концентрациясы жүретін ірі саңылаулы концентрациялаушы гель .
3.Ұсақ бөлшектерге бөлетін гель .
Электрофорез кезінде бөлінуші заттың ионын бір бағыттағы қозғалысына байланысты екі топқа ажыратады: жүргізүші ион және тұйықтаушы ион. Жүргізуші иондар қолонканың барлық үш бөлігінде де болады, ал тұйықталған - тек буферлі электродта болады. РН көрсеткіші старт үшін және концентрациялаушы гель үшін былай таңдалып алынады. Эффективті, қозғалыстағы жүргізуші (L) және тұйықталған (F) иондары және белоктар (Р) келесі ретте орналасқан.
UL AL> UP AP> UF AF
Гелдің барлық жүйесіне тоқ жібергенде, жүргізуші ион үлкен қозғалыстың нәтижесінде белокты және тұйықталған ионды қуып жетіп, соңынан аз электр өткізгіштігі бар аймақ қалдыруы керек. Меншікті электр өткізгіштіктегі кернеу, электр өрісіне кері қатынаста. Оны мына теңдеуден көруге болады
Y
Е= ------- [ B/см ]
X
Мұндағы, кернеулік өріс тоқ тығыздығының Y
[ а/ cм2 ] меншікті электр өткізгіштігіне қатынасы, яғни бұл белдеудегі кернеулілік біршама жоғары болады, соған байланысты белок қозғалысы және тұйықтайтын иондардың жылдамдықтары артады.Олар жүргізуші иондардың соңынан сол жылдамдықта қозғалып отырады.Бұл құбылыс мына теңдеуде көрсетілген:
UY
V = EU = X [ см/ сек ]
V- бөлшектер жылдамдығы
E- кернеу өрісі;
U- бөлшектердің қозғалысы.
Егер қозғалысқа әсер ететін күш бәріне бірдей берілсе, иондардың барлық түрі бірдей жылдамдықта қозғалады.
V = EL UL = EP. UP
Mұндай жағдайда жүйеде тепе-теңдік орнап, иондар қозғалысы реттеледі. Осымен байланысты жүргізуші және тұйықтаушы иондардың арасында қозғалыс шекарасы түзіледі. Сонымен қатар, осы уақытта өріс кернеуі біршама жоғары және біршама төмен кернеу аймақтарына бөлінеді.Осы кезде белоктардың қозғалысы жүргізуші иондардың қозғалысынан біршама төмен, бірақ тұйықтаушы иондардың қозғалысынан біршама жоғары болады. Белоктар концентрациясы жоғарылайды. Жеке белоктар қозғалғыштығына сәйкес, гель колонкасында жүргізуші және тұйқтаушы иондардың арасында кезектесе орналасады. Нәтижесінде бірнеше микроннан тұратын қалың дискі түзеді. Жүргізуші және тұйықтаушы иондардың арасындағы қозғалыс, концентрациялаушы және бөлгіш гель арасындағы шекараға ие бола отырып, белокты аймақ үздіксіз бұзылуда болады. Себебі , бөлгіш гель саңылаудың басқа мөлшерімен және рН-тың басқа көрсеткішімен сипатталады. Бөлуші гелдегі рН-тың өзгерген мәні тұйықтаушы иондардың диссоциация дәрежесінің және қозғалғыштығының бірнеше есе өсуімен байланысты.
В[+] катионы және Cl [ - ] анионы бар буферлі ерітіндіні белокқа Р құяды. В[+] және G- (глиценатион) ионы бар буферде белок алдын-ала ерітілген. Бұл жағдайда глицинат және хлор иондарының арасында айқын қозғалыс шекарасы түзіледі.
Иондар концентрациярының арақатынасы мына теңдеумен анықталады.
G UG Z C l (UCl-Bb))
--- = ------------------------
Cl UCl ZG (UG-UB)
U- қозғалыс; Z- заряд; C- концентрация; a- диссоциация дәрежесі.
Концентрациялану шегіне жету үшін рН көрсеткіші 1-ші және 2-ші аймақта өзгереді, яғни аниондар өзінің тиімді қозғалысы бойынша келесі ретте орналасады.
РН-тың "жаңа" көрсеткішін, бөлгіш гель үшін мына формула бойынша анықтауға болады.
aG
PH=(PKa)G+ -------
1-aG
" Ең тез" 7,5 % гелде сарысу белогы - проальбумин ионының қозғалысы 5,0 бірлікке тең.Глицианат- ионының тиімді қозғалысы 5,0 бірліктен кем болмауы керек, бұл жағдайда келтірілген формула бойынша рН көрсеткіші 9,5 тең болады. Нәтижесінде жүргізуші иондардың қозғалысына ұқсас қозғалысқа тұйықтаушы иондар ие болады.Осының салдарынан электр өрісі өзгеріп, белоктар тұрақты pH мәнде және тұрақты өріс кернеу аймағында қозғалады. Бұл кезде олар негізгі электрофорез аймағында жылжиды және өзінің мөлшері, формасы, молекулалық электр заряды бойынша бөлінеді. Белоктардың молекуласының салмағы әртүрлі: егер де олар бос қозғалыста болса , гелдегі қозғалу жылдамдығы да әртүрлі болады. Осыған байланысты олар гелде бөлінеді.
Буферлі жүйенің негізгі мақсаты- заттардың максимальды бөлінуін қамтамасыз ете отырып, олардың еріту қасиетін өзгертпей, химиялық, биологиялық төзімділігін сақтау.
1.4. Хроматография әдісінің теориялық негізі
Хроматография- сұйық және газ тәрізді қоспаларды физико-химиялық жолмен бөлу әдісі.Қазіргі кезде хроматографиялық әдіс физиологиялық және биохимиялық зерттеулерді жүргізулердегі негізгі әдістердің бірі болып табылады .Хроматографиялық анализдің негізін 1904 жылы М.С. Цвет қалады. Ол жапырақ пигменттерін бөлуде алғашқы рет адсорбциялы хроматографияны қолданды.
Хроматографияның түрлері, бөлінетін заттардың арасындағы күштерге және сұйық немесе қатты фазаның бетіне байланысты 3 топқа бөлінеді:
* Адсорбциялық хроматография.
* Бөліп таратқыш хроматография.
* Тұнбаға түсіру хроматографиясы.
Адсорбциялық хроматография адсорбенттегі қоспаның компоненттерінің әртүрлі адсорбциялануына негізделген.Адсорбциялық хромоттография екіге бөлінеді:молекулалық және ионды.
М.С. Цветтің классикалық әдісінің негізі - заттардың сорбентті колонка арқылы өткенде молекулалық күштер әсерінен адсорбциялануында. Қоспаның әрбір компоненттерінде бұл күштер әртүрлі болып келеді. Сондықтан, егер ерітіндіні сорбент қабатынан өткізсе, пигменттер сорбент колонкасында әртүрлі түсте боялған белдеулер түрінде орналасады. Жоғарғы жағында сорбентпен берік байланысқан компоненттер, ал төменгі жағында әлсіз байланысқандары орналасады.Хроматографияланатын компоненттер сорбентте адсорбциялық қатарды - А,В,С...құрайды. Колонканы таза еріткішпен жуғанда заттар жоғарғы қабаттардан жуылып, төменгілерде қайтадан адсорбцияланады. Мұнда Цветтің адсорбциялық алмасу заңы жүзеге асады:яғни, қоспаның сорбентке адсорбциялық жағынан жақын компоненті, коспаның басқа компоненттерін ығыстырады.
Полярлы сорбенттерді қолданғанда (целлюлоза, сахароза),бөлінетін зат пен сорбент арасындағы байланыстың беріктілігі,бөлінетін заттың полярлығына байланысты болады.Мысалы, пигменттерді бөлу үшін полярлы емес еріткіштер жүйесіне, полярлы еріткіштің белгілі бір мөлшерін қосады. Бұл жағдайда полярлы пигменттердің хроматограммадағы белдеулік орны ,оның полярлы сорбентпен әрекеттесу күшімен анықталады. Мұнда,неғұрлым полярлы пигменттер ( хлорофилл, неоксантин), полярлы сорбенпен берік байланыс түзсе, старт сызығында қалып қояды, ал полярлы емес пигменттер ( каротин), еріткіш ағынымен орын ауыстырып, пигментті енгізген жерден алысырақ орын тебеді.
Демек, адсорбент колонкасында қоспаның компоненттерінің орналасуы, компоненттердің адсорбциялық қатардағы орнын сипаттайды.
Молекулалы адсорбциялық хроматография қағаздағы және қолонкадағы хроматографиялауда негізгі орын алады. Пигменттерді бөлу адсорбциялық хроматография принципіне негізделген.
Ион алмасу хроматографиясында заттарды бөлуге ерітінді мен ион алмасытрушы адсорбент арасындағы иондардың ауысу процесін қолданады. Адсорбенттің химиялық құрылымына байланысты катионит және аниониттерді ажыратуға болады. Катиониттерде активті қышқыл радикалдар болады. Олардың Н- ионы алмасуға қабілетті,сондықтан да, заттар қоспасын катионит арқылы өткізгенде оң зарядталған компоненттер ғана ұсталып қалады. Демек, осы жолмен аминқышқылдарының да қоспасын бөлуге болады. Қышқыл рН мәні бар буферді қолданып ( қышқыл ортада аминқышқылдарын оң зарядты тасымалдайды) аминқышқылдарының қоспасын катионитте адсорбциялайды.Буфердің pH мәнін біртіндеп өзгерте отырып, колонкадан адсорбцияланған аминқышқылдарының жеке топтарын бөліп алады.
Ион алмасу адсорбциясының механизмі молекулалы адсорбция механизімінен ерекшеленеді. Ион алмасу адсорбциясында қозғаушы күштері болып ионды күштер табылады. Иондардың адсорбентпен байланыс энергиясы молекулалық адсорбцияның байланыс энергиясынан неғұрлым жоғары.
Бөліп таратқыш хроматография, өзара араласпайтын екі сұйық фазалардың арасындағы компоненттердің әртүрлі орналасуына негізделген. Фазаның біріншісі қозғалғыш, екіншісі- қозғалмайтын болып келеді.
Қатты тасымалдағыш ( қағаз, колонканың ұнтақ заты), өз бетінде еріткіштің қозғалмайтын фазасын ұстап тұрады. Қандайда бір органикалық еріткіш ( фенол, н-бутил спирті, коллидин), сумен жартылай немесе мүлде араласпай, қозғалтқыш еріткіш болып табылады. Заттың зерттелетін қоспасын (мысалы, аминқышқылдарының қоспасын) қағазға немесе колонканың жоғарғы жағына енгізіп, таза қозғаушы еріткішті жібереді. Хроматография процесінде әртүрлі компоненттердің коэффициенттері де, әр қилы болғандықтан, жеке компоненттер қозғаушы еріткіштің әсерінен, әртүрлі жылдамдықпен орын ауыстырады. Жылжымалы фазаға ұқсас келетін қоспаның компоненттерінің жылдамдығы жоғары болады. Мұнда, компоненттер бір-бірінен ажырап әртүрлі аймақтарда белдеу немесе дақ түрінде орналасады. Дақтардың орнын сипаттау үшін Rf өлшемі енгізіледі.
Заттардың жылжу жылдамдығы 1
Rf=----------------------------------------------------- = ---
Еріткіштің жылжу жылдамдығы L
Мұндағы, 1- хроматограммадағы дақтың орталық деңгейі мен старт арасындағы қашықтығы; L - еріткіштің старт және қозғалыс шегі арасындағы қашықтығы.
Бөліп таратушы хроматография аминқышқылдарының, пептидтердің, органикалық қышқылдардың,пигменттердің қоспаларын қағазда бөлудің хроматографиялық әдісіне негізделген.
Тұнбаға түсіру хроматографиясы түзілетін тұнбалардың әртүрлі ерігіштігіне негізделген. Бөлінетін тұздардың қоспаларын тасығышы бар колонкадан өткізеді. Ол тұндырғыш ерітіндісімен сіңірілген болуы қажет. Тасымалдағыш жақсы сүзілген жоғарғы дисперсиялды зат, тұндырушы ретінде тұнатын иондармен қосылып, қиын еритін тұнба түзеді .
Хроматографиялық әдістерді қолдануда, кейінгі жылдарда хроматографиялаудың жаңа тәсілі енгізілді.Бұл жұқа қабатты хроматографиялық тәсіл.
Жұқа қабатты хроматография шыны пластинкаларда сорбенттің жұқа қабатында жүргізіледі.Жұқа қабатты хроматография басқа әдістерден ерекшеленеді және тиімді болып табылады:
* заттарды жылдам бөлуге болады;
* үлкен концентрациялы заттарды бөлу мүмкіндігі бар;
* заттарды бөлуде анық шектелген белдеулерді алуға болады;
Жұқа қабатты хроматографияда заттарды бөлу үшін әртүрлі сорбенттер қолданылады: глюкоза, сахароза, маннит, целлюлоза, силикагель, алюминий тотығы , магний тотығы.
Сорбенттер бөлшектерінің мөлшеріне және аквтитілік дәрежесіне байланысты ажыратылады. Ең активті сорбенттердің бірі алюминий тотығы болып табылады: сахароза, аквтитілігі төмен сорбентке жатады.
Кейбір сорбенттер заттардың тұрақтылығын сақтайды ( маннит, сахароза, глюкоза) және олардың хроматография кезінде бұзылмауын қадағалайды. Силикагель сорбент ретінде қолданғанда, оған СаСО3 - антиоксидаттар және аскорбин қышқылын қосады (әсіресе пигменттердің бұзылмауы үшін).
Хроматогграфия әдістерінің тиімділігін арттыру үшін, оған әсер ететін бірқатар факторларды ескеру қажет:
Ылғалдық әсері. Жүйеге су қосқанда сорбенттің аквтивтілігі төмендейді, өйткені оның байланыстары сумен қанығады. Сорбенттің пигменттермен байланыс энегриясы әлсіреп, анық емес белдеулерді түзеді. Сондықтан хроматография үшін дайындалған экстрактыда су болмауы керек. Ацетондағы, күкірт немесе петролейн эфиріндегі экстрактыларды пластинкаларға енгізеді. Ацетондағы зат экстрактыларын сусыз этил немесе петролейн эфиріне ауыстыруға болады. Қажет болса, зат ерітініділерін сусыз күкірт қышқылды натриймен кептіреді.
Жұқа қабатты сорбент бар пластинканы зат қоспасын енгізбес бұрын термостатта 15-20 минут 40 С0 активтейді ( сахароза үшін) немесе 100-110 С0 ( силикагель үшін), cонан кейін эксикаторда СаCl 2 - де суытады.Экстракт тамшысы енгізілгеннен кейін, пластинкадағы дақты ауа ағынымен кептіреді.
Температураның әсері. Адсорбция экзотермиялық процесс болып табылады, ал кері процесі - десорбция жылуды сіңіру арқылы жүреді. Температура төмендегенде адсорбциялық тепе-теңдік адсорбция бағытына ығысып, адсорбцияланған зат мөлшері артады.Мысалы,температура жоғарылағанда пигменттердің адсорбциясы төмендейді, молекулалардың жылжу қозғалысы энергияның жоғарылауымен және десорбция жылдамдығының артуымен сипатталады.Сондықтан, пигменттерді хроматографиялау төменгі температурада жүргізіледі, ең оптимальды температура 10-15 С0.
Концентрацияның әсері. Зат концентрациясы жоғары болған кезде,адсорбциялану деңгейі төмен болады, керісінше төменгі концентрацияда адсорбциялану коэффициенті жоғарылап , заттардың хроматограммада бөлінуі жақсы жүреді.
5. СТУДЕНТТЕРДІҢ ӨЗДІК ЖҰМЫСТАРЫНЫҢ ТАҚЫРЫПТАРЫ:
5.1. Өсімдік клеткасының құрылысы
5.2. Цитоплазма, оның физикалық қасиеті және субмикроскопиялык, құрылысы, химиялык, құрамы.
5.3. Вакуоль, оның түрлері, пайда болуы. Клетка шырыны.
5.4. Клетка қабығы, оның құрылысы, түрлері.
5.5. Клетка онтогенезі.
5.6 Жабыңдық, арқаульқ, өткізгіш ұлпалар, олардың цитологияльқ сипаттамасы, денеде орналасу ерекшеліктері.
5.7. Негізгі паренхималық ұлпалар, олардың цитологиялық сипаты,денеде орналасуы.
5.8 Өсімдіктің вегетативті дене мүшелерінің
морфологиялық және анатомиялық құрылыстары
5.9 Тамырдың анатомиялық, морфологиялық құрылысы. Тамырдың түр өзгерістері.
5.10 Сабақтың морфологиялық және анатомиялық құрылысы, түр өзгерістері.
5.11 Бүршік және өркен, олардың құрылысы, пайда болуы.
5.12 Жапырақтың морфологиялык, және анатомиялық метоморфозасы.
5.13 Жыныссыз көбею,оның түрлері.
5.14 Жынысты кобею.
5.15 Жоғарғы споралы өсімдікгердің дамуы, ондағы ұрпақтың алмасуы. (ядро фазаларының алмасуы)
5.16 Жалаңаш тұқымды өсімдіктердің даму циклі. (спорогенез,гаметогенез) Ұрпақтың алмасуы.
5.17 Жабық тұқымды өсімдіктердің дамуы.Гүлдің құрылысы. Спорогенез, Гаметогенез, тозндану,урықтану құбылыстары.
5.18 Тұқым және жемістің пайда болуы, олардың құрылыс ерекшеліктері.
6. ПӘНДІ ОҚУ БОЙЫНША ӘДІСТЕМЕЛІК ҰСЫНЫСТАР
Өсімдіктер физиологиясы пәнінің сипаттамасы.
* Өсімдік физиологиясы пәнінің мақсаты.
Кейінгі жылдарда биология ғылым саласында молекулярлы биологияның биохимия және биофизика сияқты жаңа ғылым салалары пайда болды. Бұл ғылыми салалар жалпы өсімдік физиологиясының дамуына, көптеген фиизиологиялық құбылыстарды жаңа ғылыми тұрғыда зерттелуіне әсерін тигізді. Өсімдік физиологиясы пәнінен ұсынылып отырған кеңейтілген жаттығу практикумы, студенттердің бұл пәнен алған теориялық білімін ары қарай дамытуға, бекітуге қажет. Осыған байланысты өсімдік физиологиясының тарауларын негіз ете отырып, 8 сағат деңгейіндегі зертханалық-практикалық сабақтар ұсынылып отыр. Бұл кеңейтілген жаттығу практикумының жұмыс бағдарламасы өсімдік физиологиясы пәнінің мемлекеттік стандартты бағдарламасы негізінде құрылып отыр.
Өсімдік фиизологиясының кеңейтілген практикумының басқа биологиялық пәндермен байланысы.
Өсімдік физиологиясы биологиялық ғылымдардың бір саласы, ол басқа биологиялық ғылымдарымен тығыз байланысты.
Ботаника пәнімен.
Өсімдік физиологиясының негізгі тақырыптарының бірі <<Клетка физиологиясы>>. Клеткадағы физиологиялық процесстердің жүруі оның құрлысының дамуына тікелей байланысты. Сондықтанда клетка құрлысы туралы мағлұматтар студенттерге өсімдік анатомиясы мен морфологиясы пәнінде беріледі. Клетканың онтогенезін биогенезіне байланысты материалдарды оқуда блтаникада берілген мағлұматтарға сүйену қажет.
Бейорганикалық химия.
Зертханалық жұмыстарға қажетті ерітінділерді тотығу-тотықсыздану процестерін қарауда бейорганика пәнінде берілген білімге сүйнеді.
Органикалық химия.
Өсімдік физиологиясында өсімдіктердің тіршлігін қамтамасыз ететін өте күрделі зат алмасу құбылыстары қаралады (ассимиляциялық және диссимиляциялық). Бұл процесстерде негізгі органикалық заттардың (белоктың, көмірсулар мен майлардың) ыдырауы немесе синтезделуі қаралады (мысалы фотосинтезде глюкозаның пайда болуы). Бұл процесстерді оқуда химияда берілген органикалық заттардың структуралық құрлысына, қасиеттеріне байланысты білімді негіз ету керек.
Физикалық және каллоидты химия.
Өсімдік физиологиясында фотохимиялық және хромотографиялық әдістер кеңінен қолданылады. Олардың теориялық негіздері физикалық және каллоидты химияда беріледі. Сонымен қатар <<клетка физиологиясы>> тақырыптарында осмостық, тургорлық плазмолиз, деплазмолиз, гидротация және сольтватация сияқты құбылыстардың жүруін түсіндіруде физколлоидты химияда берілген білімге сүйену қажет.
7. ОҚУ - ӘДІСТЕМЕЛІК ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІНІҢ ҚАМТУ КЕСТЕСІ
4 кесте
№
Оқулық және оқу-әдістемелік Құралдың атауы
Саны
Студент саны
Қамтылу пайызы,%
1
Валиханова Г.Ж. <<Өсімдіктер физиологиясының үлкен практикумына арналған әдістемелік нұсқау>> Алматы,1995, 33 б.
24
18
100
2
Вознесенский В.Л., Зеленский О.В., Семихатова О.А. Методы исследования фотосинтеза и дыхания растений.М. 1965, 306 б.
12
12
100
3
Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. " Большой практикум по физиологии растений".М. Высшая школа, 1975, 392 б.
62
27
100
4
Гофман Ю.Я. , Микроэлектрофорез белков в акриламиндном геле. Биохимия, 1965,1160-1163.
4
15
100
5
Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений.Киев. Науково думка, 1973, 591 б.
30
27
100
6
Малый практикум по физиологии растений / под редакцией Мокроносова А.Т.М., МГУ,1994,183б
20
20
100
7
Мухамеджанов Э.К. Методика диск-электрофореза водорастворимых белков, Известия АН КазССР,серия биологическая №2,1967, 70-72 бет
68
11
100
8
Петров К.П. Практикум по биохимии пищевого растительного сырья-М. " Пищевая промышленность" 1965
4
15
100
9
Практикум по фотосинтезу и дыханию растений (под редакцией Полевого В.В.). С-Петербургский университет, 1997, 160 б.
3
10
100
10
Сказкин Ф.Д., Ловчинская Е.И. " Практикум по физиологии растений"-М, " Современная наука" 1953, 218 б
20
27
100
11
Чернавина И.А.,Потапов Н.Г., Косулина Л.Г., Кренделева Т.Е.Большой практикум по физиологии растений (под редакцией Рубина Б.А.).М.Высшая школа, 1978, 408 б.
20
27
100
8. ГЛОССАРИЙ
Ассимиляция - ассимиляция. Организмдердің сыртқы ортадан заттарды қабылдап, өздеріне тән күрделі органикалық заттарды синтездеуі. Бұл процесс энергия пайдалану арқылы жүзеге асады.
Ауксин - ауксин. Индол тобына жататын фитогармондар.
Биотехнология - биотехнология. Экономикалық жағынан тиімді де маңызды заттар өндіру және жоғары өнімділігі бар микроорганизмдердің штамдарын, өсімдіктердің сорттары мен формаларын, жануарлар асыл тұқымдарын шығару үшін биологиялық процестер мен объектілерді пайдалануға негізделген ғылым мен өндірістің жаңа саласы.
Вегетативтік клетка - вегетативная клетка. Жаңадан өсіп келе жатқан тозаңның ішіндегі клетканың бірі, ол тозаң түтігін түзеді, бірақ ұрықтану процесіне өзі тікелей қатыспайды.
Гаплоид - гаплоид. Сыңар, дара (гаплоидтық) хромосомалар жиытығы болатын ядро.
Гаплопродюсер әдісі - метод гаплопродюсера. Будан ұрықтан ата - анасының біреуінің хромосомаларының жойылып қалуы нәтижесінде шыққан гаплоид өсімдікті алу.
Генетикалық (гендік) инженерия - генетическая (генная) инженерия. Белгілі қасиеттері бар генетикалық материалдарын іn vitro алдын ала құрастырып, оларды тірі клеткаға енгізіп, көбейтіп, зат алмасу процесін өзгеше жүргізу.
Геном - геном. Белгілі бір түрге жататын организмдердің тек өзіне ғана тән сыңар (гаплоидтық) хромосомалар жиынтығы құрамына кіретін тек өзіне ғана тән бүкіл гендер.
Гиббереллин - гиббереллин. Фитогормон, негізінен флюорендер туындылары (мысалы гиббереллин қышқылы).
Детерминациялану - детерминация. Клеткалардың, ұлпа, мүше және организмнің белгілі бір даму жолына түсуіне дайындылығы, сонымен қатар басқа жолмен дамуға шек қойылады.
Дедифференциялану - дедифференциация. Маманданған, бөліну қабілетінен айырылған клеткалардың жаңадан пролиферацияға (бөлінуге) көшуі.
Дифференциялану - дифференциация. Даму процесінде біртекті клеткалардан морфологиялық белгілері және атқаратын қызметі әр түрлі клеткалар түзу.
Диплоид - диплоид. Хромосомалар саны екі еселенген, яғни әрбір хромосоманы жұптасып келетін ядро, клетка, организм. Диплоидтық хромосомалар жиынтығы сомалық (дене) клеткаларда болады.
Каллус - каллус. Ұлпа, өсімдік клеткаларының ретсіз бөлінуінің нәтижесінде пайда болады.
Өсімдік клеткаларын өсіру - культура клеток растений. Жасанды қоректік ортада асептикалық өсімдіктердің клеткаларын, ұлпаларын және мүшелерін өсіру.
Жеке клеткаларды өсіру - культура отдельных клеток. Жеке клеткалрды сирек отырғызып қоректік ортада өсіру.
Клеткалар суспензиясы - суспензионная культура. Жеке клеткаларды немесе кішігірім клеткалар топтарын аппаратура арқылы ауамен қамтамасыз етіп және араластыра отырп сұйық қоректік ортада өсіру.
Клеткаларды қорландырып (мерзімді) өсіру - накопительное (периодическое) культивирование. Клеткалар суспензиясын жабық ыдыста бастапқы құйылған қоректік ортасы жаңартылмай өсіру.
Клеткаларды үзіліссіз өсіру - непрерывное культивирование. Клеткаларды сұйық қоректік ортаның үзілмей беріліп тұратын ағынында өсіру.
Клеткаларды ағынды жабық жүйеде өсіру - закрытая проточная система культивирования. Клеткалар өсетін сұйық орта үздіксіз жаңа қоректік ортамен қамтамасыз етіліп тұрады, сұйық ортаның кіріп құйылу қарқыны мен оның төгіліп сыртқа шығу қарқыны бірдей болады.
Клеткаларды ағынды-ағынсыз жүйеде өсіру - полупроточная система культивирования клеток. Сұйық қоректік ортада өскен клеткалар суспенциясының бір бөлігі оқтын - оқтын алынып тұрады, оның орнына нақ сондай мөлшерде жаңа қоректік орта құйылып тұрады.
Клеткаларды ағынды ашық жүйеде өсіру - открытая проточная система культивирование клеток. Үздікссіз ағып кіріп тұрған жаңа қоректік орта мен төгіліп сыртқа ағып шыққан клеткалар суспензиясының қарқыны (көлемдерінің) тең болуы.
Клеткаларды турбидостатта өсіру - культивирование клеток в режиме турбидостата. Фотоэлементті қолданып биомасса концентрациясын тікелей бақылау арқылы, клеткаларды сыртқы жағдайдан ешқандай шектеусіз, үздіксіз өсіру.
Клеткаларды хемостатта өсіру - культивирование клеток в режиме хемостата. Құрамында өсуді тежейтін концентрациясы белгілі компоненті бар жаңа қоректік орта тұрақты жылдамдықпен биореакторға құйылып түсіп тұрады да, сондай жылдамдықпен өскен клеткалар суспензиясы алынып отырады.
Клеткаларды жаңа қоректік ортаға көшіру (пассаж) - субкультивирование, пассаж, пассирование. Клеткаларды жаңадан дайындаған қоректік ортасы бар шыны ыдысқа ауыстырып отырғызу.
Клеткалық инженерия - клеточная инженерия. Қайта құрастыру, будандастыру негізінде клетканың жаңа типін жасау әдісі.
Клон - клон. Қоектік ортада жалғыз бір клеткадан көбейген клеткалар.
Клондау - клонирование. Құрамында трансформация жолымен енгізілген ДНҚ - ы молекуласы бар, бактериялық клеткаларды қоректік агарға сеуіп, ДНҚ молекулалары қоспасын бөлу.
Корреляция - корреляция. Өсімдік мүшелерінің үйлесімді әрекеттесуі, ол метаболиттермен (трофикалық К.) немесе фитогармондармен (гормондық К.) реттеледі және жалпы өсімдік организімінің үйлесімді өсуі мендамуын қамтамасыз етеді.
Мацерация - мацерация. Өсімдік клеткаларын бөлу (ажырату), клетка аралық заттарды жою немесе еріту мақсатымен істелетін әрекеттер.
Мейоз - мейоз. Клеткалардың бөлінуінің ерекше жолы, әдісі.
Митоз - митоз. Эукариот клеткаларының негізгі және күрделі бөліну әдісі.
Нуцеллус - нуцеллус. Өсімдік тұқым бүршігінің орталық бөлігі.
Өсімдіктерді сауықтыру - оздоровление растений. Өсімдікті жасанды ортада (in vitro) өсіріп, бактериялық, саңырауқұлақтылық және вирустық ауру қоздырушылардан сауықтыру.
Протопласт - протопласт. Өсімдік клеткасы ішіндегі заттардың жалпы атауы.
Регенерант - регенерант. In vitro жағдайында қоректік ортада өсімдік клеткалары мен ұлпаларын өсіргенде пайда болып шыққан өсімдік.
Тотипотенттік - тотипотентность. Өсімдіктердің сомалық клеткаларының өсуге қабілеттілігін толық көрсете алуы.
Цитокинин - цитокинин. Фитогармон, химия жағынан пурин туындылары.
Эксплант - эксплант. Мүшенің немесе ұлпаның бөлігі.
Автотрофтық - автотрофизм. Өсімдіктердің фотосинтез немесе хемосинтез арқылы ауадағы, топырақтағы және судағы анорганикалық заттармен қоректенуі.
Аденозинфосфорлы қышқылдар - аденозинфосфорные кислоты. Аденозиннің фосфорлы эфир қосындысы түрінде мононуклеотидтерге жататын күрделі органикалық қышқылдар.
Адсорбция - адсорбция. Моленкулалық күштердің әсерінен адсорбенттер бетіндегі зат бөлшектерінің көбеюі. Биологиялық мембраналардың қызметтері, ферменттер мен реакцияға қатысушы заттардың өзара әрекеттесуінің алғашқы кезеңі, уытты заттарға қарсы қорғаныш реакциялары, топырақтан қоректік заттардың тамыр жүйесі арқылы өсімдікке сіңуі бәрі де абсорбция процесімен тығыз байланысты.
Алғашқы саңылаулар - первичные поровые поля. Морфологиялық жағынан ерекше, кейінде ұрық клеткалары дамитын алғашқы клеткалар.
Амилопластар - амилопласты. Өсімдік клеткаларында крахмал пайда болатын түссіз пластидтер. Лейкопластардың бір түрі. Көбінесе тамырда, тамыр сабақта, т.б. кездеседі.
Апопласт - апопласт. Судың және ондағы еріген қоректік заттардың сақталуын және өсімдік бойымен тасымалдануын жүзеге асыратын, барлық клетка қабықтарындағы талшық аралық және клетка аралық бстықтардың тұтасып байланысқан жүйесі (бос кеңістік).
Ассимиляттар - ассимиляты. Фотосинтез кезінде хлоропластарда ең алғаш пайда болатын органикалық заттар.
Ассимиляциялық крахмал - ассимиляционный крахмал. Фотосинтез нәтижесінде өсімдіктің хлоропластарында тікелей пайда болатын крахмал.
Әкшіл өсімдіктер - кальцефильные растения. Кальцийі мол, сондай-ақ әк, бор және басқа карбонатты жыныстар шығатын аймақтарда өсіп-өнетін өсімдіктер.
Базофильді өсімдіктер - базофильные растения. Топырақтары сілтілі болып келетін шөл және шөлейт далада өсетін көптеген өсімдік түрлері.
Бастама клеткалар - инициальные клетки. 1) Бөлінгеннен кейін өзгеріссіз меристемалық болып қалатын өсу нүктелерінің клеткалары. Кейбір өсімдіктердің (мүктер, папортник тәрізділер) өсу нүктесінде жалғыз-ақ клетка көпклеткалы организмнің бастамасы бола алады. Басқа өсімдіктер (тұқымды өсімдіктердің көбі) промеристемасында бірнеше бастама клеткалар болады. Бастама клеткалардың туындылары әралуан тканьдік элементтерге сұрыпталады. 2) Бөлінгенде бірнеше клеткалық топтарды пайда ететін эпидермис клеткасы. Олардан устьицалардың тұйықтаушы және жанама клеткалары сұрыпталады. 3) Бірнеше қайталанып бөлінуден ұрықтық бастамасы болатын ұрықтанған жұмыртқа клеткасы.
Безді клеткалар - железистые клетки. Ішінде әртүрлі - эфир майлары, қымыз қышқылды ізбес кристалдары бар, көлемінен немесе ерекше пішінімен оңай көзге ілінетін паренхима тканінің арнайы клеткалары.
Бейімделу - адаптация. Организмнің құрлысы мен атқаратын қызметінің тіршілік жағдайларына бейімделуі, сыртқы жағдайларының өзгеруіне организмнің бейімделуін қамтамасыз ететін жауаптардың жиынтығы.
Биогенді элементтер - биогенные элементы. Организмдердің тіршілігі үшін қажетті құрам бөлігі болып табылатын химиялық элементтер. Оларға көміртегі, оттегі, азот, сутегі, күкірт, фосфор және т.б. жатады.
Биотроф - биотроф. Тіршілік әрекеттеріне қажетті қоректік заттарды және энергияны басқа организмдерден - хайуанаттардан, өсімдіктерден, бактериялардан, саңырауқұлақтардан, т.б. алатын паразит.
Бөліп шығарушы клеткалар - выделительные клетки. Басқа клеткалардың тіршілік әрекеттеріне байланысатын заттардың жиналуына арналған клеткалар.
Бірінші (алғашқы) қабық - первичная оболочка. Ең алғашқы, шыныдай мөлдір тысқы қабат. Жас клеткаларда протопластан пайда болады. Құрлысы целлюлозалық микроталшықтардан құралған тор сияқты. Пектиндік заттардан және гемицеллюлозалардан тұратын аморфты матрикске малынған күйде болғандықтан клетка қабығының созылуына кедергі жасамайды. Алғашқы қабық меристема және мезофилл клеткаларында көбірек байқалады.
Вакуольдар - вакуоли. Ішінде клетка шырыны жиналған цитоплазмадағы көпіршіктер. Клетка шырының құрамыында еріген органикалық және минералдық заттар болады. Басында көптеген майда вакуольдар бір-бірімен қосылып клетканың бүкіл ішін алып жататын үлкен бір вакуольға айналады. Клеткадағы осмостық құбылыстар осы ерігенг заттардың концентрациясына байланысты.
Галоксерофиттер - галоксерофиты. Тұздылыққа, қуаңшылыққа бірдей төзімді өсімдіктер.
Галомезофиттер - галомезофиты. Ылғалдылығы орташа аймақтарда өсетін, тұздық ортаға төзімді өсімдіктер.
Галофиттер - галофиты. Тұзға төзімді, яғни сорланған, кебірленген топырақтарда, сондай-ақ тұзды суларда өсетін өсімдіктер.
Галофобтар - галофобы. Тұзды ортада өсе алмайтын өсімдіктер.
Гекистотермиялы өсімдіктер - гекистотермные растения. Суыққа төзімді, күн энергиясы өте аз түсетін жағдайларда тіршілік ете алатын өсімдіктер (мысалы, полярлық қуаң дала, альпі белдеуінде өсетін өсімдіктер.
Гелиофиттер - гелиофиты. Күн жарығы мол түсетін жерлерде өсіп, жарықты көбірек ұнататын өсімдіктер.
Гемикриптофиттер - гемикриптофиты. Жертаған өсімдіктер. Жылдың қолайсыз мерзімінде олардың бастама бүршіктері жерде сақталады.
Гемиксерофиттер - гемиксерофиты. Қуаңшылық аймақтар мен ылғалдылығы орташа аралығында өсетін өсімдіктер. Олардың тамырлары өте тереңдеп өседі, транпирация арқылы қарқындылығы жоғары және сусыздануға төзімділігі төмен келеді.
Гетеротрофты мүшелер (органдар) - гетеротрофные органы. Фотосинтезге қабілетсіз өсімдік мүшелері (тамыр, ұрық, жапырақтың түссіз ұлпалары).
Гиалоплазма - гиалоплазма, матрикс. Ішінде ядро, басқа органоидтар және клеткалық алмасудан пайда болған заттар орналасқан өсімдіктер мен жануарлар клеткаларының ішкі негізгі құрамы.Гиалоплазманың құрамына белок тектес заттар, соның ішінде, ферменттер енеді. Гиалоплазма клетканың құрылымдық бөлшектерін біріктіріп, олардың өзара химиялық қатынастарын қамтамасыз етеді.
Гигрофиттер - гигрофиты. Суды көп керек ететін, тек ылғалы мол топырақтарда өсетін өсімдіктер (орман өсімдіктерінің көпшілігі).
Гигрофобты өсімдіктер - гигрофобные растения. Ылғалды көп керек етпейтін, сондықтан ылғалы мол жерден қашық өсетін өсімдіктер.
Гидатодтар - гидатоды. Өсіәмдіктердің су тамшыларын (гутация) бөліп шығаруға бейімделген устьицалары. ылғалы мол жерлерде өсетін өсімдіктерде көп кездеседі.
Гидатофиттер - гидатофиты. Түгел немесе жартылай суға батып өсетін өсімдіктер.
Гидрокриптофиттер - гидрокриптофиты. Бүртіктері суда болатын өсімдіктер.
Гидромезофиттер - гидромезофиты. Гигрофиттер мен мезофиттер аралығында орын алатын өсімдіктер.
Гидроморфизм - гидроморфизм. Гидрофиттердің морфологиялық және анатомиялық ерекшеліктері: ауа сақтағыш клетка аралықтарының мықты дамуы, қалқып өсетін жапырақтарда устьицалардың көптігі, борпылдақ және бағана тәріздес тканьдердің нашар бедерленуі, тамыр жүйелерінің механикалық ткандерінің нашар дамуы, кейде жапырақтардың әртүрлілігі.
Гидроморфоздар - гидроморфозы. Суда тіршілік етуіне байланысты өсімдік пішіндерінің өзгеруі.
Гидрофиттер - гидрофиты. Тіршлігін ұдайы суда өткізетін су өсімдіктері.
Гидрофобты өсімдіктер - гидрофобные растения. Суы мол жерден қашықтап өсетін өсімдіктер.
Гипсоксерофиттер - гипсоксерофиты. Гипсі мол топырақта өсетін өсімдіктер.
Гликогаломезофиттер - гликогаломезофиты. Тқздануға төзімді, өз организіміне тұзды өткізбейтін мезофит өсімдіктер.
Гликогалофиттер - гликогалофиты. Тамырлары тұзды нашар өткізетіндіктен, ұлпаларында тұз жиналмайтын өсімдіктер.
Гликофиттер - гликофиты. Тұзсыз топырақтарда және тұщы су қоймаларында өсетін өсімдіктер. Оларға жер бетінде өсетін өсімдіктердің көптеген түрлері жатады.
Гольджи аппараты - аппарат Гольджи. Клетканың өте майда құрылымдық бөлшегі. Жайпақ ыдыс немесе табақша тәрізді қысыңқы көпіршіктерден құрылған. Жан-жағынан одан да майда көпіршіктер созылып жатады.
Граналар - граны. Хлоропластардың ішкі құрлымының негізгі бөлшектері. Олар реттеліп орналасқан тилакоидтар байламына ұқсас. Хлоропласта 10-15 граналар болуы мүмкін, дегенмен олардың бәрі өзара жұмыр, немесе қысыңқы құбыр сияқты граналық тилакоидтар арқылы біртұтас жүйе боп байланысқан.
Гуттация - гуттация. Өсімдік жапырақтарының устьицаларынан судың тамшы түрінде бөлінуі. Гуттация транспирацияның өте бәсендеуінен өсімдік-тердің жер үстілік органдарының шамадан тыс сулануына байланысты. Гуттация астық тұқымдастар өскіндерінде, қырықбуындыларда өте жиі байқалады.
Диктиосома - диктиосома. Клетка цитоплазмасының майда құрылысты бөлшегі. Жан-жағынан ішінде клеткалар тіршілік әрекетінен пайда болған заттары көпіршіктер қалыптасатын мембраналық табақшалар жиынтығы. Әдетте өсімдіктер клеткасында жиынтығы Гольджи аппараты деп аталатын бірнеше диктиосомдар болады.
Диссимиляция - диссимиляция. Тірі ұлпаларда органикалық заттардың ыдырап, энергияның бөлінуі. Клеткадағы қажетті энергияның барлыңы диссимиляцияға байланысты өндіріледі. Тыныс алу мен ашу процестері диссимиляцияның негізгі түрлері болып есептелінеді.
Диффузия (ірігу, таралу, ағу) - диффузия. Бір заттың молекулаларының (газдың, сұйықтықтың, қатты дененің) басқа заттарға тәкелей жанасқанда немесе саңылаулы кедергі арқылы енуі (жүйедегі заттың концентрациясының өздігінен теңелуі).
Дөңгелек саңылаулар - округлые поры. Бірінші қабықтың қабыршағымен ажыратылған, клетканың қалыңдамаған екінші қабығының цилиндр тәріздес қуыстары. Көбінесе паренхималық клеткаларға тән.
Евгалоксерофиттер - евгалоксерофиты. Тұздануға және қуаңшылыққа бірдей төзімді өсімдіктер.
Жазғы тыңыштық - летний покой. Құрғақ, шөл далада өсетін кейбір өсімдік түрлерінің жаздың құрғақшылық кезеңдеріндегі қолайсыз жағдайларға бейімденуіне байланысты тыңыштық күйге өтуі.
Жапырақ жұмсағы - мякоть листа. Жапырақтың үстінгі және астыңғы қа- баттарының арасындағы (бағана тәріздес және кеуекті) паренхима немесе жапырақтың ассимиляциялаушы (мезофилл) ұлпасы.
Жапырақтың ширатылуы - скручивание листьев. Бактерия, саңырауқұлақ немесе вирустардың әсерінен пайда болатын аурулардың бір белгісі.
Жапырақтың бұйралануы - курчавость листьев. Әртүрлі топтағы саңырауқұлақтардың әсерінен пайда болатын өсімдіктер ауруы. Жапырақ бетінде көптеген дөңестер пайда болып, жапырақ пішіні бұзылады.
Жара меристемасы - раневая меристема. Өсімдіктің жараланған бөліктерінің шеттерінде пайда болатын жаңа ұлпа. Әдетте жара меристемасының қызметін жараланған жерге жанай орналасқан камбий қабаты атқарады.
Жара тозы - раневая пробка. Өсімдіктің кез-келген органындағы ұлпалар жараланғаннан кейін феллоген клеткаларынан пайда болатын, зақымданған ұлпаны сау ұлпадан бөліп тұратын тозды қабат.
Жара ұлпасы - раневая ткань. Жара меритстемасы әрекетіне байланысты зақымданған жерде пайда болатын бұлтық (каллус) түріндегі жаңа ұлпа.
Жартылай өткізгіш қабық - полупронецаемая оболочка. Суды (еріткіш) оңай өткізетін және ондағы еріген заттарды өткізбейтін қабық.
Жартылай өткізгіш мембрана - полупронецаемая мембрана. Өзінен, әдетте тек еріткіш молекулалары ғана өте алатын мембрана.
Жыныс клеткалары - половые клетки. Жыныс органдарында пайда болатын және жыныстық көбеюге қажетті хромосомдар жиынтығы, гаплоидты арнайы клеткалар.
Жіктелу кезеңі - фаза дифференциации. Көлемдерінің ұлғаюы тоқтап, қабықтары суберинмен тығызданып немесе сүректеніп, тиісті қызметін атқаруға дайындалған клетканың өсуінің соңғы кезеңі.
Каротин - каротин. Каротиноидтар тобындағы қанықпаған көмірсутекті қызғылт сары пигмент. Суда ерімей, органикалық еріткіштерде ериді. Барлық өсімдіктердің хлоропластарында және хромопластарында болады.
Каротиноидтар - каротиноиды. Суда ерімейтін сары және қызғылт сары пигменттер тобы. Каротиноидтерге каротин және химиялық тегі жағынан соған жақын ксантофилл, ликопин, фукоскантин және т.б. пигменнттер жатады. Күзде жапырақтардың сароғаюы, сондай-ақ гүл, жеміс түстері де осы пигменттердің болуына байланысты.
Каспари белдеушесі - поясок каспари. Бірқатар өсімдіктердің тамыр клеткалық қабықтарының дөңгелек белдеуше сияқты болып тозандануы немесе сүректенуі.
Кернелу - тугор. Клетка қабығы мен ішкі бөлімдерінің өзара қысымдары нәтижесінде өсімдік клетекалары, тканьдері және органдарының кернелген күйі.Осмостық қысымға байланысты клеткаға су енгенде байқалатын қысым, көленмі ұлғайған сайын протопластқа түсетін клетка қабығының қарсы қысымына теңеседі. Кернеулік қысым мен осмостық қысымның өзара қатынасы судың сіңу процесіне үлкен әсер тигізеді.
Клетка - клетка. Жануарлар мен өсімдіктерді тіршіліксіз жүйелерден ерекшелейтін, морфологиялық және физиологиялық сұрыпталған құрылыстық бірлік. Қарапайым тірі жүйе бола тұрып, клетка өзін-өзі жаңартуға, өндіруге және реттеуге қабілетті. Клетканың негізгі құрамы - ішінде органоидтар мен басқа кіріспелер орналасқан цитоплазма, ядро, вакуоль. Олардың барлығы клетка қабығымсен қоршалған.
Клетка-аралық заттар - межклеточное вещество. Клетка қабықтарының арасында болатын және клеткаларды өзара қиындастыратын полисахаридке ұқсас зат.
Клетка сөлі - клеточный сок. Клетка вакуоліндегі тіршілік әрекетінің нәтижесінен шыққан сұйықтық зат. Химиялық жағынан минералдық тұздардың, амин қышқылдарының, көмірсулардың, органикалық қышқылдардың, суда еритін бояулы заттардың нағыз ерітіндісі болып табылады.
Клеткалардың өткізгніштігі - проницаемость клеток. Клетклардың қоршаған ортадағы еріген заттардың енуін және ұсталып қалуын қадағалау қасиетімен клетка тіршілік процесінде пайда болған заттарды шығару қабілеті. Клетканың өткізгіштігі клетка мембраналарының құрлысына, күйіне және қызмет әрекетіне байланысты.
Клетканың бөлінуі - клеточное деление. Физиологиялық дербес бір ядролы клетканың тепе-тең екіге бөлінуі. Олардың әрқайсысы плазмадағы негізгі заттардың, ең алдымен, ядроның жартысы енеді.
Криптофиттер -криптофиты. Су астында және топырақта қыстап шығып, қайта көктейтін бүршіктері бар тамырсабақты, түйнекті және пиязшықты көпжылдық өсімдіктер.
Кристалар - кристы. Митохондрияның ішіне қарай созылып шығатын түтікше немесе табақша қабаттары.
Ксантофилл - ксантофилл. Каротиноидтарға жататын, спиртте ерімейтін, каротинмен бірге хлоропластарда және хромопластарда болатын сары пигмент.
Ксероморфизм - ксероморфизм. Өсімдіктерде қуағшылыққа бейімделу нәтижесінде пайда болатын морфологиялық, анотомиялық белгілердің жиынтығы.
Ксерофиттер - ксерофиты. Құрғақшылық аймақтарға бейімделген өсімдіктер. П.А. Генкельдің ұйғаруы бойынша ксерофиттер мынандай топтар,ға бөлінеді: суккуленттер, эвксерофиттер, гемиксерофиттер.
Қоректендіруші ұлпалар - питающие ткани.Өсімдіктердің қалыптағыдай сумен, минералдық заттармен және ауа арқылы қоректенуін жүзеге асыратын ұлпалар. Қоректендіруші ұлпалар сіңіргіш, өткізгіш және ассимиляциялық қор жинағыш болып бөлінеді.
Қоректік заттар - питательные вещества. Құрамында өсімдіктерге қажетті қоректік элементтері бар қосындылары.
Қоршау - обкладка. Жапырақтың өткізгіш шоқтарына айнала орналасқан клетка қабаттары. Паренхималық немесе склеренхималық бөлектерден құралуы мүмкін.
Қоршаушы клеткалар - обкладочные клетки. Кейбір қарапайым анатомиялық топтарды қоршайтын ерекше клеткалар.
Қышқылшыл өсімдіктер - кальцефобы. Қышқыл және бейтарап топырақтарда жақсы өсіп, әкке бай топырақтарда нашар өсетін өсімдіктер.
Лейкопластар -лейкопласты. Пластидтердің бояусыз, дөңгелек немесе ұршық тәріздес бір түрі. Әдетте эпидермис клеткаларына немесе түссіз тканьдер тән.
Мезоксенрофиттер - мезоксерофиты.Мезофиттермен салыстырғанда құрғақтау, ксерофиттерге қарағанда ылғалдау аймақтарда өсетін өсімдіктер.
Мезофилл - мезофилл. Жапырақтың хлорофилі клеткаларының негізгі тобы.
Мембрана - мембрана. 1) Іріктеп өткізетін қасиеті бар цитоплазманың аралық құрлымы (плазмалемма, тонопласт, клетка, органеллалардың мембраналары). 2) Кейбір балдырлардың қабығы.
Метаболизм - метаболизм. Оргнизіміндегі зат алмасу процесі. Ассимиляция және диссимиляция процестерінің жиынтығы.
Митохондриялар - митохондрии. Клеткада энергияны пайда болуын, жиналуын және таралуын қамтамасыз ететін органоидтар.
Негізгі ткань - основная ткань. Жамылғы және өткізгіш тканьдердің аралығында клеткалар жиынтығы.
Нуклеодесмалар - нуклеодесмы. Әр түрлі өсімдіктерде ядро қабықшасына көлденең бағытта еніп ядроның ішкі жағын цитоплазмамен байланыстыратын талшықтар.
Нуклеоплазма - нуклеоплазма. 1) Ядроның хроматинмен ядрошықтан басқа негізгі сұйық бөлігі. 2) Бактериялар және көк-жасыл балдырлар клеткасының ядро баламасы орналасқан бөлігі.
Осмос - осмос. Су молекулаларының жартылай өткізгіш мембраналар арқылы қанықпаған ерітіндіден қаныққан ерітіндіге қарай араласуы.
Осмофильді өсімдіктер - осмофильные растения. Осмостық қысымы жоғары ортада өсетін өсімдіктер (тұзды көлдердегі балдырлар).
Өсімдіктердің қоректенуі - питание растений. Өсімдіктердің қоректік заттарды сіңіріп игеруі. Қоректену ерекшеліктеріне байланысты өсімдіктер гетеротрофты және автотрофты болып екіге бөлнеді.
Өткізгіш клеткалар - передаточные клетки. Клетканың сыртқы мембрана- сының (плазмасының) жалпы ауданың көбейтетін, қабығында көптеген өскіншектері бар паренхималық клеткалар. Еріген заттарды көрші клеткалрға тасымалдауға қажет.
Паренхималық клеткалар - паренхимные клетки.Пішіні жағынан шарға, тектешеге немесе қысқа қалпақшаға ұқсас, яғни ұзындығы енінен әлдеөайда көбірек целлюлозалы қабықтары жұқа клеткалар.
Пасока - пасока. Тірі өсімдіктердегі тамыр қысымының күшіне байланысты кесілген сабақтан немесе тамырдан бөлініп шығатын сұйықтық.
Периблема - периблема. Тамырдың өсу ұшындағы алғашқы түзуші тканьнің паренхималық клеткалрының бір немесе бірнеше қабаттары.
Пигменттеу - пигментация. Өсімдік организмдерінің әр түрлі органдарында және ұлпаларында бояғыш заттардың жиналуы.
Плазмалемма - плазмалемма. Цитоплазма мен клетка қабьығының арасында мембраналық қабат. Оған клетка мембраналарының барлық қасиеті тән, соның ішінде жартылай өткізгіштігі де тән.
Плазмолиз - плазмолиз. Қанттар, тұздар, глицерин және басқа осмостық қасиетті мол заттардың гипертониялық ерітінділерінің әсерінен тірі өсімдік протопластарының көлемі кішірейіп, соңынан қабықтан ажырауы.
Пластидтер - пластиды. Автотрофты өсімдіктер клеткаларының цитоплаз- масындағы органикалық затардың құралуын жүзеге асыратын боялған немесе түссіз органоид.
Полиплоидты ядро - полиплоидное ядро. Негізгі хромосомдары екіден көп кез-келген ядро.
Полисома - полисома. Информациялық РНҚ молекуласымен біріккен және белок синтезін жүзеге асыратын рибосомалар жиынтығы.
Прокариоттар - прокариоты. Морфологиялық қалыптасқан ядросы және басқа да әдетті клеткалық органеллалары жоқ организмдер. Оларға бактериялар, көк-жасыл балдырлар жатады.
Пропластидтер - пропластиды. Өсімдіктер меристемасында және промеристемасында хлоропластардың дамуының алғашқы сатысы.
Протодерма - протодерма. Ұрық денесін толық жауып тұратын, толық қалыптасып жетілмеген клеткалар қабаты. Ұрық өнгенен бастап протодерма өсімдіктің жамылғы тканьдеріне айналады.
Рибосомалар - рибосомы. Әдетте эндоплазмалық тордың мембранарында орналасқан, диаметрі 15-30 нм, сфенра немесе саңырауқұлақ тәріздес субмикроскоптық бөлшектер.
Ризодерма- ризодерма. Тамыр жүйесінің ең сыртқы ұлпасы. Ол қоршаған ортадан заттарды сіңіріп, олардың ішкі ұлпаларға іріктеніп енуін қамтамасыз етеді. Бұл ұлпаны құрайтын клеткалар трихобластар және ахриблостар болып екі топқа бөлінеді.
Ризосфера -ризосфера. Тамырға тікелей жанасқан топырақ бөлігі.
Саңылаулар - споры. Өсімдік клеткаларының қабығындағы қалыңдамаған микроскоптық орындар.
Саңылаулы өзектер - поровые каналы. Клетканың екінші қабығының бірінші қабыққа дейінгі жіңішке өзек тәріздес қалыңдамаған жерлері. Бір клетканың өзектері басқаларына қарсы орналасқан.
Симпласт - симпласт. 1) Қабық саңылаулары арқылы цитоплазма плазмадесмаларымен өзара функциональді және физиологиялық байланысқан, өсімдік организімінің барлық тірі клеткаларының протопластар жиынтығы. 2) Клеткалық құрылысы қалыптаспаған организімдердің көп ядролы протопласты.
Симпластикалық тасымалдау - симпластный транспорт. Заттардың клетка сыртына шықпай, клетка цитоплазмасынан плазмодесмалар арқылы клеткадан клеткаға ауысу.
Склерофиттер - склерофиты. Өркендері қатты, құрғақшылыққа төзімді өсімдіктер.
Созылу кезеңі - фаза растяжения. Клектканың қарқынды өсу кезеңі. Вакуольге судың көп енуіне байланысты клетка көлемі ұлғайып, клетка қабығы созылады.
9. ӘДЕБИЕТ ЖӘНЕ ҚОРЛАР
9.1 Негізгі әдебиеттер
9.1.1. Валиханова Г.Ж. <<Өсімдіктер физиологиясының үлкен практикумына арналған әдістемелік нұсқау>> Алматы,1995, 33 б.
9.1.2. Вознесенский В.Л., Зеленский О.В., Семихатова О.А. Методы исследования фотосинтеза и дыхания растений.М. 1965, 306 б.
9.1.3. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. " Большой практикум по физиологии растений".М. Высшая школа, 1975, 392 б.
9.1.4. Гофман Ю.Я. , Микроэлектрофорез белков в акриламиндном геле. Биохимия, 1965,1160-1163.
9.2 Қосымша әдебиеттер
9.2.1 Мухамеджанов Э.К. Методика диск-электрофореза водорастворимых белков, Известия АН КазССР,серия биологическая №2,1967, 70-72 бет
9.2.2 Петров К.П. Практикум по биохимии пищевого растительного сырья-М. " Пищевая промышленность" 1965
9.2.3 Сказкин Ф.Д., Ловчинская Е.И. " Практикум по физиологии растений"-М, " Современная наука" 1953, 218 б
9.2.4 Чернавина И.А.,Потапов Н.Г., Косулина Л.Г., Кренделева Т.Е.Большой практикум по физиологии растений (под редакцией Рубина Б.А.).М.Высшая школа, 1978, 408 б.
Пәндер
- Іс жүргізу
- Автоматтандыру, Техника
- Алғашқы әскери дайындық
- Астрономия
- Ауыл шаруашылығы
- Банк ісі
- Бизнесті бағалау
- Биология
- Бухгалтерлік іс
- Валеология
- Ветеринария
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Дін
- Ет, сүт, шарап өнімдері
- Жалпы тарих
- Жер кадастрі, Жылжымайтын мүлік
- Журналистика
- Информатика
- Кеден ісі
- Маркетинг
- Математика, Геометрия
- Медицина
- Мемлекеттік басқару
- Менеджмент
- Мұнай, Газ
- Мұрағат ісі
- Мәдениеттану
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности)
- Педагогика
- Полиграфия
- Психология
- Салық
- Саясаттану
- Сақтандыру
- Сертификаттау, стандарттау
- Социология, Демография
- Спорт
- Статистика
- Тілтану, Филология
- Тарихи тұлғалар
- Тау-кен ісі
- Транспорт
- Туризм
- Физика
- Философия
- Халықаралық қатынастар
- Химия
- Экология, Қоршаған ортаны қорғау
- Экономика
- Экономикалық география
- Электротехника
- Қазақстан тарихы
- Қаржы
- Құрылыс
- Құқық, Криминалистика
- Әдебиет
- Өнер, музыка
- Өнеркәсіп, Өндіріс
Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.
Ақпарат
Қосымша
Email: info@stud.kz