Файл қосу
Қоректі орталар
Дәріс № 1 Кіріспе. Жасушалық биотехнологияның негізгі бағыттары
* Биотехнологияның дамуы.
* Жасушалық биотехнологияның негізгі бағыттары
Биотехнологияның пайда болуы және дамуы микроорганизмдерді қолдануға тікелей байланысты. Осыдан 6000 жыл бұрын көне Египет елдерінде және XIX ғасырдың ортасында Еуропа елдерінде микроорганизмдерді нан, қышқылды-сүт тағамдарын дайындау, спиртгі және т.б. алу үшін кеңінен қолдана бастады. Ерте заманнан дәстүрлі технологияда қолданылып келе жатқан микроорганизмдерге қарағанда, жоғарғы сатыдағы организмдердің жасушалық өсінділері биотехнологияның жаңа объектісі болып саналады. Олардың тіршілігіне негізделе отыра, биологиялық белсенді заттар, вакциналар, моноклональды антиденелер өндіріледі.
Жасушалық биотехнология -биотехнологияның аса маңызды бағыттарының бірі болып саналады. Ол негізінде жаңа объект -оқшауланған жасушаларды қолдануға бағытталған, яғни эукариоттық организмдердің жасушаларын немесе ұлпаларын, сонымен қатар өсімдік жасушаларының ғажайып қасиеті - тотипотенттікке негізделген. Бұл саладағы жетістіктер глобальды теориялық және тәжірибелік тапсырмаларды шешуге зор мүмкіндік туғызды. Осыған байланысты фундаментальды ғылымдар саласында мынандай күрделі дағдарыстар шешімін тапты: ұлпалардағы жасушалардың өзара байланысы, жасушаның дифференциялануы, морфогенез, жасушалардың тотипотенттігінің жүзеге асуы, рак жасушаларының пайда болуы және т.б. Тәжірибелік мақсаттарға қол жеткізу барысында: селекцияға, жануарлар жасушасын колдана отырып, дәрі-дәрмектік биопрепараттар және өсімдіктерден көп мөлшерде бағалы биологиялық метаболиттерді алуға, атап айтқанда, арзан дәрі-дәрмектер, сонымен қатар вируссыз өсімдіктерді өсіру, олардың клондық көбеюіне және т.б. аса көңіл аударылып отыр.
Жасушаларды организмнен тыс өсіруге болатыны туралы идеялар XIX ғасырдың аяғында байқала бастады. XIX ғасырдың аяғы мен XX ғасырдың басында неміс ғалымы X. Фехтинг (1892), С. Рехингер (1893), Дж. Харбеландт (1902) өсімдіктер ұлпасы мен органдарының сахароза сіңдірілген сорғыш қағазда өсуін шапшаңдатуға алғашқы рет қадам жасады. Ешқандай нәтиже шықпаса да, бұл жүргізген жұмыстардың зор маңызы болды. Бұл зерттеулерде байқалған идеялар сол замандағы ғылымның дамуын анықтады және ондаған жылдардан соң олардың дұрыстығы дәлелденді. Ал жануарлар жасушасын жасанды қоректі ортада өсіру алғашқы per XX гасырдың басында жүргізілді. Зерттеушілер көп уақытқа дейін, өсімдік жасушаларын жасанды ортада өсіру барысында тиісті нәтиже ала алмады. Бұл салада алғашқы жетістіктер өткен ғасырдың 30-шы жылдарында алынып, сол ғасырдың 60-70-ші жылдарында өсімдіктер және жануарлар жасушаларын өсіру бағыты қарқындап дамыды.
XX ғасырдың 70-ші жылдарында жасушалық өсіндіні өсіруде маңызды жетістіктерге қол жеткізілді. Бұл кезде өсімдіктер протопластарын бөліп алу әдістері ойлап шығарылды, сонымен қатар сомалық жасушаларды будандастыру ашылды. Жоғарғы өсімдіктердің оқшауланған протопластары мен жакуарлардың жасушалық өсінділері, будандастыру және оларға генетикалық бөгде зат (жасушалық органеллалар, бактериялар) енгізу арқылы жасушалық конструкторлық объектіге айналды. Жасушалық конструкторлық әдістерді қолдану өсіндідегі продуценттік жасушалардың қасиеттерін жақсартуды көздейді, ал өсімдіктер жасушаларын қолданған кезде, жаңа қасиеті бар (өсімдік жасушасының тотипотенттігіне негізделген) өсімдіктердің түрін алуға мүмкіндік туғызады.
Қазіргі күні биотехнологияның үздіктері болып, АҚШ және Япония елдері саналады, бұл елдерде ауылшаруашылық, фармацевтік, тағам және өндірістік биотехнология салалары өте жақсы дамыған. Ал ферменттік препараттарды, аминқышқылдарын, белокты, дәрі-дәрмектерді өндіру бойынша, көп жетістіктермен көш ілгері дамыған болып Еуропа елдер (Германия, Франция, Ұлыбритания) және Ресей саналады. Бұл елдерде биотехнология жаңа техника және жоғарғы технологияның қолдануымен, тағы да биотехнологияның салаларындағы қарқынды түрде орындалған фундаментальды және тәжірибелік зерттеулерімен сипатталады.
Қазақстанда биотехнология саласының дамуы жасушалық өсінділермен тікелей байланысты. Қазақстан ғалымдары А.Қ. Бұлашев, Қ.Қ. Мұқанов және т.б гибридомды технологиясының негізінде көптеген антигендерге моноклональды антиденелерді алуды жүзеге асырды. Бүгінгі күні А.Қ. Бұлашев басқарған авторлар тобы өндіретін бруцеллез, туберкулез, лептоспироз және т.б антигендерге арналған моноклональды антиденелер тәжірибеде кеңінен қолданылады.
XX ғасырдың соңы, XXI ғасырдың басы, жасушалық биотехнологияның жаңа жетістіктерімен адам баласын таң қалдырады. Ерекше орын алатын сала ол - гибридомды технология. Моноклональды антиденелерді қолдана отырып, тек инфекциялық және рак ауруларын анықтап ғана қоймай, сонымен қатар лейкоз, гепатит В және стрептококкалық ауруларын емдеуге болады. Медициналық тәжірибеде фетальды жасушаларды, орталық жүйке жүйесінің және қалқанша без ақауларын емдеу үшін кеңінен қолданады. Жасушалық биотехнологияның табыстары биология, биохимия, медицина, ветеринария және т.б. салаларында кеңінен қолданылады.
Биотехнологияның болашағын және оның адам өміріндегі маңызын, жапон профессоры К. Сакагучи былай сипаттайды: <<... не қаласаңыз соны микроорганизмдерден таба аласыз, олар ешқашан сізді алдамайды... Жануарлар мен өсімдіктер жаоушаларының күрделі, әлі толық зерттелмеген тұқым қуалау аппаратына әрекет жасау, биотехнологияның қолдану салаларын кеңейтеді және оның принципиальді басқа бағыттарын тудырады>>.
2 Жасушалық биотехнологияның негізгі бағыттары
Жасушалық биотехнолгияның негізі - жеке бөлініп алынған жасуша және ұлпа өсінділері. Клеткаларды толық меңгеру үшін оларды өсімдіктер, жануарлар мен адам организмдерінен бөліп алу және оларға организмнен тыс өсу үшін қолайлы жағдай жасау қажет. Жеке бөлініп алынған жасушалар мен ұлпаларды жасанды қоректі орталарда асептік жағдайда өсіру (in vitro) биотехнологияда кеңінен қолданылады.
Жалпы биотехнологиялық процестер жасанды ортада өсірілген микроорганизмдердің, өсімдіктердің, жануарлар мен адамдардың жасушалары және ұлпаларының биосинтетикалық потенпиалына негізделеді. Қазіргі уақытта бүкіл әлемде биотехнологияның дамуына көп көңіл аударылады, себебі басқа технологиялармен салыстырғанда биотехнологияның көп артықшылығы бар: биотехнологиялық процестер энергияны аз мөлшерде қажет етеді; ешқандай қалдықсыз; экологиялық таза технология. Бүгінгі таңдағы биологиялық технология, тек алдыңғы қатарлы жоғары технологиялық құрал-жабдықтарды қолдану арқылы жүзеге асады, сонымен қатар оның тағы бір ерекшелігі - зерттеулер климаттық жағдайларға тәуелсіз және шағын орын ала отырып, жыл бойы жүргізіледі. Осындай ерекшеліктермен жасуша мен ұлпа өсінділерінің технологиясы сипатталады.
Жасуша және ұлпа өсінділері адам тіршілігіне қажетті үш бағытта қолданылады.
Бірінші багыт:
:: жеке бөлініп алынған жасушалардан медицина және парфюмерияға, косметикаға қажетті екінші метаболиттік- өнімдер (алколоидтар, стериодтар, гликозидтер, гормондар, эфирлік майлар т.б.) алу;
:: жасушалық технологияның негізінді қажетті медициналық препараттар алынады (диосгенин, аймолин);
:: жасуша өсінділерін қолдана отырып, тағам өнеркәсібіне қажетті биологиялық қоспалар мен препараттарды алу.
Екінші багыт:
:: жасуша өсінділерін өсімдіктерді вирустық және басқа да агенттерден сауықтыру үшін қолдану;
:: өсімдіктердің микрокөбеюі арқылы бір жылда жалғыз меристемадан жүз мың өсімдіктерді алуға болады;
:: жасуша өсінділерін қолдана отырып, адам мен жанурлардың инфекциялық ауруларына қарсы вакциналарды алу;
:: жасуша өсінділерін қолдана отырып, инфекциялы ауруларды анықтау үшін қолданылатын диагностикумдарды алу.
Үшінші багыт:
:: жасуша өсінділерін қолдана отырып, селекциялық жұмыстардың нәтижесінде жылдам өсетін, қолайсыз факторларға төзімді өсімдіктерді алу;
:: оқшауланған протопластарды қоса (құйлып қосылу) отыра, өсімдіктердің жаңа түрін алу;
:: гендік инженерияға негізделіп, протопластарға бөгде генді енгізе отыра, тұқымқуалаушылық қасиеті бар өсімдіктер алуға болады;
:: жасуша өсінділерін қолдана отырып, вирустық аурулардың патогенезін толық зерттеуге болады;
:: жасушаларды организмнен тыс (in vitro) пробиркада үрықтандыру.
Дәріс № 2 Жасушалық биотехнологияның негізі - жасуша өсіндісі
* Жасуша өсіндісі ұғымы.
* Жасушалық өсінділердің классификациясы.
* Жасушалық линиялардың кейбір танымалы түрлері
Жасушалық технологияның негізі - жануарлар мен өсімдіктерден алынатын жасуша өсінділері.
Жасуша өсіндісі дегеніміз - ол биосистема жасушаларының организмнен тыс (in vitro) жасанды ортада өсіп көбеюі.
Жасуша өсіндісін өсіру әдістемесі жиырмасыншы ғасырдың 40-шы жылдарынан кейін өркендеп дами бастады. Ол антибиотиктардың ашылуымен тікелей байланысты, себебі антибиотиктарды қолдана отыра, жасуша өсінділерінің бактериялармен ластануына кедергі жасауға болады. Сонымен қатар жасушалық биотехнологияның дамуына өз үлесін тигізген. Коккингтың (1960) жеке жасушаларды бөліп алу және өсіру әдістемелерін табуы, ал Зиммерманның (1984) оқшауланған протопластарды электрдің көмегімен қосу туралы ғылыми ашуы болды.
Жасуша өсінділерінің ашылуы көптеген глобальді, теориялық және тәжірибелік проблемаларды шешуге мүмкіндік туғызды. Фундаментальдік ғылымдар саласында өте күрделі жайт - ұлпалардағы жасушалардың өзара қатынасын, жасушалық дифференциялауды, морфогенезді анықтауға, жасушалардың тотипотентігінің жүзеге асуына және ракты жасушалардың пайда болу механизмін зерттеуге мүмкіндік жасады.
Тәжірибелік салада аса көңіл аударылатын бағыттар: селекция; көп мөлшерде биологиялық заттарды алу; вируссыз өсімдіктерді өсіру; өсімдіктердің клондық көбеюі; өсімдік, жануарлар мен адамдардың жеке жасушаларын өсіру.
Жасуша өсінділерінің көздері ол биосистемалар: өсімдік, жануарлар және адам жасушалары мен ұлпалары (сурет 2).
Жасуша өсіндісін жануар мен адамның кез келген органы мен ұлпасынан алуға болады. Бірақ эмбрионнан алынған жасуша өсіндісі өзінің шапшаң өсу қабілетімен ерекшеленеді. Көбінесе осы мақсатпен жануарлар эмбрионының бүйрегі, терісі, тимусы және т.б. органдары мен ұлпалары алынады.
1966 жылы ұлпалық өсінділерге бірыңғайланған терминология қабылданды. Оның негізгі тәртібі төменде көрсетіледі. Ұлпа өсіндісі - бұл жүйеде көп жасушалы организмнен бөлініп алынған жасушалар, ұлпалар және органдар 24 сағат тіршілігін сақтап, in vitro жағдайда көбейе алады. Биологиялық объектінің түріне байланысты келесі түрлерге жіктелінеді: 1) жасушалар өсіндісі - бұл термин, in vitro жасушалардың өсуін көрсетеді, бірақ өсіндіде жасушалар ұлпа түзбейді; j 2) ұлпа немесе органдар өсіндісі - бұл термин ұлпаның, орган ұрықтары мен мүшелерінің кұрылыстық дифференциясын сақтай отыра, in vitro өсуін қолдауды білдіреді.
Биологиялық тәжірибеде қолданылатын жасушалық өсінділердің классификациясы:
Каллустық жасуша - жасанды ортада өсірілетін өсімдік жасушасының басты түрі. Каллустық жасуша-бөліну арқылы каллустық ұлпаны немесе каллусты түзеді. Осы процесс жоғарғы өсімдіктерге тән жасушалық дифференциялануды көрсетеді. Каллусты алу үшін өсімдіктің әртүрлі мүшелерінің кесіндісін (эксплант) жасанды ортада in vitro өсіреді.
Алгашқы жасуша өсіндісі - ол тікелей организмнен алынып, in vitro өсірілген жасушалар (3-5 тәулікте пайда болады). Мұндай өсіндіні адам мен жануардың кез келген органынан немесе ұлпасынан алуға болады.
Жоғарыда көрсетілгендей, алғашқы жасуша өсіндісін эмбрион органдары мен ұлпаларынан алған жөн, себебі эмбрион жасушалары жасанды ортада жылдам көбейеді. Осы мақсатпен көбінесе тауық эмбрионы, сүткоректілердің эмбрионынан және төлдерден алынатын бүйректер, тері, тимус қолданылады.
Субкультуралар - ол алғашқы жасуша өсіндісінен бірінші пассаж (қайталап егу) жасалғаннан кейін алынады (2-3 тәулікте пайда болады), көптеген жасушалық линиялардан тұрады.
Субкультураны барлық алғашқы жасуша өсінділерінен алуға болады. Өзінің биологиялық қасиеті бойынша алғашқы жасуша өсіндісінен қалыспайды, сонымен қатар олар экономиялық жағынан тиімді. Субкультураны 2-5 пассаж жасау арқылы алады, кейбір өте сирек жағдайларда 8-10 пассажға дейін жасалады.
Қайталап өсірілген жасуша өсінділері - ол, организмнен тыс шексіз өсуге қабілетті жасуша өсінділері. Тұрақты өсінді деп - ол үш күн сайын, кемінде 70 ретке дейін пассаж жасалынған, қайталап өсірілген жасушаны айтады. Қайталап өсірілген жасуша өсіндісінде жасушаның пішіндері бірдей, құрамы гетероплоидты (алғашқы жасуша өсіндісінде ол диплоидты), олардың кейбіреулерінің онкогендік қасиеттері бар. Осыған байланысты мұндай жасуша өсінділері адамдардың вирустық ауруларына қарсы вакциналарды алу үшін қолданылмайды.
Қайталап өсірілген жасуша өсінділерінің артықшылығы: оларды дайындау оңай және арзан, олардың көптеген вирустарға, сезімтал болуында (вирустарды анықтау үшін қолданылады). Олардың кемшілігі қатерлі ісікті тудыру қасиеті болып саналады.
Диплоидты жасуша өсінділері дегеніміз морфологиялық бірқалыпты жасушалар популяциялары. Бұл жасуша өсіндісінің тіршілігі шектеулі, пассаж кезінде өзінің кариотипін сақтап қалады, контаминанттардан таза. Диплоидты жасуша өсінділерін алғашқы жасуша өсіндісінен алады, олардың кайталап өсірілген жасушалардан айырмашылығы диплоидты кұрамын сақтап қалуы және тіршілігінің шекті болуында. Пассаж саны 40-60 болады, содан кейін бөлінуші жасушалар саны күрт азайып, олар өледі.
Диплоидты жасуша өсінділерінің артықшылығы: 10-12 күн ауыстырылмаған қоректі ортада тіршілігін сақтай алады, жұмасына бір рет қоректі ортасын ауыстырған кезде тіршілігін 4 жұма сақтайды.
Өсіру тәсіліне байланысты жасуша өсінділері екі түрге бөлінеді: дара қабатты жасуша өсінділері; суспензиялық жасуша өсінділері.
Дара қабатты жасуша өсіндісі деп қоректі ортаның беткі қабатында пайда болған жасуша өсіндісін айтамыз.
Организмнің көптеген жасушалары суспензиялық ортада өсуге қалыптаспаған, сондықтан да оларды өсіру үшін қатты бетті орта қажет. Ең алғаш рет, жасушаларды өсіру әдісі пайда болған кезде, оларды плазманың бетінде өсірді, бүгінгі күні жасушаларды өсіру үшін шыны, палстиктен жасалған ыдыстар қолданылады. Жасушалар өсу үшін өздеріне қоректік заттарды қажет етеді.
Суспензиялық жасуша өсіндісі дегеніміз жасушалардың бос кеңістікте өсіп-көбеюі. Мұндaй жасуша өсіндісін алу үшін суспензияны үнемі араластырып отыру қажет. Қазіргі күні суспензиялық жасушаларды алу толық дамыған, соның нәтижесінде белгілі бір қасиеттері негізделінген жасушаларды алуға болады.
Сүтқоректілердің көптеген жасушалары белгілі бөліну дәрежесінен кейін тіршілігін жояды. Мысалы: адамның тері жасушалары тіршілігін жойғанға дейін 50-100 рет бөлінеді. Мынандай тұжырым, жасуша өсіндісіндегі өсу шектілігі, жануардың тіршілігінің шектілігімен тығыз байланысты. Себебі жылдам қартаятын және өлетін ауру организмнен алынған жасушалардың тіршілігі қысқа. Кейбір уақытта өсіндіде, кенеттен мутантты жасушалар пайда болады, олардың тіршілігі шексіз. Мұндай жасушалар үздіксіз көбейіп, жасушалық линия түзеді, 2-ші кестеде тәжірибеде жиі қолданылатын жасушалық линиялар түрлері сипатталған. Бұл жасушалар қатты бетте өседі, дара қабат түзгеннен
Кесте 2- Жасушалық линиялардың кейбір танымалы түрлері
Жасушалық линия
Жасуша түрі, алынған организм
3Т3
Фибробласт (тышқан)
ВНК 21
Фибробласт( сириялық атшалман)
Hela
Эпителия жасушасы (адам)
PTK 1
Эпителия жасушасы (кенгуралық егеу құйрық)
L6
Миобласт ( егеу құйрық)
PC 12
Хромаффиндік жасуша (егеу құйрық)
SP 2
Плазматикалыұ жасуша (тышқан)
кейін өз тіршіліктерін жояды. Жоғарыда сипатталып өткен жасушалық линиялардың маңызы, олар бір түрлі жасушалардың алыну көзі болып саналады. Сонымен қатар мұндай жасушалар - 70° С, активті түрде өте ұзақ сақталады. Жасушалық линиялардың бір тектес болуын клондау әдісі арқылы нығайтуға болады. Клон - дегеніміз бір жасушадан туындаған жасушалар популяциясы.
Дәріс № 3 Жануарлар жасушаларын өсіру үшін қолданылатын қоректі орталармен ерітінділер
* Жануарлар жасушаларын өсіру үшін қолданылатын ерітінділердің түрлері.
* Жануарлар жасушаларын өсіру үшін қолданылатын қоректі орталардын құрамы.
1.Жиырмасыншы ғасырдың 70-ші жылдары жасуша өсіндісін алу аса маңызды ғылыми жаңалықтардың бірі болды. Ол кезде көптеген ғалымдар, жасушалардың организмнен тыс өсуін ғылым мен сиқырдың әрекеттесуі деп қарастырды. Жасушалық биотехнологияның өркеңдеп дамуы, көптеген сұрақтардың жауабын тауып түсіндіре білді.
Плазманың орнына пластмасалы табақшалар мен құрамында белгілі бір мөлшерде тұз қоспалары, аминқышқылдар және витаминдер бар қоректі орталар қолданыла бастады. Бірақ ол кезде қоректі орталардың құрамында, толық тазармаған: жылқы сарысуы, тауық эмбриондарының өңделмеген экстрактары, сондай ақ бұзау эмбрионының сарысуы секілді биологиялық заттар болды, Көптеген қарапайым жасуша өсінділері үшін мұндай қоректі орталар бүгінгі күнге дейін қолданылып келеді.
Жасушалар дайындалған қоректі орталар енгізгеннен кейін, оларға температуралық қолайлы жағдай жасау қажет. Жасушалар пластмасты ыдыстың қабырғасына жабысып, бөлінуді бастайды. Қолайлы ортада жасушалар өскенде: адаптациялық, логарифмдік өсу, стационарлық және ескіру (жасушаларың өлуі) түрінде бірнеше фазадан өтеді. Көбею арқылы жасушалар пластмасаның бетіне жайылады, оны толық жапқан кезде бір-бірімен байланысып бөлінуін тоқтатады (контакты ингибиция). Ыдыстың бетінде бір жасушаның өсіндісі көбінесе 3-5 тәулік арасында түзіледі, түзілу жылдамдығы келесі жағдайларға байланысты болады: ұлпаның түріне; оны алған сүтқоректінің, өсімдіктің жасына; қоректі ортаның сапасына; егу кездегі жасушалар мөлшеріне (концентрациясына) және т.б. факторларға байланысты.
Жасуша өсіндісін дайындау кезінде қолданылатын ерітінділер үш топқа бөлінеді:
* жасуша өсіндісін дайындауға қажетті ерітінділер;
* жасушалар тіршілігін in vitro жағдайында сақтайтын ерітінділер;
* жасушаларды егуді қамтамасыз ететін ерітінділер.
Жасуша өсінділерін дайындаған кезде Хенкс және Эрла ерітінділері кеңінен қолданылады. Олар бидистелденген суда әртүрлі тұздар мен глюкоза қосьш дайындалады.
Тұзды ерітінділер қоректі орталарды дайындау үшін қолданылады. Себебі олар рН-тың тұрақтылығын, жасушаларға қажетті осмостық қысымды қамтамасыз етеді және бейорганикалық заттардың концентрациясын тұрақтайды. Сонымен қатар оларды жасушаларды дайындау кезінде шаюға, жасушаларды сұйылтуға қолданады (кесте 3).
Жасушаларды өсіру кезінде, жасуша аралық заттарды ыдырату үшін ферментті ерітінділер қолданылады. Жасуша өсіндісін өсіру үшін қолданылатын қоректі орталар табиғи және жасанды (синтетикалық жоне жартылай синтетикалық) болып екіге бөлінеді.
Кесте 3- Хенке және Эрла ерітінділерінің құрамы
Ерітінділер
Су (1 л)
Тұздар
Басқа қосылыстар
Хенке
Бидистилденген
NaCl, KCl; MgSo4, CaCl2, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3
Глюкоза, фенолрот
Эрла
Би дистилденген
NaCl, KCl; MgSo4, CaCl2, Na2HPO4, NaHCO3
глюкоза
2.Табиғи қоректі орталар трды ерітінділерден, адам немесе жануар сары суларынан, ұлпалық экстрактан, амниондық сұйықтықтан тұрады.
Жасушалық биотехнология саласында жасанды қоректі орталар кеңінен қолданылады.
Жартылай жасанды қоректі орталарға әртүрлі белокты препараттардың ферментті підролизаттары жатады: лактальбуминнің гидролизаты, бұлшық ет гидролизаты, гемгидролизаты және т.б.
Кеңінен қолданылатын синтетикалық қоректі орталарға 199 ортасы және Игла ортасы жатады. Олардың құрамына 60 артық компоненттер кіреді: 20 аминқышқылдары, 17 витаминдер, нуклеин қышқылының компоненттері, липидтер көздері, 8 минералды тұздар және басқа да заттар болады (кесте 4). Синтетикалық қоректі орталарды, тұзды ерітінділерде жоғарыдағы химиялық заттарды белгілі мөлшерде еріту жолымен дайындайды.
Барлық қоректі орталардың құрамына, оның рН анықтау және бақылау үшін 0,002% фенол қызыл индикаторының ерітіндісін қосады. рН төмендегенде ортаның түсі сарғыштанады, бұл жасушалар метаболизмінің өнімдерімен ортаның қышқылдануының көрсеткіші. Мұндай жағдайда қоректі ортаны ауыстырады. Индикаторлардың көмегімен қоректі орталарға баға беруге болады.
Тұзды ерітінділердің және қоректі орталардың рН реттеу үшін 7,5% бикарбонат натрий және 3% сірке қышқылы ірітінділері қолданылады.
Жануарлар және адам жасушаларын өсіруге қолданылатъш барлық қоректі орталарды екі топқа бөледі: өсу қоректі орталары, жасушалардың тіршілігін және көбеюін қамтамасыз етеді, құрамында 2-10% қан сары суы болады, бастапқы күндері жасушаларды өсіру үшін қолданылады; тіршілігін сақтап тұрушы қоректі орталар, жасушалардың тек тіршілігін сақтайды, көбеюін қамтамасыз етпейді, құрамында сары суы болмайды, жасуша өнімдерін лабораторияда ұзақ сақтау үшін қолданылады.
Дәріс №4 Өсімдік жасушасы және ұлпасының өсінділері
1.Каллустық жасушаның өсу фазалары.
2. Каллустық жасушалар мен ұлпалардын қасиеттері.
1.Каллустық жасуша дегеніміз - ол қолайлы ортада өсірілген өсімдік жасушасы. Каллустық жасушаның өсуі жалпы эволюция заңдылығына сәйкес. Сондықтан каллустық жасушаның өсуі S-тәрізді қиғаштан тұрады (Сакс бойынша өсу қиғашы) және бес фазамен сипатталынады.
Бірінші фаза - латентті фаза немесе лаг-фаза, мұнда жасушалар бөлінуге дайындықта болады.
Екінші фаза - экспоненциальді фаза (логарифмдік фаза) жасушалардың бөлінуі шапшаң түрде жүріп, жас жасушалардың саны артады.
Үшінші фаза - сызықтық фаза, каллустық массанның ұлғаюмен сипатталады.
Төртінші фаза - жасушалардың бәсең өсуі, мұнда жасушалардың бөлінуі күрт төмендейді.
Бесінші фаза - стационарлық фаза мұнда бөлінген жасушалар мен өлі жасушалар саны теңесіп, каллус массасы тұрақты болады. Бұл фазадан кейін каллус өз тіршілігін жояды.
Жасанды қоректік ортада өсірілген каллустық жасушалар мен ұлпаларда, табиғатына тән қасиеттер сақталынады. Мысалы: суыққа төзімділігі, абиотикалық факторларға (температура, тұздануға, фотокезеңдік реакцияларға) төзімділігі, әсіресе басты маңыздылығы - ол екінші метаболиттерді синтездеу қасиеті. Сонымен қатар жалпы каллустық жасушаларға тән қасиеттер мен бірге тек оларға тән ерекшеліктер пайда болады. Ең басты популяциялық ерекшеліктер -физиологиялық асинхрондық және генетикалық гетерогендік.
Физиологиялық асинхрондық - жыныссыздық популяцияның ең жиі кездесетін ерекшелігі. Ол мынаған негізделеді, уақыттың белгілі бір мезгілінде жасушалар әртүрлі өсу фазасында болуы. Мысалы: бір жасушалар бөлінеді, екіншілері өседі, кейбіреулері қартаяды. Сондықтан мұндай ұлпаның физиологиялық жағдайы, жасушалардың көп мөлшері қандай кезеңде болса, сонымен сипатталатын болады.
Физиологиялық асинхрондықтықты келесі себептерге байланысты пайда болады: өсімдіктің генотипіне, түріне, сортына, эксспланттың ерекшелігіне; өсіру жағдайларына (стресстар); эндогенді және экзогенді гормондар мөлшеріне; жасушалар мен клондардың генетикалық гетерогендігіне, сонымен қатар in vitro жағдайында митозда болатын аномалияларға; физикалық факторлардың (температура, сәуле, аэрациялау) әсеріне тәуелді.
Генетикалық гетерогендік - ол сомалық жасушалар популяциясының қасиеттері (геномның тұрақсыздығы, генетикалық гетерогенділігі). Жасуша культураларында әрқашан да полиплоидия, ансуплодия, хромосомалық аберрация, гендік мутациялар пайда болады. Бірақ генетикалық гетерогендікті кемшілік деп қарастыруға болмайды, ол популяцияның арнайы жағдайы деп есептелінеді, сонымен қатар адаптацияланудың негізі болып қарастырылады.
Генетикалық гетерогендіктің пайда болу себептері; алынған материалдың генетикалық гетерогендігі; өсімдіктен алғаш рет бөліп алу кезінде коррелятивті байланыстардың бүзылуы; ортаның компоненттерінің әсері (экзогенді гормондар мутагенді әсер етуі мүмкін); ұзақ уақыт субкультурлау, осы кезде генетикалық өзгеріске ұшыраған каллустық жасушалар жинақталады.
Биология ғылымындағы аса күрделі проблемалардың бірі - ол көп клеткалы организмдердің дамуы. Осы процесті зерттеу үшін, қарапайым модель ретінде жасуша және ұлпа өсінділері қарастырылады. Алғашқы дедифференциалаудан кейін каллустық жасушаның дамуы әртүрлі бағытта жүруі мүмкін. Біріншіден бұл процесс екінші дифференциялау деп қарастырылады. Мұнда каллуста жеке дифференцияланған жасушалар пайда болады. Олардың белгілі бір құрылысы және қызметі болады. Мысалы: эпибласталардың пайда болуы (екінші метаболиттер жинақталынады). Бұл каллустық жасушаның ең қарапайым дифференциялануының күрделі түрі. Ол гистологиялық дифференциялану, бұл каллуста белгілі органдардың (млечники,талшықтар, ксилема элементтері т.б.) түзілуімен сипатталынады. Екінші дифференциялаудың ең күрделі түрі- органогенез, яғни органдардың түзілуі, сомалық эмбриогенезде-сомалық жасушалардан эмбриоидтардың, ұрық тәрізді биполярлы структуралардың пайда болуы.
Дифференциялаудың барлық түрі, тотипотенттік қасиет болғанда ғана жүреді.
Екінші диференциациядан өтетін каллустық жасушалар бірыңғай белгілермен ерекшеленеді. Ондай жасушалар - <<инициалды-жасушалар>>- басқа каллустық жасушалардан оқшау, жасушалық қабырғасы жуандаған жасушалар. Сонымен қатар, оларға мына белгілер тән: ядроның ұлғаюы, заттық қордың мол болуы, вакуольдердің өлшемінің азаюы және гексоздар ыдырауының шапшаңдауы.
Дедифференциядан өткеннен кейін жасушалар бірнеше жолдар арқылы дамиды.
Бірінші жол - өсімдіктің екінші регенерациясы, яғни жасуша, ұлпа, органдар деңгейінде дифференциацияның өтуі.
Екінші жол - жасушалардың екінші дифференциялық және регенерациялық қабілетінің жоғалуы, мұнда тұрақты дедиференциация байқалады, яғни жасушалар гормонсыз ортада өсу қабілетіне ие болады (рак жасушаларына айналуы).
Үшінші жол - физиологиялық цикл (қартаюы, өлуі). Бұл кезде жасушалар екіншіі дифференциалаудан өтеді, бірақ морфогенезге әкеліп соқпайды, тек кәрі каллустық жасушалардың пайда болуын тудырады. Каллустық ұлпада морфогенез процесі деп - құрылыстық структуралардың, ретсіз массадан пайда болуын айтады. Морфогенездің негізгі екі түрі бар (сурет 3).
Сомалық эмбрионогенездің органогенезден айырмашылығы меристеманың қандайда болсын бір бөлігінен (тамыр, бүршік) ұрық пайда болып, одан тұтас өсімдік дамиды.
Жеке сомалық жасушаның тұгас өсімдік құрай алатын қабілеті тотипотенттік қасиеті болып саналады.
Сомалық эмбриогенез кезінде <<инициаль-жасуша>> зиготаның түзілуінің негізі болады. <<Инициаль-жасуша>> біраз уақыт лаг-фазада болады, себебі осы уақытга жылдам бөліну, қайта кұру процестеріне дайындық өтеді.
Сонымен қатар, жасушалар бытырау (дробления) арқылы бөлініп, көп мөлшерде изодиаметрлі жасушалар түзеді. Бұл жасушалар I органогенез процесінде меристема ошағы, ал сомалық эмбрионогенезде - глобулярлы проэмбриоидтар деп аталынады. Глобулярлы проэмбриоидта биполярлы эмбриоидты структуралар дамиды.
Каллусты жасушадан сомалық эмбриоидтардың түзілу кезеңдерінің бірнеше түрлері болады. Солардың кейбір түрлері төменде көрсетіледі: глобулярлы; жүректі; торпеда тәрізді; сомалық ұрық.
Дәріс № 5 Жеке жасушаларды өсіру технологиясы
* Жеке жасушаларды өсіру.
* Жеке жасушаларды өсіру үшін колданатын коректі орталардын құрамы.
1.Жасушалық технология саласында аса маңызды бағыт -жеке жасушаларды aлy технологиясы. Жеке келткаларды өсімдіктер, жануарлар мен адам организмдерінен алуға болады. Олардың басты маңызы, жасушалық селекцияда гибридті жасушаларды таңдау және клондау болып табылады. Сонымен қатар оларды генетикалық және физиологиялық зерттеулер үшін қолданады. Мысалы: генетикалық біркелкілікті зертеу үшін, гетерогенді экспланты қолданғаннан, бір жасушаның клонын қолданған оңай.
Бірақ жеке келткаларды өсіру өте қиын, себебі жалғыз жасуша каллустық жасуша өсетін жағдайларда көбеймейді. Сондықтан жалғыз жасушаларды өсіру үшін арнайы әдістер қарастырылады. Олардың барлығы <<кондицтондық факторларға>> (бөлінуші жасушалардың метаболиттері) негізделінген. Егер ортаға бір жасушаны немесе олардың аз мөлшерін енгізетін болса, онда жасушалар ортада қажетті затгардың жетіспеушілігінен бөлінбейді. Сондықган да жасушалардың бөлінуіне қажет факторлардың концентрациясын жоғарлатуы қажет. Ол мына әдістер арқылы жүзеге асады:
* <<Няня>> ұлпалық әдіс-жалғыз жасушалар жанындағы <<Няня>> ұлпасынан бөлінген кондициондық факторды қолданады;
* ортаны байыту - белсенді бөлініп жатқан жасушалардың ортасын қосу арқылы;
* <<азықтандыру қабаты әдісі>> - жалғыз жасуша тектес өсімдік жасушалары белсенді бөлініп жатқан суспензиялық ортаны қолдану;
* жеке жасушаларды бай қоректік орта бар микротамшыда өсіру.
Тәжірибеде жеке жасушаларды өсірудің маңызы оларды қазіргі күнгі талапқа сай әртүрлі технологияда қолдану. Медицина саласында гибридті жасушаларды алу болып саналады. Әсіресе гибридомды технологияны атап өтуімізге болады, себебі қазіргі күні біздің елімізде де гибридті жасушаларды қолдану арқылы көптеген гылыми жаңалықтар бар. Жеке жасушаларды клондау арқылы, ерекше биопрепараттарды алуға болады. Ол препараттар зілді ісікті (рак), кеңінен таралған инфекциялық ауруларға диагноз қою үшін кеңінен қолданылады.
Биология саласында жеке жасушаларды өсіру өсімдіктердің гибридті жасушаларын алуға, оларды зертгеуге толық мүмкіндік береді.
Оқшауланған жасушалар мен ұлпалар көп компонентті қоректік орталарда өсіріледі. Олардың кұрамы алуан түрлі болуы мүмкін, бірақ міндетті түрде өсімдіктерге қажетті макро-микроэлементтер, көмірсулар, витаминдер, фитогормондар және олардың жасанды аналогтары болуы қажет. Көмірсулар (көбінесе сахароза немесе глюкоза) қандайда бір қоректі ортаның құрамында 2-3% мөлшердей болады. Олар қоректі компоненттер ретінде өте қажет, себебі көптеген каллустық ұлпалар хлорофилдың болмауынан автотрофты қоректенуге қабілетті емес. Сондықтан оларды күн сәулесі аздап түсетін немесе қараңғы жағдайда өсіреді. Тек мандрагора, амарант және кейбір өсімдіктердің каллустық ұлпасы жарық жерде өседі. Қоректік орталардың құрамында міндетті түрде ауксиндар мен цитокининдер болуы керек, себебі ауксиндер эксплант жасушаларының дедифференциялануын тудырса, ал цитокининдер жасушаның бөлінуін туындырады.
Қоректі орталардың құрамында нитраттардың, амоний, калий, фосфат иондарының көп мөлшерде болуы жасушалардың жылдам өсуін қамтамасыз етеді. Ал қоректі заттардың жетіспеушілігі жасушалардыңщ өсуін және екінші метаболиттердің синтезін бәсеңдетеді.
Дара қабатты каллустық ұлпаны өсіру үшін қолданылатын қоректік орталарды дайындау кезінде теңіз балдырларынан алынатын тазартылған агар-агар - полисахаридты қолданады. Кеңінен қолданылатын қоректі орталар 5 - кестеде келтіріледі.
Мурасиг және Скуг ортасы - ең жан-жақты орта. Ол каллустың түзілуі үшін, каллустың ретсіз өсуін қамтамасыз ету, сондай-ақ көптеген өсімдіктердің морфогенезін индукциялау үшін қажет.
Гамборг және Эвелег ортасы бұршақты, дәнді өсімдіктердің жасушалары мен ұлпасын өсіруге өте қолайлы. Уайт ортасы тамырдың дамуын және регенерациядан кейін, сабақгың қалыпты дамуы қамтамасыз етеді, ал Нич және Нич ортасы тозаңдық өсінділерінде андрогенезді индукциялайды.
Бүгінгі таңда кейбір өнеркәсіптер, дайын ұнтақ түрінде Мурасиг-
Скуга, Уайт, Хеллер орталарын шығарады. Бұл орталардың құрамында барлық қажетті заттар болады, тек өсуді реттеуші факторлар: сахароза және агар болмайды. Егер, зерттеу барысында қоректі ортадағы компоненттердің мөлшерін өзгерткен кезде, сахароза мен агардың қажеттілігі шамалы болады.
Дәріс № 6 Жасушалар мен ұлпаларды өсіруге қойылатын талаптар.
* Жасушалар мен ұлпаларды өсіруге қойылатын талаптар
* Өсінділерді ұзақ өсіру
1.Оқшауланған (изолированные) жасуша мен ұлпаларды стерильді жағдайда, жасанды қоректі орталарда өсіру (in vitro) - оқшауланған ұлпаларды өсіру әдісі деп аталады.
Барлық биосистеманың өсінділеріне бірыңғай талаптар қойылады.
Асептика. Жасуша мен ұлпаларды бөліп алу және өсіру арнайы боксте, бөлмелерде стерильді құрал - жабдықгарды қолдану арқылы өтуі қажет. Жасушалар және ұлпалармен in vitro жүргізілет жұмыстардың барлығы асептикалық ламинар - бокста немесе асептикалы бөлмелерде атқарылады. Асептикалық бөлмелері ультракүлгін шамдардың көмегімен залалсыздандырылып, онда стерильді киімдермен жұмыс жасайды. Жұмыс үстелдері және құралдар жұмыс жасар алдында қосымша спиртпен сүртіледі.
Фольгаға оралған таза ыдыстармен құралдарды, қағаздарды, мақтаны кептіру шкафтарында құрғақ ыстықтың әсерімен 160°С температурасында 1,5-2 сағат залалсыздандырады. Қоректі орталар мен ерітінділер автоклавттың (120°С, 15-20 мин) көмегімен залалсыздандырылуы қажет. Егер автоклавтау кезінде қоректік орталардың құрамында жылдам ыдырайтын заттар болатын болса, оларды бактериалық сүзгі арқылы залалсыдандырады.
Қоректі орталар. Оқшауланған жасушалар мен ұлпаларды көп компонентті қоректі орталарда өсіреді. Олар құрамы бойынша бір-бірінен айырмашылығы бар болады, бірақ барлығының құрамында биосистемаларға қажет макро-және микроэлементтер, көмір сулар, витаминдер болуы қажет. Сонымен қатар адам мен жануарлардың оқшауланған жасушалары мен ұлпаларына сарысу, ал өсімдіктер культураларына фитогормондар қажет.
Қоректі ортаның құрамында нитратар, калийдің аммониясы, фосфат иондары неғұрлым көп болса, соғұрлым жасушалар саны жылдам көбейеді. Ортада қоректі заттардың тапшы болуы, жасушалардың өсуін және екінші метаболизмді тежейді.
Физмкалық факторлар. Жасушалар мен ұлпалардың in vitro өсуінде физикалық факторлардың (сәуле, температура, аэрация, ылғалдылық) әсері зор.
Сәуле. Көптеген каллусты жасушалар жарық аз түсетін немесе қараңғы жағдайларда өседі, себебі олардың фотосинтездік қабілеті болмайды. Оған қарамастан сәуле морфогенезді және екінші синтезді шапшаңдатушы фактор ретінде қарастырылуы мүмкін. Сондықтан сәуле көзі ретінде люминесцентті шамдарды қолданады.
Температура, Жануарлар жасушалаларының температуралық көрсеткіштегі олардың алу көзіне байланысты.
Каллустық өсінділер үшін 26°С оптимальды температура болып саналады. Кейбір өсімдіктердің каллустары 32°С температурада жақсы өседі. Бірақ морфогенездің индукциясы төменгі температураларда өтеді (18-20°С). In vitro-жағдайында температураның жасушалардың метаболизміне қалай әсер ететіндігі аз зерттелген.
Аэрациялау. Суспензиялық өсінділерді өсіру кезінде аэрацияның маңызы зор. Әсіресе үлкен көлемді ферментерларда жасушаларды өсіру кезінде, оларды ауамен қамтамасыз ету өте қажет.
Жасушаларды кішкене көлемді ыдыстарда (колбада) өсірген кезде, оларды үнемі шайқау арқылы аэрациялайды.
Ылғалдылық. Өсінділер өсетін жерлерде ылғалдылық 60-70 болуы керек. Сонымен қатар жасушалар мен ұлпаларды өсіру көптеген факторларға тікелей бағынышты, олардың әсерлері толық анықталмаған. Сондықтан жасушалардың жаңа түрін өсіру ортасына енгізген кезде, олардың өсуіне және физиологиялық қасиеттеріне физикалық факторлардың қалай әсер ететіндігін зерттеу қажет.
2.Жасушалық технология саласында жасушаларды in vitro өсіру ғана емес, сонымен қатар оқшауланған жасушаларды ұзақ сақтауға да көп көңіл бөлінеді.
Лабораторияларда жасуша өсінділерінің тіршілігін, үнемі пассаж (қайталап егу) жасау арқылы сақтап отырады. Пассаж жасау үшін, дара қабаты толық дамыған, 2-3 тәулік жасы бар жасуша өсіндісін таңдап алады. Қоректі ортаны бөліп алғаннан кейін жасушалық дара қабатты жылы күйіндегі 0,02 % версен ерітіндісімен толық жабады. Версеннің әсерінен жасушалар домалақтанып, шыны бетінен босайды. Босаған жасушаларды жайып бөліп алып, қалған жасушаларға өсу қоректі ортасын қосып (80-200 мың жасушаға 1 мл), термостатта 37°С температурасында 3-4 тәулік дара қабат түзілгенше өсіреді. Жасушаларды өсіру үшін қолданылатын қоректі орталардың түрі жасушалардың шығу тегіне байланысты болады.
Жасуша өсінділерін үнемі қайталап егу арқылы олардың тіршілігі сақталынады.
Жасуша өсінділерін өсіру кезінде арнайы жағдай жасап қана қоймай, сонымен қатар ыдыстарды да дайындай білу қажет. Қолданылатын ыдыстың сапасы жасушаларды жасанды орталарда өсіру кезінде өте маңызды. Сондықтан қолданылатын ыдыстар стерильді, майсыздандырылған, токсигендік қасиетінің болмауы. Жасуша өсінділерін өсіргенде, пассаж жасалғанда аса көңіл аударатын мәселе - ол қолданылатын судың сапасы.
Лабораторияларда дистилденген бидистилденген, немесе
деионизацияланған сулар қолданылады.
Жасушалық биотехнологияда қолданылатын жасуша өсінділерін жиі консервілеу арқылы сақтауға болады. Себебі жасуша өсінділерін пассаж жасау арқылы сақтаған кезде, олардың бактериялармен ластануы және генетикалық өзгерістер тууы мүмкін.
Дәріс №7 Сомалық будандастырудың генетикалық негіздері
1. Сомалық будандастырудың генетикалық негіздері
1.Сомалық будандастыру дегеніміз - хромосомды, ядро және органеллалар гендерін генетикалық рекомбинацияға шалдықтыру жүйесі. Мысалы: оқшауланған протопластардың құйылып қосылу арқылы жүзеге асыруға болады. Осының нәтижесінде жасушалардың гибридті линиялары және өсімдіктердің сомалық гибридтері пайда болады.
Алғашқы рет жасанды түрде протопластардың жабысуын 1970 жылы Коккинг өзінің әріптестерімен дәлелдеген болатын.
Сомалық будандастыру нәтижесінде жаңа генотиптер, өсімдіктердің жаңа түрлері туды. <<Сомалық будандастыру>> термині алғашқы рет 1974 жылы Дж. Мельхерсом енгізді. Оның мағынасы- сомалық жасушалар протопластарының қосылуы.
Жоғарғы организмдер жасушаларын, бір-біріне Сендай вирусыньн көмегімен қосады. Себебі оның әсері цитоплазмалық мембрана белогінің гидролизмен тікелей байланысты.
Өсімдіктер, бактериялар және саңырауқұлақтар жасушаларын сомалық гибридтеу алдында, бірінші жасуша қабырғасын ыдыратып протопласқа айналдырады. Сондықтан жасушалық қабырғаны ферменттердің әсерімен ыдыратады.
Тәжірибеде жасуша қабырғасына бірнеше әдістер арқылы әсер етеді:
* бактериялық жасушалар үшін лизоцим қолданылады;
* саңырауқұлақтар жасушалары үшін, ұлудың зимолиазасы қолданады;
* өсімдіктер жасушалары үшін, саңырауқұлақтар ферменттері (целлюлаза, гемицеллюлаза және пектиназа) қолданылады.
Сомалық гибридтеудің өзіндік ерекшелігі бар. Біріншіден - бұлі процесс, қандай да болсын будандастыру түріне және гендерді әртүрлі таксономиялық топтарға тасымалдауға тәуелді. Екіншіден протопластардың қосылуы кезінде, жасушалардың ата-аналық цитоплазма гендері араласады (жынысты будандастыру кезінде бұл болмайды).
Протопластардың өздігінен қосылуы өте сирек байқалатын жайт. Бұл процестің механизмі толық зерттелмеген. Протопластардың беткі қабаты теріс зарядталынған, олардың бір-бірімен жабысуын тудыру үшін, беткі қабаттық зарядты алу қажет. Бүгінгі күні тиімді фюзогені (электр зарядын алу) ретінде полиэтиленгликоль (ПЭГ) және рН 9-Ш кальций иондарының жоғары концентрациялы ерітінділері қолданылады. Егер гипотеза ретінде протопластардың жабысуын түсіндіретін болсақ, ол былай болады: ПЭГ-ні қолданған кезде, осы заттың жоғары концентрациясы (20-30 %) протопластар арасындағы бос суды сіңіріп, олардың жабысуын тудырады.
Сонымен қатар физикалық фактордың да көмегімен протопластардың жабысуын тудыруға болады. Электр тоғының әсерінен диэлектрофорез пайда болады. Бұл кезде протопластар полярлы беттерімен бір-біріне қосылады. Осы кезде тоқ импульсінің әсерінен
саңылаулар пайда болып, протопластар араласады.
Алынған гибрдтерді скринингтен (алынған клондарды тотальді түрде тексеру) өткізеді: фенотиптік ерекшеліктерін ескеру; гибридтер қана тірі қалатын селективті жағдайлар жасау.
Сомалық будандастыру келесі мүмкіндіктерді туғызады:
* филогенді бөгде топтарды будандастыруға болады. Мысалы, сомалық будандастырудың нәтижесінде жемісті, тұрақты фенотиптік қасиеті бар, түр аралық темекінің, картоптың, капустаның турнепспен қосылу гибридтері алынды;
* асимметриялық гибридтерді алу-ол гибридтің бір ата-анасының толық гендер жиынтығына, ал екіншісінің жартылай гендер жиынтығына ие болуы.
* бірнеше ата-аналық гендердің қосылуы арқылы гибридтерді алу.
* әр түрлі қасиеттері бар жасушалардың қосылуы.
Сомалық гибридтердің генотипі генетикалық өзгерістерге әкеліп соғатын, көптеген жағдайлардың нәтижесі болып саналады.
Екі протопласт қосылғаннан кейін, бір-біріне тәуелсіз ядролардың, хлоропластардың, митохондрялардың қосылуы және генетикалық информацияның алмасуы жүреді. Кейбір уақытта ядролардың, органеллалардың қосылуы болмау да мүмкін. Бір-біріне жабысқан митоз түріндегі протопластарды өсірген кезде, ядроның және басқа органоидтардың сегрегациясы (шығаруы) байқалады, сонымен қатар хромосомдардың жартылай элиминациясы, селективті (таңдаулы) түрде бір ата-ананың органоидтары көбейеді. Сомалық будандастыру кезінде жоғарыда көрсетілген процестермен қатар мынандай өзгерістер жүреді: генетикалық тұрақсыздық, мутациялық процестер және жасушаларға тән генетикалық өзгерістер.
Ю.Ю.Глеб жүргізген эксперименттердің нәтижесін қорытындылай отыра мынандай тұжырым жасалауға болады: - <<Протопластардың құйылып қосылуы арқылы өсімдіктерді габридтеген кезде, екі ата-ананың ядролық генетикалық детерминаттары, сондай-ақ тек бір жақтың белгілері тұқым қуалайды(сурет 10).
Сомалық будандастыру цитоплазмалық гетерозиготаларды алу әдісі болып саналады.
Сомалық гибридтерде пластоманың белгілерінің толық косегрегациясы болады, пластоманың генетикалық рекомбинациясы өте сирек болатын жағдай, ал керісінше митохондрияларда рекомбинатты ДНҚ түрлері жоғарғы жылдамдықпен пайда болады. Митохондрион сомалық гибридтерде, пластомалардан тәуелсіз сегрегацияға ұшырайды.
Аналық протопластардың ішінен бірең-сараң гетерокариондарды және гибридтерді алу өте қиынға соғады. Сондықтан гибридтерді алғаш сұрыптау жұмысы, <<жеңіл модель>>, өсімдік - регенеранттарын қолданып, мутацияның комплементарлық принциптеріне негізделе отыра өткізілді.
Генетикалық комплементация - гибридтегі гендердің байланысуы арқасында, ақаулы гендердің (дефектные гены) қызметі қалпына келеді (сурет 11).
Физиологиялық комплементация - гибридті жасушалардың өсіндіде көбеюі мен өсуі (морфогенез), себебі бұл жағдайда аналық жасушалар өсіп дамымайды.
Э. Кокинг физиологиялық комплементацияны былай дәлелдеді:
бірінші өсіндіде аналық жасушаларды өсіре отыра, бір аналық жасушалардың мұндай жағдайда өсе алатындығын, ал екінші аналық жасушалардың өсе алмайтындығы эерттелді. Содан кейін жасушалар суспензиясын біртіндеп қоректі орталарға енгізеді, бұл кезде бір аналықтың жасушалары өліп, тек гибридті жасушалар көбейеді.
Физиологиялық комплементацияны өткізу үшін алдын ала улардың әсерімен протопластарды инактивтейді. Жасушалардың қасиетін басқа улармен инактивтелген жасушалармен қосу арқылы қалпына келтіруге болады, яғни биохимиялық комплементацияны жүргізу болып қарастырылады.
Сомалық жасушаларды будандастыру, сұрыптау процесінің жаңа технологиясы болып саналады. Бұл жынысты жолмен будандастырылмайтын өсімдік түрлерін алуға мүмкіндік туғызады.
Егер жынысты гибридтеуді жүргізуге болатын сомалық жасушалардың артықшылығы - екі аналық жасушаларының ядродан тыс гендеріне ие болуы болып саналады.
Сомалық жасушалардың тәжірибеде кеңінен қолданылуы түраралық, бір тұқымдастар ішінде гибридтерді алу болып саналады.
Аса маңызды жұмыстар Nicotiana, Solatium, Datura түраралық габридтерді алу болды. Сомалық жасушаларды гибридтеу арқылы картоптың бағалы түрлері алынды. Мысалы: картоптың мәдени және жабайы түрлерін сомалық гибридтеу арқылы шаруашылыққа қолайлы түрі алынып, сұрыптандыру жұмыстары жүргізілді. Бірақ сұрыптануды ұзақ уақыт жүргізу салдарынан, жабайы белгілері басым картоп түрі пайда болды.
Сомалық будандастыру әдісінің кемшілігі- жағымсыз белгілерден айырылу және стерильді өсімдіктерді алу өте қиынға соғады.
Д. Эванс өзінің эксперименттерінде, жеке гендердің комбинациясын алу үшін, темекінің сомалық гибридін көпір ретінде қолданды. Алынған гибрид, темекінің үш түріне тән информацияны қабылдап, мәдени сортпен будандастырғанда ауруларға төзімді болып табылады (сурет 12).
Сұрыптау үшін асимметриялық гибридтердің де маңызы зор. Асимметриялық габридтер - бір толық геномнан және басқа аналықтың бірнеше хромосомынан тұрады. Мұндай гибридтерді алу үшін аналық жасушалардың қосылуынан кейін, бағытты түрде бір аналықтың хромосомаларын элиминациялайды. Асимметриялық гибридтерді радиактивті сәулемен әсер ете отыра алады. Сәуле әсерінің ұзақтылығына және мөлшеріне байланысты ядролардың толық инактивтелуі мүмкін. Мұндай протопластардың, қалыптағы протопластармен қосылуы цибрид тудырады. Цибрид- цитоплазмалық гибрид, яғни бір аналықтың ядросының және екі аналықтың да цитоплазмалық гендеріне ие болады.
Дәріс № 8 Бөлініп алынған протопластардың қолданылуы
Өсімдіктер инженериясы неғұрлым жас саланың бірі болып саналады. Жоғарғы өсімдіктерге, жаңа генетикалық әдістемелерді қолдану, көптеген техникалық қиындықтарды туғызды. Сонымен қатар өсімдік культураларындағы геномның құрылысының бұзылуына (плоидтың бұзылуы, хромосоманың қайта құрылуы) байланысты туындайтын, қосымша қиындықтарды шешу шараларында күделендіреді. Бағалы ауылшаруашылық өсімдіктер культураларын алу кезінде қарастырылатын жүйе: <<протопласт - суспензиялық кулыура - каллус - тұтас өсімдік>>, көптеген жетістіктерге жетуге орасан зор үлесін қосты. Қазіргі уақытта да өсімдіктердің плазмидалық ДНҚ вектор ретінде қолданып келеді. Протопласттарға бөгде ДНҚ-ын енгізуге қажетті кұрал - векторды жасау, көп дағдарыстар туғызады. Осы проблеманы шешу мақсатында бірнеше жолдар ұсынылады: 1) табиғи ортада өсімдіктерді зақымдайтын бактериялық плазмидалар қолданылады, бұл кезде плазмиданың бөлігі өсімдік-қожайынның ядролық геномына кіріп, сол геномның құрамында қызмет атқарады; 2) өсімдікгердің хлоропласттары мен митохондрияларының ДНҚ үзінділерімен <<тігілген>> бактериялық плазмидаларды қолдана отырып, прокариотгық жасушада репликацияланатын, ал эукариоттарда экспрессияланатын тасымалдаушы векторларды алады; 3) құрамында ДНҚ бар өсімдіктер вирустарын қолдану, бұл жүйеде ДНҚ өсімдік-қожайын геномынан автономды (жеке) түрде жұмыс атқарады.
Өсімдіктер протопластына енгізілетін генетикалық бөгде затты нуклеаза әсерінен сақтайтын жаңа әдістер анықталып, осы мақсатпен липосомаларды қолдану ұсынылды. Лшосомалардың көмегімен жасушаларға немесе эукариот протоплстына темекі мозайкасы вирусының үлкен РНҚ (2∙106) енгізілді, одан да үлкен Agrobactenum tumifaciens OB 40 және Ті - плазмидасы енгізілді. Липосомалар нуклеин қыпщылдарын толық қорғайды, осы ерекшелік өсімдік протоплстарымен әртүрлі жұмыс істеу үшін өте маңызды. Мысалы, жүзеге асқан гендік инженерия жобасы болып, регенерацияланған темекі өсімдігінде фазеолиннің түзілуі қарастырылады. Осы плзмиданың көмегімен темекі өсімдігіне неомицинға төзімді ген енгізілді.
Жоғарғы сатыдағы өсімдіктер генетикасының басты даму бағыттары:
:: трансплантты геннің көмегімен, өсімдіктерге қосымша бағалы заттарды түзу қасиетін беру;
:: рибулезодифосфаткарбоксилазалар, хлорофилдің а және b байланыстыру , белоктарының гендері: клондау нәтижесінде, өсімдіктердің фотосинтездік төзімділігін арттыру;
:: өсімдіктерге диазотрофты қасиет беру;
:: қоршаған ортаның қолайсыз факторларына (құрғақшылыққа, тұздылыққа, суыққа, гербицидтерге және т.б.)
Өсімдіктер әрқашан тағамдардың, эфир майларының, бояулардың, дәрілердің табиғи көзі болып саналады. Өсімдіктер жасушаларының әр түрлі қосылыстарды түзуі, олардан бөлініп алынған жасуша және ұлпа өсінділерінде де сондай қасиет болуы керек деген тұжырымды дамытты. Көптеген өсімдіктер бойынша, бұл тұжырым дұрыс болып шықты. Кейбір жағдайларда өсімдіктер екінші синтездік қасиетті байқатпады, әлде қажетті заттарды өте аз мөлшерде синтездеді. Екінші метаболиттерді алу үшін ұзақ зерттеулер жасалды. Бұл эксперимент мынандай бағыттарда жүргізілді: қоректі орталарды таңдау; арнайы жағдайлар жасау; жаңа штаммдарды зерттеу; генетикалық гетерогендіктің көмегімен каллустық жасушаларды алу; мутагенді факторлардың көмегімен жаңа түрлерді алу.
Қазіргі күні екінші метаболиттерді алу ең перспективті бағыт болып отыр. Екінші метаболиттер синтезі суспензиялық жасуша өсіндісінде, жағдайларды реттелген кезде өтеді. Сондықтан оның өтуі климатқа және насекомдардың закымдауына тәуелді емес. Үлкен плантацияларда емес кішкентай көлемді жерде өсіріледі. Өсімдік жасушасының өсіндісі, екінші метаболиттердің барлық қосылыстары синтездейді. Әсіресе атап өтетін жайт, мұндай жасуша өсіндісінде синтезделген заттардың көлемі, тұтас өсімдікте синтезделген көлемнен бірнеше рет артық болады. Сонымен қатар өсімдікте синтезделмеген заттар, жасуша өсіндісінде синтезделуі мүмкін немесе синтезделмейтін қосылыстар мөлшері көбейеді.
Екінші метаболиттер синтезінің қарқыны кетка өсіндісіндегі морфогенез кезеңдерімен тікелей байланысты. Мысалы: Papaver somniferum культурасында алкалоидтардың максимальді синтезі арнайы жасушалардың дифференциациясынан кейін басталады.
Өсірілген популяцияның басты ерекшелігі - екінші метаболиттердің синтезінің және өндірілетін өнім мөлшерінің тұрақтылығы. Өсіріліп отырылған жасуша өсінділерінде екінші метаболиттердің синтезі-жасушалық органеллалармен тікелей байланысты. Негіздеп келгенде пластидтер мен эндоплазмалық ретикулумдардың қатысуымен сипатталады. Метаболиттерді тасымалдамайтын жасушаларда, екінші синтез өнімдері вакуольдарда және бос кеңістікте жинақталады (кесте 6).
Қазіргі күні протопластардың құйылып қосылу әдісі кеңінен қолданылады. Бұл, шығу тегі әр түрлі жасушаларға гендік ақпаратты (информацияны) енгізудің жан-жақты әдісі больш саналады. Себебі бұл әдіс қарапайым, сондықтан өндірістік маңызы бар продуценттерді сұрыптауға қолданылады. Осы әдіс, түраралық және тұқымдас аралық гибридтерді алуға, сондай-ақ филогенезі басқа тіршілік иелерін будандастыруға зор мүмкіндік туғызады.Осы негізге сүйене отыра: бактериялар, ашытқылар және өсімдіктер жасушаларын құйып қосу табысты аяқталды. Мысалы: түраралық және тұқымдас аралық ашытқылар алынды, сонымен катар ғылыми әдебиеттерде, әр түрлі бактериялар мен ашытқылардың қосылуы туралы деректер кездеседі.
Алуан түрлі патшалыққа жататын организмдер (жануарлар мен өсімдіктер) жасушаларының құйылып қосуы арқылы гибридті жасушалар алынды.
Бақаның жасушалары сәбіздің протопластарымен құйылып, осының нәтижесінде: өсімдіктер жасушалары өсетін
қоректі орталарда, өсу қабілеті бар гибридті өсімдік-жануар жасушасы алынды, бірақ ол тез арада ядроларын жоғалтып, жасушалық қабырғамен жабылады.
Азотты бекітуші бактерияны (Anabaena variabilis) темекі өсімдігіне енгізу айтарлықтай жетістікпен аяқталды. А. variabilis-ді темекі өсімдігінің, бірден тамыр тармақтарына енгізу ешқандай нәтиже берген жоқ, ал мезофилді темекі ұлпасы мен цианобактерияларды бірге өсірген жағдайда, құрамында цинкобактериялар бар өсімдік-регенеранттары алынды.
4 ЖАСУШАЛЫҚ БИОТЕХНОЛОГИЯНЫҢ ӨНІМДЕРІ
Жасушалық биотехнологияның қаркындап дамуының арқасында, халықшаруашылығы мен медицина салаларында мынадай жетістіктерге қол жеткізілді:
:: медицина саласында - ауруларды ертерек анықтауға және емдеуге мүмкіндік беретін диагностикумдар мен биологиялық белсенді заттардың жаңа түрлерін алу; ;
:: адамның күнделікті рационын толықтыратын тағамдық және биологиялық белсенді заттарды өндіру;
:: жануарлардың өнімділігін арттыру үшін биологиялық белсенді заттарды: азықтық белок, аминқышқылдар, ферменттер, витаминдер, ветеринариялық препараттар өндіру;
:: биоинженерияның жетістіктерін қолдана отыра, адамдардың көптеген ауруларын емдеуге және одан сақтандыруға мүмкіндік жасайтын фетальді жасушаларды алу;
:: трансгенді жануарларды алу;
:: жаңа технологияны қолдана отыра тағамдық, химиялық және көптеген салаларға қажетті бағалы өнімдерді алу;
:: адамдар, жануарлар, өсімдіктер және микроорганизмдер тектес биопрепараттарды өндіру;
:: адам мен жануарлар органдарынан және микробтар жасушаларынан (генді инженерия - Е. соіі) гормондар алу;
:: адам мен жануарлар жасушаларынан вирусқа қарсы тұратын интерферондар алынды;
:: макрофагтардан интерлейкиндер өндірілді;
:: жануарлар мен адам жасушаларын қолдана отыра, гибридомды технология өнімі - моноклоналъді антиденеледі алу;
:: биологиялық және химиялық синтез өнімі антибиотиктерді өндіру;
<< тағамдардың құндылығын арттыру үшін қажетті бактериялық пробиотикті препараттарды aлy;
:: микроорганизмдер мен өсімдіктер жасушаларының биосинтез өнімдері - витаминдерді өндіру;
:: микроорганизмдер, өсімдіктер және жануарлар жасушаларын қолдана отыра, ферменттерді өндіру;
:: өсімдіктер мен жануарлар жасушаларындағы биосинтез өнімдері - белоктарды алу;
:: микроорганизмдердің биосинтезіне негізделе отыра, өндіріске қажетті сірке, лимон қышқылдарын өндіру;
:: саңырауқұлақтар мен сүт кышқылды бактериялар симбиозы-ашытқыларды алу;
:: жануарлар және адамдар жасушасының технологиясы нәтижесінде иммунитетті қамтамасыз ететін вакциналар мен сары суларды өндіру;
:: микроорганизмдер мен өсімдіктер биосинтезінің өнімдері- аминқышқылдарын алу.
Жасушалық технологияны қолдана отыра, көптеген иммундық және диагностикалық препарттар алынады. Жасуша өсіндісін қолдану арқылы: вакциналар, антигендер, аллергендер алынады. Осы аталып өткен препараттардың ішінде, иммундық қабілеті ең жоғары -вакцииалар болып карастырылады.
Қазіргі күні медицина және ауылшаруашылық салаларында жасушалық технологияны қолдана отырып, көптеген инфекциялық, ауруларға қарсы вакциналар дайындалады. Мысалы, грипп, гепатит В, герпес, шешек, құтырма, полимелилит, сары лихорадка және т.б. ауруларының алдын алу үшін вакциналар кеңінен колданылады.
Дәріс №9 Гибридомдық технология
Жасушалық биотехнологияның ең перспективтік бағыты болып,
Гибридомдық технология саналады.
Жасушаларды араластыру әдісі, биотехнология саласына маңызды жаңалықтар әкеліп, биотехнологияға саласында көптеген мүмкіндіктерге қол жеткізді:
* филогенетикалық әртүрлі биосистемаларды будандастыруға мүмкіндік береді;
* жасушаларды араластыру арқылы өнімі жоғары, фенотипі қалыпты түраралық өсімдіктер гибридтері алынды (темекі, картоп, капуста);
* бір ата-ананың толық геномын, ал екінші ата-ананың жартылай геномына ие болған асимметриялық гибридтерді алуға болады. Мұндай гибридтер, филогенетикалық бір-бірінен алыс организмдер жасушаларының арасында жиі кездеседі;
* үш, одан да көп жасушаларды араластыру арқылы гибридтер алуға болады. Мұндай гибридті жасушалардан регенерантты өсімдіктер (саңырауқұлақ) алынады;
* дамуы бойынша әртүрлі бағыттағы жасушалардың будандасуын жүргізу - әртүрлі ұлпалар мен органдар жасушаларының және қалыптағы жасушалардың ісік (рак) жасушалармен араласуы. Осылай алынған жасушалар гибридомды жасушалар немесе гибридомдар дел аталады.
Гибридті жасушалар, яғни гибридомдар генетикалық бағдарламалары әртүрлі жасушалардың қосылуы салдарынан пайда болады. Мысалы, қалыпты днфференциялды және трансформалы жисушалар. Мұндай технология жетістігінің айқьін белгісі болып, қалыптағы лимфоцитгер мен миеломды жасушалардың қосылуының нәтижесінде пайда болған гибридомдар саналады, Бұл гибридтердің арнайы антиденелер түзетін және өсіру кезінде шексіз өсетін қабілеттері болады. Екі жасуша араласқанда гетерокарион түзеді, яғни екі ядросы бар араласқан жасуша түзіледі. Жасушаларды бір-бірімен араластыру үшін, жасуша суспензиясын инактивтелген вируспен немесе полиэтиленгликольмен өңдейді. Осы екі агент плазматикалық мембрананы зақымдап, жасушалардың араласуын тудырады. Біршама уақыт өткен соң гетерокарион митоз жолмен бөлініп гибридті жасуша түзіледі. Мұндай жасушалардың ядролық қабығы бұзылып, барлық хромосомдар бір үлкен ядроға қосылады. Осы жолмен алынған гибридті жасушаларды клондайды, сөйтіп гибридті жасушалық линияны алады. Гибридті линиялардың тұрақсыз болуына және хромосомдарды жоғалтуына байланысты, оларды адамның хромосом гендерін картирлеу үшін қолданады. Қарапайым картирлеу - тышқан мен адам жасушаларының араласуы. Түзілген тышқан-адам гибридті жасушалар, анықталмаған себептердің әсерінен адам хромосомын жоғалтады.
Гибридті линияларды зерттеу нәтижесінде, адамның нақты хромосомдары қандай биохимиялық қызметке жауапты екендігі анықталады. Мысалы, адамға тән уридинмонофосфаткиназа ферментінің әр түрі адамның бір хромосомы бар гибридті жасушалар түзеді. Осыған байланысты, бұл ферменттің коды 1-ші хромосомда болатындығы анықталды. Сонымен қатар екі түрлі жасушалар компоненттерінің бір-бірімен әрекеттесуін зерттеу үшін гибридтерді қолданады, сондай ақ осы әдістің көмегімен, қандай нақты хромосомдарда гендердің бар екендігін анықтауға болады.
Бүгінгі күні гибридомдарды алу, биотехнология саласының ең өзекті мәселесі болып отыр. Гибридомдық технологияның ең басты мақсаты - жасушаны <<шексіз тірі>> қылу, мұндай жасушаны қолдану барысында, рак жасушаларымен араластырып алынған гибридомды линияны клондау.
Гибридомдардың артықшылығы:
:: қалыпты өсімдік жасушасының ракты өсімдік жасушаларымен араластыра отыра, жылдам өсетін жасуша клондарын алуға болады, яғни қажетті қосылыстардың продуценттері алынады;
:: гибридомды технологияның көмегімен, жануарлар жасушаларынан гормондарды, қанның белоктық факторларын өндіру үшін, шексіз көбею қасиеттері бар продуценттерді алуға болады.
Тәжірибеде маңызды гибридомдар - иммундық жүйенің ракты жасушаларын (миелом) қалыпты лимфоциттермен араластыру арқылы алынатын гибридомдар.
Лимфоциттер атқаратын қызметіне байланысты, әртүрлі лимфоциттер популяциясын құрайды. Лимфоциттер арасында ерекше қасиеті бар Т-киллерлер (өлтірушілер) болып саналады, олар бөгде затты арнайы инактивтей отыра, оған қарсы тұрады. Т-лимфоцит- киллерді рак жасушасымен араластыру арқылы, шексіз өсуге қабілетті жасушаларды алады. Әдебиеттер деректері бойынша, мүндай Т-киллер гибридом - клондарын организмдегі рак жасушаларына қарсы қолданылғаны туралы мәліметтер кездеседі.
В-лимфоциттерінің миеломдық жасушалармен араласу арқасында В - гибридомды клондар алынады. Олар антиденелер продуценттері ретінде тәжірибеде кеңінен қолданылады. Сонымен қатар В -лимфоциттер моноклональді антиденелердің алыну көзі болып саналады.
Бертінге дейін будандастыру максатымен тышқан мен егеу құйрықтың миеломдық жасушалары мен В-лимфоциттері қолданылды. Олардан алынған антиденелерді барлық кезде емдеу мақсатымен қолдануға болмайда, себебі олардың өзі адам организмі үшін генетикалық бөгде зат болып саналады.
Қазіргі күні адамның, гибридомдарын қолдану арқылы моноклональды антиденелер алынады. Бірақ мұндай гибридомдарды алу қиынға соғады, оның себебептер мыналарға байланысты:
* адамның гибридомдары баяу өседі;
* тұрақсыздығы басым болады.
Адамдардың, иммундық жасушаларына негізделіп алынған гибридомдардың артықшылығы - тышқан мен егеу құйрықтың моноклональды антиденелері анықтай алмаған антигеннің, сәл ғана өзгерістерін анықтай алады.
Миеломдық және иммундық жасушаларға негізделе отыра, гибридомдарды алу схемасы бірнеше кезеңдерден тұрады.
Мутантты рак жасушаларын aлy. Бұл үшін биосинтездің қосымша жолдарының ферменттерін (пуриндер, пиримидиндер) түзбейтін миеломдық жасуша линиялары енгізіледі. Мұндай мутантты рак жасушаларын таңдау үшін гилоксантин мен тимидин аналогтары қоллданылады. Құрамында жоғарыда көрсетілген аналогтар бар ортада, тек мутантты жасушалар тірі қалады, себебі оларда нуклеотидтер биосинтезінің қосымша жолдарына қажетті гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазасы мен тимидинкиназа фсрменттері болмайды.
Арнайы антигендерге қарсы антиденелер продуценттері -лимфоциттерді алу. Осы мақсатпен жануарлар мен адам организмдерін иммундайды.
Лимфоциттер мен рак жасушаларының араласуы. Бұл кезеңде араластырушы агент болып полиэтиленгликоль саналады. Лизолецин және Сендай вирусы электрлік алаң туғызатын араластырушы агент ретінде сирек қолданылады.
Гибридомдық жасушалардың скринингі. Құрамьгада негізгі жолмен түзілетін нуклеотидтердің синтезін тоқтататын, аминоптерин бар және гипоксантин мен тимидиннің биосинтезінің қосымша қоры бар селективті орта қолданылады. Бұл ортада ата-аналық миеломды жасушалар өледі, себебі олардың ферменттік ақаулары болады.
Гибридомды жасушалардың моноклоналъді антиденелер түзу қабілетін тексеру. Осы мақсатпен иммундық сорбентті әдіс қолданылады. Қазіргі күні радиоиммундық және иммундық- флуоресценттік әдістер қолданылады. Бұл әдістерде, антиденелер арнайы радиоактивті және флуоресцентті дақтармен белгіленеді.
Гибридомдық жасушалардың моноклональді антиденелерді түзу қабілетін тексергеннен кейін, үнемі тұрақтылығы мен иммундық қасиеттерін бақылай отыра, оларды клондайды.
Гибридомдармен масштабты түрде жұмыс істегенде, келесі кезеңдерді байқауға болады: өсіру, бөлу, жинақтау және алынаған антиденелерді тазартуды жүргізеді. Көп мөлшерде моноклональдік антиденелерді алу үшін, гибридомдық жасушаларды өсіріп қана қоймайды, сонымен қатар оларды тышқанның құрсағына енгізеді.
Дәріс № 10 Моноклональды антиденелер
Антиденелерді алу үшін қолданылатын дәстүрлі әдістен, гибридомдық технологияның айырмашылығы - ол алғашқы рет моноклональды антиденелерді (жалғыз жасушаның ұрпағы түзетін антиденелер) алу мүмкіндігін туғызды.
Моноклональды антиденелер өте сезімталды, олар бір антигендік детерминантқа қарсы бағытталады. XX ғасырдың ортасынан бастап, әртүрлі антигендік детерминанттарға қарсы, соның ішінде күрделі макромолекулаларға қарсы бірнеше моноклональды антиденелерді алуға мүмкіндік туды. Ал, моноклональды антиденелерді өндіріс масштабында алу, тек сол ғасырдың соңында жүзеге асты. Организмнің иммундық жүйесінің бөгде агентке (антиген) әртүрлі антиденелер түзіп жауап беретіндігі бұрынан белгілі, ал ісік (рак) жасушасының одан айырмашылығы, тек антидененің бір ғана түрін түзеді. Сонымен қатар миеломды жасушалар жылдам көбейеді және олардан алынған жасуша өсінділердің тіршілігін ұзақ уақыт сақтауға болады. 1975жылы Цезарь Мильштейн өзінінің зерттеулерінде миеломды жасушаларды нақты антигенге қарсы антиденелерді түзуге көндіру мүмкін еместігін анықтады.
Кембридждегі Медициналық ғылыми-зерттеу институтының молекулалық биология зертханасында алғашқы рет, тышқанның миеломды жасушаларын, арнайы антигенмен иммундалған тышқанның көк бауырының В-лимфоциттеріне құйып қосу (слияние) қарастырылды (сурет 13). Осы әрекеттің нәтижесінде, түзілген гибридті жасушаларға ата-аналық жасушалардың қасиеттері беріледі және мұндай жасушалар шексіз болып келеді. Сонымен қатар бұл жасушаларда, қандай да бір белгілі антиденені бөліп шығару қабілеті болады. Бұл жаңалық өте маңызды ғылыми дерек больш саналады және экспериментальды иммунологияның жаңа ғасырының бастамасы болып қарастырылады.
1155065116840
Сурет 13-Лимфоциттер мен миеломды жасушалардың қосылуынан туындаған гибридомды моноклональды антиденелер
А-беткейінде 4-ші антигендік детерминанттары бар антиген тышқанның лимфоциттік антигенін енгізгеннен кейін, 4 түрлі антиденелер түзеді; тышқан қанының анти сары суы антиденелер құрамынан тұрады.
Б- лимфоциттер миеломды жасушалармен қосылады; гибридтер (таза антиденелер) клонданылады (өркендейді).
1980 жылы М. Карло және басқа зерттеушілер миеломамен ауырған адамның В-лимфоциттерін, панэнцефалитпен ауырған адамның шеткі лимфоциттеріне құйып қосып, адамның түраралық тұрақты антигендерін түзетін гибридомын алды.
Гибридомдық технологияның басты кезеңдері былай сипатталады (сурет 14):
* тышқанды антигенмен иммундайды;
* иммундалған тышқанның көк бауырынан спленоциттарды бөліп алады;
* бөлініп алынған жасушаларды полиэтиленгликольдің қатысуымен, ақаулы ісік жасушаларымен (гипоксантин және тиминнің биосинтезіне қажетті ферменттердің ақауы) қосады;
* таңдалмалы (селективті) ортада, тек гибридті жасушалардың көбеюіне мүмкіндік жасалады;
* гибридтерді таңдайды.
Өскен гибридомдары бар қоректі ортада антиденелердің бар екендігін анықтау үшін тестіден өткізеді.
Анықталған культураларды таңдап алып, соңынан клондайды. Сол клондарды антиденелер түзетін ісікті тудыру мақсатымен жануарларға енгізеді. Тышқанның асциттік сұйықтығында 10-30 мг/мл дейін моноклональды антиденелер болуы мүмкін.
Моноклональды антиденелер - В-гибридомдық жасушалардың өнімдері. Моноклональды антиденелер көптеген ауруларды анықтау үшін қолданылады. Олардың жоғары дәрежелік арнайы қасиеті болғандықтан, тек қана инфекциялық агентті тауып қана қоймай, сонымен қатар оның серотипін де анықтайды. Моноклональды антиденелердің көмегімен гормондарды, метаболиттерді және белоктық факторларды анықтауға болады.
Индикацияны тез арада жүргізу үшін, мембраналық электродтарда иммобилденген (ферменттік биосенсорларының аналогы) антиденелерді қолданады. Олардың көмегімен: біріншіден - қантты диабетке, ревматоидты артритке шалдыққыштықты зерттейді; екіншіден - әйел адамның жүктілігін анықтайды; үшіншіден - тұқымқуалайтын ауруларды табуға мүмкіндік туады. Көптеген Батыс елдерінде моноклональды антиденелерді рак ауруын және оның өту кезеңдерін анықтауға қолданады.
Моноклональды антиденелер, тек анықтау мақсатында ғана емес, сонымен қатар емдеу үшін де кеңінен қолданылады. Мысалы, аутоиммундық ауруда - организмнің иммундық жасушалары, өзінің органдары мен ұлпаларына қарсы әрекет жасайды, Бұл кезде арнайы моноклональды антиденелерді енгізсе, олар қарсы әрекет көрсетіп тұрған антиденелерді байланыстыру арқылы организмді емдейді.
Моноклональді антиденелер мен ДНК/РНҚ-сынамалары жануарлардың және өсімдіктердің ауруларын анықтау үшін қолданылады. Соның ішінде атап өтетін жайт, осы әдістердің көмегімен картоптың вируспен зақымданғанын анықтауға болады.
Гибридомдарды қатырып сақтауға болады және қріылып қосылыған жасушаларды алған жануарға, осы клонды кез-келген уақытта енгізуге болады. Қазіргі күні моноклональды антиденелерді сақтайтын банктер құрылған.
Антиденелерді әртүрлі диагностикалық және емдеу мақсаттарында, сонымен бірге ракқа қарсы емдеу шараларын жүргізгенде кезде қолданады (кесте 7).
Емдеу (терапия) кезінде моноклональды антиденелерді қолданудың тиімділігін, оларда цитотоксигенді улармен байланысу қабілеттің болуымен түсіндіреді. Улармен коньюгацияланған антиденелер макроорганизмдегі ракты жасушаларды тауып, оларды жояды. Сонымен жасушалық биотехнология, биологиялық объектілерді модификациалау тәсілі және жаңа құнды өнімдерді органдық және жасушалық дәрежеде алуға мүмкіндік береді.
Адамдардың иммундық жасушаларына негізделіп алынған гибридомдардың артықшылығы - тышқан мен егеу құйрықтың моноклональды антиденелері анықтай алмаған антигеннің сәл ғана өзгерістерін анықтай алуында.
Моноклональды антиденелермен қатар ДНҚ/РНҚ - сынамалары тәжірибеде кеңінен қолданылады. Олардың көмегімен организмдегі жағымсыз агенттердің, зілді ісіктің (рак), және генетикалық аномалияларды тудыратын нуклеин қышқылдарының кейбір түрлерін табуын анықтайды.
К.Haron (1984) тышқанның миелома жасушалары мен адамның В- лимфоциттерінен тұратын химерлі гибридомдарды алып байқады, бірақ олар қазіргі күні сирек қолданылады.
Химерлі гибридомдарды алу үшін бірнеше әдістер қолданылады, төменде соның кейбіреулеріне сипаттама беріледі және қолданған кезде қандай өзгерістер тудыратынына тоқталып өтіледі.
Антиденелер мен басқа да макромолекулаларды тірі жасушаларға енгізу. Антиденелер өзімен қосылған молекулаларды инактивтейді. Мысалы, белокты фракцияларға антиденелер алу үшін қолданылған егеу құйрықтың балаларында, кейбір жүйке жасушалар түрі дамымайды.
Жасушаның плазматикалық мембранасы үлкен молекулаларды өткізбегендіктен, жасуша ішіндегі белоктар сырттан қосылған антиденелермен байланыса алмайды. Егер осындай белоктарды байланыстыру қажет болса, онда эукариот жасушасының ішіне антиденелер және басқада макромолекулаларды жіңішке инемен плазматикалық мембрананы тесіп енгізуге болады.
Қазіргі күні микроинъекция әдісі кеңінен қолданылады:
* Сүтқоректілердің жасушаларына антиденелерді енгізу үшін;
* Жасушаларға макромолекулалар мен органеллаларды енгізу үшін.
Осы әдістің көмегімен, бір сағат аралығында табақшада өскен, жүздеген жасушаларды инъекциялауға болады.
Дәріс № 11 Трансгенді жануарлар
1.Трансгенді жануарлар
2.Трансгенді жануарларды алу әдістемелері
Үй жануарлары мен құстардың жақсартылған тұқымын алу мақсатында (сүт мөлшерін көбейту, қойлардың жүндерінің сапасын арттыру үшін, тауықтардың жұмыртқа салуын жоғарлату үшін) өте көп мөлшерде будандастыру және таңдау жұмыстарын жүргізеді. Осы жұмыстарды жүргізу барысында, тек тұқымдық ерекшеліктері жақсы байқалған жануарларды алады. Осының нәтижесінде біршама уақыттан кейін жануарлардың аса бағалы тұқымды түрлерінің неғұрлым таза линияларын алуға болады. Ұзақ уақытты және көп мөлшерде материалдық шығындалуды қажет етуіне қарамастан, будандастырудың осы түрі табысты болып аяқталды. Сонымен қатар бүгінгі күнгі үй жануарларының (ірі қара мал) жаңа тұқымын шығарудың биологиялық негізі болып саналады. Бірақ осындай тиімді алынған генетикалық линиядан кейін, будандастыруға жаңа ерекшеліктер енгізу қиынға соғады. Себебі жаңа геном <<құнды>> гендерден басқа <<зардапты>> гендер де енгізуі мүмкін, осының салдарынан жаңадан алынған ұрпақтың өнімі аз болады. Сондықтан жаңартылған линияда, тек пайдалы белгілер сақталып, тапсырылған (заданные) ерекшеліктер пайдалы болсын десе, онда жаңа белгілерді анықтау үшін нұсқаулар дайындау қажет.
Сүтқоректілердің жасушаларына бөгде генді енгізу арқылы генетикалық бірдей жануарларды алуға болады. Осы мақсатпен эмбриондық жасушаның ядросын, алдын ала ядросы алынған аналық жыныс жасушасына енгізеді (ядроны тасымалдау, клондау). Осының арқасында, жоғарғы сатыдағы жануарлардың ДНҚ-на бөлек функциональді гендердің немесе олардың толық кластерлерін енгізу жүзеге асты.
Осы бағыттағы іс-әрекетті жүзеге асыру кезеңдері:
:: ұрықтанған аналық жасушасына клондалған ген енгізіледі;
:: ұрықтанған аналық жасуша инокуляциаланады;
:: рецепиентті аналық жануарға импланттайды (енгізіледі), осылай сүтқоректілердің ұрықтануын жүргізеді:
:: дамыған имплант, аналық жасушаның ұрпақтарын жинайды, бұл жасушалардың барлығында клондалған ген болады;
:: клондалған гені бар жасушалар, жануарларды ұрықтық линия жасушаларында будандастырады, осылай жаңа генетикалық линия алынады.
Будандастыруды осы тұрғыдан қарастыру нәтижесінде тәжірибелік ұсыныстар туындайды. Мысалы, енгізілген геннің өнімі өсуді қарқындататын болса, онда трансформациялық (тасымалдау) жануарлар, аз мөлшерде азықтанғанға қарамастан жылдам өседі.
XX ғасырдың 80-ші жылдарынан бастап, ұрықтанған аналық жасушаларға гендерді енгізу арқылы, жануарларда генетикалық өзгерістерді тудыру жұмыстары жүргізілді. Мұндай генетикалық өзгерістерді, жеңіл ақпараттау үшін ғалымдар арасында жаңа терминдер енгізілді. Сондықтан бөгде (экзогенді) ДНҚ енгізу арқылы генотипі өзгерген жануарлар - трансгенді жануарлар деп аталып, енгізілген ДНҚ-трансгендік, ал жалпы процесс трансгендік технология немесе трансгеноз деп аталынды.
Көп жасушалы организмдерге трансгенді енгізіп модификациялау жүргізілетін эксперименттер, өте ұзақ уақытты қажет ететіндігіне қарамастан, трансгеноз процесі сүтқоректілердегі гендер экспрессиясының молекулалық негізін зерттеу үшін және модельдік жүйелерді құру үшінэ таптырмайтын құрал болып саналады. Адам ауруларын зерттеуге қажетті және медицинаға маңызды белоктардың алыну көзі болып саналатын, жануарлардың сүт безін зерттеу үшін, трансгенозға негізделіп анықталған модельдердің маңызы зор.
Зерттеулер нәтижесінде трансгенді жануарлардың сүтінде, адамдардың аутогендік белоктарының және медицинада қолданылатын фармацевтік заттардың өндірілетіні дәлелденіп. Бұл процеске қатысты және оны сипаттайтын <<фарминг>> термині енгізілді.
Сүттегі заттарды анықтау қолайлы, себебі жануарлар организмінде сүт көп мөлшерде түзіледі және қажет болған кезде оны ешқандай зиян келтірмей сауып алуға болады. Ғалымдардың тұжырымы бойынша сүт безінен бөлініп, сүттің құрамында болатын жаңа белок, трансгенді жануардың организмде жүретін физиологиялық процестерге әсер етпейді. Сонымен бірге оны сүгтен бөліп алу ешқандай да қиындық тудырмайды.
2 Трансгенді жануарларды алу әдістемелері
XX ғасырдың 80-ші жылдарының басында трансгендік технологияны дамыту үшін жүргізілген ғылыми жұмыстар зертханалық тышқандарда жүргізілді. Трансгенді тышқандар, үлкен масштабта емдеу заттарының синтезделуіне, сондай-ақ адамның әртүрлі генетикалық ауруларын реттеуге қажетті трансгенді линияларды жасау үшін маңызды роль атқарды. Тышқандарға бөгде ДНҚ енгізуді әэртүрлі әдістермен жүзеге асыруға болады: 1) имплантация алдында ретровирустардың векторларының көмегімен; 2) ұрықталған аналық жасушасына ұлғайтылған спермия ядросын (ерлік пронуклеус) микроинъекция арқылы енгізу; 3) иплантация алдында эмбрионның алғашқы дамуы барысынд оған, генетикалық модификацияланған эмбрионның қабырғалық (стволовые) жасушаларды енгізеді. Ретровирусты векторларды қолданудың (сурет 15-А,Б) артықшылығы, олардың басқа трансгеноз әдістермен салыстырғанда тиімді болуымен сипатталады. ДНҚ-ны микроинъекция әдісі арцылы енгізу. Қазіргі күні трансгенді тышқандарды алу үшін көбінесе ДНҚ-ның микроинъокциялық әдісі қолданылады (сурет 16). Бұл әдістің жүргізу тәртібі:
1. донор - аналықтардың гиперовуляциясын тудыра отыра, олардағы аналық жыныс жасушалардың санын көбейтуге болады, оларға бөгде ДНҚ енгізіледі. Бірінші аналықтарға буаз биенің сары суын енгізеді, ал шамамен 48 сағаттан кейін адамның хориондық гонадотропинин енгізеді. Гиперовуляцияның нәтижесінде 5-10 аналық жыныс жасушаларының орнына, шамамен 35 түзіледі;
2. гиперовуляциясы бар және ол тоқтатылған аналықтарды аталықпен будандастыру. Жатыр түтігінен ұрықтанбаған аналық жасушаларды шаю;
3. бөлініп алынғаннан кейін, бірден ұрықтанған аналық жасушаға ДНҚ-ны микроинъекциялайды. Көбінесе трансгенді конструкция линиялық түрде болады және оның құрамында прокариотты векторлық біркелкі болмайды.
Аналық жыныс жасушасына сперматозоид енгеннен кейін, ядро спермияның (аталық пронуклеус) және аналық жасушаның ядросы бір-бірінен жеке тіршілікте болады. Содан кейін аналық жасушаның митоздық бөлінуі аяқталғаннан соң, ол аналық пронуклеуске айналады және ядролардың құйылып қосылуы болуы мүмкін (кариогамия). Негізінді аталық пронуклеус аналыққа қарағанда неғұрлым үлкен болады, оны секционды микроскоппен оңай жинақтап, оған бөгде ДНҚ енгізуге болады. Микроинъекцияны өткізу кезінде аналық жасушаны қозғауға, қажетгі жаққа бағыттауға, бекітуге болады. Бүгінгі күні микроинъекция әдісі арқылы бірнеше жүз жасушаларға бөгде ДНҚ - ны енгізуге болады.
Аналық жұмыртқаларға ДНҚ-ны микрохирургиялық жолмен енгізгеннен кейін, шамамен 25-40 жасушаларды дамытатын <<жатыр шешеге>> (суррогатная мать) аңалыққа енгізеді, бұл аналықты вазэктомдалған аталықпен будандастырып жалған буаздық тудырады. Себебі тышқандарда тек будандастыру арқылы жатырды имплантацияға дайындайды. Өйткені вазэктомдалған аталық сперматозоиттар бөлмейді, яғни <<жатыр шешені>> ұрықтандыра алмайды. Эмбрион тек, енгізілген жасушалардан дамиды, ал тышқан 3 үш жұмадан кейін күшіктейді.
Ядроны тасымалдау арқылы клондау. Анықталғалы (тест арқылы) отырылған жасушаның ядросын, ядросы алынып тасталған аналық жасушаға енгізіп, содан кейін соңғының өсуге және үрпақ беру қабілетін зерттеу - олардың плюрипотенттігін анықтау болып саналады. Эмбрионды жасушалар ядросының төмен дәрежеде тиімді түрде дамуын қамтамасыз ететіндігі дәлелденген. Мысалы, ірі қара малының эмбриондық жасушаларының ядросын тасымалдап, біраз уақыт өсіріліп тіршілікке қабілетті особьтар алынды.
Барлығымызға белгілі Долли атты қой, ересек жануардың сүт безі жасушасының ядросын тасымалдау арқылы клондалғаны, осы кезде 16-шы суретте көрсетілген әдісі қолданылды.
Осылай алғашқы рет, ересек дифферециаланған (ажыратылған) жасушалар ядросының плюрипотенттігі анықталды.
Трансгенді ірі қара (сиыр). Егер сүт безін <<биореактор>> ретінде қолданса, онда трансгеноз үшін ең қалаулы жануар болып сиыр қарастырылар еді, себебі ол жылына 10 000 л таман (1 л сүтте 35 г белок болады) сүт береді. Егер сүтте осынша мөлшерде рекомбинантты белок болса, онда оның тазалау тимділігі 50% құрайды, ал 20 трансгенді сиырлардан шамамен 100 кг белок алуға болады. Бүгінгі күні осындай белок мөлшері жылына тромбтың түзілуін болдырмауға қажет болып отыр. Сондай-ақ бір трансгенді сиырдың өзі, IX факторды (Кристмас факторы), яғни гемофилиямен ауыратын адамдарға қажетті қанның ұюын жоғарлататын факторды алуға жеткілікті болар еді. Трансгенді сиырды алу үшін, тышқандарды микроинъекциялау әдістемесі негізге алынып, трансгеноздың модификациялық әдісі қолданылды (сурет 17).
Модификацияланған әдіс келесі кезеңдерден тұрады:
:: сиырлардың ооциттерін жинау;
:: in vitro жағдайында ооциттердің жетілуі;
:: in vitro жағдайында бұқаның спермасымен ұрықтандыру;
:: ұрықтанған аналық жасушаларын жинақтау үшін центрифугадан өткізу;
:: ДНҚ-ын аталық пронуклеусқа микроинъекция арқылы енгізу;
:: in vitro жағдайында эмбрионның дамуы;
:: реципиентті аналыққа қашу кезінде, хирургиялық емес жолмен бір эмбрионды импланттау;
:: ұрпақтардың ДНҚ-сын трансгенезді анықтау үшін скринингтен өткізу.
Зерттеулер жүргізу барысында 2470 ооциттер жиынтығынан екі трансгенді бұзаулар алынған. Бұл алынған деректер осы зерттеудің нәтиже берітіндігін, бірақ тиімділігінің аз екедігін көрсетеді.
Ооциттарды жинау
In vitro жетілуі
In vivo ұрықтандыру
Ұрықталған аналық клетканы центрифугадан өткізу
Аталық пронуклеусқа ДНҚ микроинъекция арқылы енгізу
Эмбрионды импланттау
Ұрпақтын ДНҚ трансгенездің бар екендігін білу үшін
Сурет 17- Ірі қара малының трансгеноз
Бүгінгі күніде осы бағыттағы зерттеулер жалғасып жатыр, олардың арқасында трансгенез әдістемесі жетіледі деген ой бар. Мысалы, жақын болашақта in vitro дамып жатқан эмбрионның аз мөлшерін алып, ондағы трансгеннің бар, не жоқ екенін анықтауға болады. Мұндай мөлшерде алынған жасушалар эмбрионның қалыпты дамуына бөгет жасамайды.
Ірі қар амалын трансгендеудің басты мақсаты - сүттегі әртүрлі компоненттердің болуын өзгерту. Осылай сүттен дайындалатын ірімшіктің көлемі оның құрамындағы казеинға тура пропорциональды болатындығы анықталған. Сондықтан синтезделетін казеиннің мөлшері, осы белоктың трансгенін гиперэксперссиялау факторы болып саналады. Әрі қарай сүт безінің жасушаларында лактоза генінің экспресиясын қамтамасыз ететін болса, онда құрамында лактоза жоқ сүт алуға болады. Мұндай сүт лактозаны көтере алмайтын, яғни жануарлар сүтіне аллергиялық реакциясы бар адамдар үшін аса бағалы болып саналады. Ірі қараның трансгенозы - ол өте перспективті қалау болып саналады, бірақ көп мөлшерде трансгенді жануарларды алу, үзақ уақытты талап етеді, себебі ұрықталған аналық жасушадан дамып жетілген жануарды өсіру үшін, шамамен 2 жыл қажет.
Инфекциялық аурулардың қоздырушыларына төзімді жануарларды алу үшін, басқа - иммундың механизмді тұқым қуалау арқылы беретін трансгеноз жолын қарастыру керек. Осы тұрғыдан иммундық жүйенің жұмысына жауап беретін әртүрлі гендер қарастырылады: басты гистоүйлесімдік (гистосовместимость) комплексінің гендері, Т-жасушалық рецепторлар, лимфокиндер.
Бүгінгі таңда, тышқандарға, қояндарға және шошқаларға қандай да бір моноклональды антидененің кодталған Н жэне L-тізбектерін енгізудің алдын ала нәтижелері ғалымдарды үміттендіреді. Осы жұмыстардың басты мақсаты - жасанды иммундаусыз (вакцина, сарусы енгізу арқылы) трансгенді жануарларды тұқым қуалау арқылы төзімділікпен қамтамасыз ету.
Трансгенді қойлар және шошқалар. Қойлар мен екшілердің трансгеноз барысында жүргізілген жұмыстар, осы жануарлардың сүт бездерін, медицинада кеңінен қолданылатын белоктық өнімдерді алатын, өзіндік бір биореакторларға айналдыру болды. Қойлар мен ешкілер сиырларға қарағанда сүтті аз береді, бірақ жылына оларда шамамен жүз литрдей сүт береді. Трансгенді тышқандарды және сүт безінінен спецификалық промоторлар бақылайтын адам гені бар трансгенді конструкцияларды алу үшін қолданылған әдіске сүйене отырып, трансгенді қойлар мен ешкілер алынды, ал олардың сүтінде адам белоктары түзілді. Олар гликолизделінген және адамнан алынатын белоктардың белсенділігіне сәйкес белсенділікпен сипатталды. Бірақ олардың толық бірдей болуын анықтау үшін бүгінгі күні әрі қарай зерттеулер жүргізілуде.
Қойлар мен ешкілердің организміне трансген ешқандай өзгерістер әкелген жоқ, яғни олардың лактациялық кезеңі қалыпты түрде өтті. Ал шошқаларға енгізілгін бұқаның өсу гормонынның трансгені (металлотионеин промотрының бақылау) жағымсыз өзгерістер тудырады. Трансгеннің мөлшері әртүрлі особьтарда әртүрлі болды, бірақ шошқалардың барлығы жылдам салмақ қоса бастады. Өкінішке орай осы жақсы нәтиже, көп жағдайда бірнеше түрлі патологиялармен: асқазанға жара шығуы, бүйректердің жетіспеушілігі, ақсаңдау, перикардтың қабынуы, буындардың қозғалысыз болуымен сипатталды. Осы патологиялар өсу гормонының организмде көп мөлшерде ұзақ уақыт болуымен түсіндірілуі мүмкін. Сонымен бірге жүні тез өсетін трансгенді қойларда алынды. Осы мақсатпен қойдың к-ДНҚ инсулин тәрізді 1өсу факторына күкірті көп кератин гені (тышқанның промоторы бақылайды) араластырылды. Бұл кезде де жағымсыз әсерлер байқалған жоқ.
Трансгенді шошқаларға зерттеулер жүргізу барысында қажетті нәтижелер алынды. Мысалы, трансгенді шошқаларда адамның гемоглобині синтезделді. Трансенді шошқалар түзетін адам гемоглобинінің химиялық құрамы адамның табиғи гемоглобинімен бірдей болды. Бірақ осылай бөлініп алынған гемоглобин эритгроциттерге қарағанда оттегін аз тасымалдайды және жануар организмінде жылдам ыдырайды. Сондықтан трансгенозды қолдана отырып адам қанынын алу алыс болашақтағы істер болып қарастырылады.
Долли қойы, дифференцияланған жасуша ядросымен және басқа үш қойдың эмбриональдық жасушасының ядросынан тыныштық кезінде тасымалдау жасалған жасушаларды қолдана отырып клондалды. Үрықтың бөлінуі бірнеше тәулік арасында өтеді, оның алғашқы үш күнінде тек ДНҚ-ның репликациясы болады, бірде-бір ген экспрессияны бастамайды. Болжау бойынша осы уақытта ДНҚ жасушаға тән арнайы реттеу белоктарынан тазарады, ал осыған сай эмбриондық даму кезіндегі гендер, аналық жасушасының цитоплазмасындағы эмбриондық белоктық факторлармен байланысады.
Ең басты көніл аударатын жайт>> ядроларды тасымалдау әдісін қолдану плюрипотенттігін үзілісіз өсіндіде сақтау больш саналады.
Жоғарғы жақта көрсетілген суретте жасушаның ядросы микропипетканың көмегімен алынады. Ересек қойдың сүт безінің эпителиялар өсіріліп, содан кейін олардың G6 кезеңіне өтілуі жүргізіледі (индукциаланады), G6 кезеңіндегі жасушалармен ядросынан айырылған аналық жасушалардың құйылып қосылуы байқалады, қалыпына келген аналық жасушаларды өсіндіде немесе жатыр түтігіне лигатура байлап эмбриогенездің басқы кезіне дейін өсіреді. Содан кейін оларды <<жатыр шеше>> аналығының жатырына енгізеді (импланттайды), осы жерде оның әрі қарай дамуы басталады. Уилмут және т.б. (Wilmut et al., 1997) өткізген зерттеулерінде 277 аналық жасушасының сүт безінің ядросы алынған жасушаларымен құйылып қосылуы өткізілді.
5. МЕДИЦИНА ЖӘНЕ ВЕТЕРИНАРИЯДАҒЬІ БИОТЕХНОЛОГИЯ
Бүгінгі күні вакциналарды өлтірілген (инактивтелген) патогендік микробтар немесе тірі вируленттігі жоқ (аттенуацияланған) микробтардың негізіңде жасайды. Осы мақсатпен табиғи штамды алып қоректі орталада өсіреді, тазартады, содан кейін өлтіреді (инактивтеленеді), иммундық жауапты тудыру үшін осы тәсілмен оларды модификациялайды. Ващиналарды алу кезіндегі орасан зор жетістіктерге қарамастан, оларды алуға біршама шектелулер қойылады:
* бардық патогенді микроорганизмдерді өсіре алмайды, сондықтан көптеген ауруларға қарсы вакциналар әлі күнге дейін жасалмаған адамдар мен жануарлар вирустарын алу үшін өте бағалы жануарлар тектес өсінділер қажет;
* адам мен жануарлар вирустарының өсіндідегі титрі және өсу жылдамдығы темен болғандықтан, ондай вакциналарды алу тым қымбатқа түседі;
* міндетті түрде микроорганизмдерді жұқтырып алмау үшін, сақтану шараларын қадағалау керек;
* кейбір вакциналардың партиясын өндіру кезінде ережелерді бұзу немесе сақталмаса, онда аурудың тарауы байқалады;
аттенуацияланған штамдар қайтадан реверсияға ұшырауы мүмкін, сондықтан олардың вируленттігін үнемі қадағалау қажет. контролировать вирулентность.
Сонымен бірге вакциналар медицинада ғана емес, сондай-ақ ветеринарияда қолданылады. Ауылшаруашылық жануарларының -аусыл, жылқының африкандық ауруына, трипаносомоздарға және т.б. ауруларға қарсы алынатын вакциналардың зор экономикалық маңызы болады. Көбінесе вакциналарды дәстүрлі әдіспен, яғни әлсіретілген немесе өлтірілген микробтар негізінде дайындайды.
Осы саладағы басты өзекті мәселе-вакциналық антигендердің иммуногендік қасиеттерінің нашар дамуында. Бұның бір себебі, вакцинаның құрамындағы құрылыстық бөлшектерінің толық сақталмауында болып саналады, осыған байланысты иммунитет (белсенді немесе активті, бәсең немесе пассивті) әр түрлі болып түзіледі. Мысалы, вирус жасушадан шыққан кезде, оның мембранасының бөлігін өзімен бірге алып, онымен жабылады. Гендік инженериялық белокта болмайтын, осы мембрана компоненттерінің иммунногендік қасиеттері болуы мүмкін. Вакцина медицина және ветеринария салаларында инфекциялық ауруларға қарсы тұру шараларының негізі болып саналады. Жаппай вакциналаудың нәтижесінде шешек ауру жойылып, құтырма, полиомиелит ауруларының таралуы азайды.
Антибиотиктер - олар микробтардың (көп жағдайда саңырауқұлақтардың) тіршілігінің нәтижесінде түзілетін өнімдер, Оларда белгілі микроорганизмдер топтарына және қатерлі ісікке қарсы физиологиялық белсенділік өте жақсы дамыған, яғни олардың өсуін тежейді немесе толық дамуын тоқтатады. Осы антимикробтық қосылыстардың 5000 жақын түрлері бар, бірақ оның барлығы бірдей медицина мен ветеринарияда қолданылмайды. Күнен-күнге жаңа антибиотиктерді іздеу, қолданылып жүрген антибиотиктердің токсигеңдігіне, аллергиялық реакциялар тудыруына, микробтарда оларға деген төзімділік пайда болуына байланысты, сонымен қатар бүгінгі күні қолданылып жүрген антибиотиктердің кейбір қоздырушыларға әсері тиімді болмағандықтан зерттеу жүмыстары үнемі жүргізіледі, Антибиотиктерді іздеу жолдары мыналардан тұрады:
* Антибиотиктердің жаңадан алынған көздерін сынау. ХХ-шы ғасырдың 80-ші жылдарынан бастап, көп мөлшерде антимикробты агенттерді түзетін миксобактерияларды зерттеу жұмыстары жүргізілді.
* Антибиотиктердің химиялық модификациясы.Микробтарға қарсы макролиттер адамдар үшін улы болып келеді. Мысалы, ауыр түрдегі микоздарға қарсы қолданылатын гептаен амфо-терицин В, адамның бүйректерінде қалпына келмейтін зақымдануды туғызады. Ал амфотерициннің метилді эфирінің улылығы төмен және саңырауқұлақтарға қарсы белсенділігі сақталады.
* Мутасинтез. Бұл кезде мутантты штамдарды алады. Ондай антибиотиктер молекуласының жеке фрагменттер синтезі тоқтатылған болып келеді. Өсіру ортасьша осы фрагменттердің аналогін енгізеді. Микроорганизмдер биосинтез үшін осы аналогтарды қолданады, нәтижесінде модификацияланған антибиотиктер алынады.
* Жасушалық инженерия. Гибридті антибиотиктер алынады, мысалы, агликон мен қанттардың жаңа комбинациялары қолдану арқылы алынады (CM. Навашин, Ю.О. Сазыкин, 1984).
* Гендік инженерия- микроорганизмдер геномына ферменттер туралы ақпаратты енгізеді, ол фермент түзілетін антибиотикті модификациялау үшін керек, мысалы, оны метилаздың көмегімен метилдеу.
Гормондар. Биотехнология медицина тәжірибесіне бағалы гормондарды алу жолдарын ұсынады. Әсірес, өткен ғасырдың соңында пептидті гормондарды синтездеу жұмыстары өрледі.
Ертесінде гормондарды жануарлар мен адамдардың органдарынан (донордың қаны, операция кезінде алынып тасталған органдар) алынды. Осы кезде гормондық өнімінің аз мөлшерін алу үшін көп материалдар қажет болды. Сондықтан ғалымдар гормондардың жаңа алу көздеріне іздеу салды.
Е. соlі бактериясының ген инженерлік штамдарын қолдана отырып, бүгінгі күні осы бактерия өсірілген 1 л ортадан 100 мг өсу гормонын бөліп алуға болады. Сондықтан ергежейлікпен ғана емес, сондай-ақ бойдың кішкене болуымен де (соматотропиннің аз дәреже жетіспеуі) күресудің перспективасы ашылды. Соматотропин жаралады, күйіктерді жазуға, қалқанша бездің гормоны кальцитонинмен бірге сүйектегі Са+ алмасуын реттейді.
Ұйқы безінің пептидті гормоны инсулин қант диабетін емдеу үшін басты препарат болып саналады. Бұл ауру инсулиннің жетіспеушілігінен туындап, қанда глюкоза мөлшерінің жоғарлауымен сипатталады. Көпке дейін инсулинді өгіз бен шошқаның ұйқы безінен алып келді. Бұл препараттың адам инсулинінен айырмашылығы 1-3 аминқышқылдарының ауысуымен көрсетіледі, сондықтан жануарлар тектес инсулинді қолданған кезде аллергиялық реакциялардың пайда болу қаупі әсіресе балаларда туды. Инсулиннің кең қолданылуына шек қойған себептер: бағасының қымбат болуы және алыну көздерінің шектілігі, Химиялық модификация жолымен адамның инсулинінен айырмашылығы жоқ жануарлар тектес инсулинді өндірілді, бірақ ол өнімнің бағасының әрі қарай жоғарлауын туғызды. Бүгінгі күні адамның инсулинін алу үшін Е. соіі-дің ген инженериялық штамдары қолданылады.
Интерферон. Интерферондар вирустың енуіне қарсы адам мен жануарлар жасушаларында түзіледі. Оның антивирустық белсенділігі жақсы дамыған. Интерферонның әсер ету механизмі әлі толық зерттелмеген. Жиі кездесетін болжау бойынша интерферон вирустық бөліктің жасушаға енуіне бөгет жасайды. Интерферондар иммундық жүйенің қызметін қарқындатады және онкожасушалардың (рак) жасушалардың көбеюіне бөгет жасайды. Интерферонның әсер ету аспектілері емдеу (терапевтік) тұрғыдан қаралып, өте маңызды болып келеді. Қазіргі күні α-, β-, γ және ε-интерферондарын ген инженериясын қолдану арқылы Е. соlі бактериясының, ашытқы саңырауқұлақтарының, насекомдардың (Drosophila) және сүтқоректілердің ген инженериялық штамдарына алады. Ген инженериялық интерферондар моноклональды антиденелерді қолдану арқылы тазартылады. Интерферондар герпес, кұтырма, гепатит, цитомегаловирус, жүректің ауыр зақымдануын тудыратын вирусты аурулардан емдеу үшін қолданылады, сондай-ақ вирусты аурулардың алдын алу үшін қолданылады. Интерферонды аэрозольдық жолмен қолдану (иіскеу) көптеген жіті түрде өтетін респираторлық ауруларын болдырмайды.
Ферменттер. Ферменттердің алуан түрі медициналық тәжірибеде қолданылады. Оларды тромбтарды еріту үшін, тұқым қуалайтын (болмайтын эндогенді ферменттердің) ауруларды емдеу үшін, жасушаның және ұлпаның тіршілігі жоқ денатурацияға ұшыраған бөлшектерді шығару үшін, организмді улардан тазарту үшін қолданылады. Мысалы, адамдардың аяқтарындағы, өкпелеріндегі, жүректің коронарлы тамырларында тромбоздан, адам өмірін сақтап қалу үшін стрептокиназа және урокиназа ферменттері қолданылады.
Медициналық белоктардың туғызатын бір проблемасы, оның адамдар организімінде қалыптағы емес өзгерістер тудыруында, мысалы, аллергиялық реакциялар ген иженериялық белоктар мен моноклональды антиденелерге қарсы түзіледі, белоктарда ген инженериялық жолмен адам гибридомынан алынса да оларға қарсы реакциялар туады. Бұл проблема медицина үшін жаңалық емес, бірақ әлі шешуін таппаған мәселе болып отыр.
Витаминдер. Микробиологиялық жолмен эргостерин, витамин B12 алады, сонымен қатар микробтар С витамин алу кезінде сорбитты собозаға дейін тотықтыру және витаминдық коцентраттар мен В2 витаминин алу үшін қолданылады.
Тауықтар мен шошқалардың рационында қолданылатын биотинді микробтық синтез әдісімен алу перспективті болып саналады.
B12 витаминин алу үшін анаэробты жағдайда жүгері үзіндісі, глюкоза, кобальт және аммония сульфатының тұздары бар қоректі ортадаға үзіліс жасап егу арқылы алады.
Табиғатта B12 витамині микроорганизмдерде, жануарлар ұлпасында және жоғарғы өсімдіктерде болады. Ал микроорганизмдер арасында ең белсенді продуцент болып псевдомонадтар саналады, олардың ішіңде Pseudomonas denitrificans штамы терең зерттелген, осы мутант қалыпты ортада 59 мг/г қорриноидтар түзеді (құрылысы B12 витаминіне жақын қосылыстар). Сонымен қатар термофильді бацилаларда қызықтырады. Мысалы, Bacillus circulans және Вас. Stearothermophilus, олар стерильді емес ортада 60°С мен 75°С 18 сағатта өсіп, көп 2,0-6,0 мг/л витамин түзеді.
6. БИОТЕХНОЛОГИЯ ЖӘНЕ ТАҒАМ ӨНЕРКӘСІБІ
Микроорганизмдер және өсімдіктердің жасуша өсінділері тағамдық қоспаларды алу үшін қолданылады, Олардың басты ерекшелігі және синтетикалық қоспалардан айырмашылығы <<табиғи зат>> болуында.
Бүгінгі күні қажетті өнімдердің бірі - диабет ауруымен ауыратын адамдар үшін қантты ауыстырушыларды өңдеу. Ең басты ауыстырушы-фруктоза, оны иммобилденген глюкоизомеразаның әсерімен глюкозадан түзіледі.
Қазіргі күні аспаздар (кулинар) тағамға, биореакторларда өсірілген өсімдік жасушалаларынан жасалған бүлдірген, жүзім және сарымсақ пен таңқұрайдың қош иісті дәмдерін қолданады.
Көптеген еледерде аз калориялы, диабетпен ауыратын адамдарға қауіпті емес тағамдардың маңызы артып отыр, әсіресе сахарозаның ауыстырғышы (заменитель) фруктозаны өндіру кең орын алған. Фруктозаны иммобилденген глюкоизомеразаны қолдану арқылы алады. Кейбір тағамдарды дайындау кезінде глицин қолданылады. Ол аспарагин қышқылымен бірігіп тәтті және қышқыл дәмдердің бірнеше түрін білдіреді. Тағам өнеркәсіптерінде өтте тәтті аспартамды, әсіресе сахарозадан 10 есе тәтті 100-200 пептидтік қатар тауматин және монеллинді қолдануды алдыға қойып отыр. Аспартам Е.соlі-дің ген инженериялық мутанттарынан алынады, сонымен бірге тауматиннің гені клондалған.
Қазіргі күні тағам өндірістерінде маңызды роль атқаратын биокатализдік система - ферменттер. Олардың көмегімен жеміс шырындарын мөлдірлетеді, лактозасыз сүт
өндіреді, еті жұмсартады. Тағамның құндылығын арттыру үшін, оның құрамына витаминдер, аминқышқылдарын қосады.
Қазіргі күні амин қышқылдарының көп түрі микроорганизмдердің өсінділерінен гендік инженерияның жетістіктерін қолдана отыра алынады. Бір қатар аминқышқылдарын ген инженериясының әдістері арқылы алынған продуцентті микробтардан алады, Мысалы, Е. соlі-дің генинженериялық штамы В.Г. Дебабовтың (1982) деректері бойынша 30 г/л L-треонинді 40 сағат өсіру кезінді синтездейді. Биотехнологиядағы басты бағыт - өндірістік микроорганизмдер штамдарының күшейту.
Биотехнологияның тағам өнеркәсібіне қорытындылап қосқан қосыміпалары 8-ші кестеде көрсетілген.
1357181559279Болашақта бір келткалы организмдердің биомассасынан да көптеп тағамдық қоспалары дайындалады. Осы кезде жасалатын қоспаларға қойылатын талаптар қатаң. М.Г. Безруковтың (1985) деректері бойынша қоспалар құрамында белоктың мөлшері 80% аз болмауы керек, ал нуклеин қышқылдарының көлемі 2% және майлардың мөлшері 1% -да көп болмауы керек. В.Г. Высоцкийдің (1985) деректеріне сүйенсек, тағам қоспаларын қолдану үшін біріншіден қоспаларды толық токсикологиялық, медико-биологиялық зерттеулерден, содан кейін клиникалық сынақтардан өткізу керек.
6.1 Биологиялық агенттер және оларды иммобилдеу әдістері
Биотехнологиялық процесті құрайтын басты элементтері: биологиялық агент, субстрат, аппараттар және өнім.
Биологиялық агент биотехнологиялық процестің басты және белсенді (активті) элементі болып саналады. Биологиялық агенттің номенклатурасы күннен күнге қарқындап өсіп келеді. Бірақ бүгінгі күнге дейін ең маңызды орынды дәстүрлі объект - микробтық жасуша алады (кесте 9).
Әртүрлі химиялық-технологиялық қасиеттері бар микробтық жасушалар табиғи көздерден бөлініп алынып, содан кейін дәстүрлі (сұрыптау және таңдау) және жаңа әдістердің (жасушалық және генетикалық инженерия) көмегімен модификацияланады және неғұрлым жақсартылады. Биологиялық агентті таңдау және оны өндірісте қолдану кезіңде, ең бастысы штамның технологиялық қабілеттеріне негізделу қажет. Бұл дегеніміз, микробтық жасуша, популяциялар немесе особьтар топтары ұзақ ферментациялау кезінде, өздерінің басты физикалық-биологиялық қасиеттерін сақтаулары керек. Сонымен қатар өндірістік продуценттер фагтардың мутациялық әсеріне, қоршаған орта микрофлорасымен ластануына төзімді болу керек, сондай-ақ адамдарға зардапсыз болады, өсірген кезде улы заттарды түзбей, тек коммерциялық өнімді көп мөлшерде түзуі керек.
Бүгінгі таңда микробтық технология гетеротрофты организмдерді қолдануға негізделеді, ал болашақта продуценттер арасында ең қалаулы орынды алатын автотрофты микроорганизмдер. Себебі микробтар өсу үшін дефицитті органикалық заттарды қажет етпейді және олар экстремофильдер - яғни экстримальды ортада (термофильдер, алкало-және ацидофильдер) өсе береді. Қазіргі кезде араласқан культуралар және олардың табиғи қосылыстары кеңінен қолданылады. Монокультуралармен (микробтың бір түрі ғана) салыстырғанда микробтар қосылыстары келесі қабілеттер болады: күрделі заттарды, құрамы бірыңғай емес субстраттарды сіңіреді; күрделі органикалық заттарды минералдайды; биотрансформацияға жоғары дәрежеде қабілеті; ортаның қолайсыз жағдайларына жоғары төзімді; өнімді көп мөлшерде түзеді; басқа топтармен генетикалық ақпаратты ауыстыра алады. Микроб қосылыстары қоршаған ортаны қорғау үшін, күрделі субетраттарды биодеградациялау және оларды сіңіру үшін қолданылады.
Ерекше биологиялық агенттер ол - ферменттер, яғни биологиялық катализаторлар болып саналады. XX ғасырдың 60-шы энзимологияның дамуының алғашқы кездерінде тұрақты және арзан ферменттерді алуға мүмкіндік болмай көп қиындықтарға тірелген болатын, ал бүгінгі күні ферменттер биотехнологиялық процестерде және халық шаруашылығында өте кең қолданылады. Сондықтан да жаңа биологиялық агенттерді табу саласында иммобильденген ферменттерді атап өткен жөн, олар тұрақты қызмет көрсететін биологиялық жүйе ретінде, яғни фермент, тасымалдаушы және иммобилдеу әдістерін дұрыс таңдалған биологиялық агент.
Өсімдіктер және жануарлар жасушалары биотехнологияның даму кезіңінде дәстүрлі емес биологиялық агенттері болып табылады.
Қазіргі таңда биологиялық агенттердің жаңа агенттері-микроорганизмдер, өсімдіктер, жануарлардың трансгенді жасушалары болып саналады. Сонымен биотехнологиялық процестерде әртүрлі дәрежеде ұйымдасқан құрылысы бар, басқаша айтқанда жасушалық дәрежеден молекулалық дәрежелі құрылымдары бар биологиялық агенттер қолданылады.
Иммобилдеу дегеніміз - ол молекуланың қозғалысын тұрақтап бекіту, сол кезде болатын конформациялық қайта құру физикалық-химиялық принциптерге негізделе отырып молекуланың белсенді орталығын сақтай отыра бекітіледі.
Иммобилдеу процесінде биологиялық еистемаларды екі принципке негізделе отыра иммобилдейді:
:: биологиялық объекті мен тасымалдаушының арасында ковалентгі байланыстардың болмауы (физикалық әдіс);
702233-104063
6850373973549
:: биологиялық объекті мен тасымалдаушының арасында ковалентті байланыстардың байқалуы (химиялық әдіс). Екі әдісте әртүрлі тәсілдермен жүзеге асады.
Иммдбилдеудің физикалық әдісі биологаялық жүйені ерімейтін тасымалдаушының үстіне адсорбтау (қондыру) және гельді және жартылай енгізгіш заттардың ішіне енгізу арқылы жүзеге асады.
Ерімейтін тасымалдаушыларға адсорбтау. Бұл әдісте молекула электрстатикалық әсерге, гидрофобтық қасиетке, дисперсиялық қарым-қатынасқа және сулы байланыстарға негізделіп тасымалдаушының
бетіне адсорбтанады.
Гелъдің ішіне енгізу арқылы иммобилдеу. Бұл әдіс бойынша
иммобилдеу келесі тәсілдермен жүзеге асады:
:: бірінші тәсілде молекуланы мономердің сулы ерітіндісіне салады, содан кейін полимерлейді;
:: екінші тәсілде молекуланы дайын полимер ерітіндісіне
салынады, содан кейін ол гельді қатырады.
Жартылай енгізгіш структураларда иммобилдеу. Жартылай енгізгіштік қасиеті бар мембрамалардың көмегімен молекуланың сулы ерітіндісін субстраттың сулы ерітіндісінен айыру. Ең кеңінен тараған әдіс - ол микрокапсулдау және молекулаларды липосомаларға енгізу. Өндірістік биокатализдерді алу үшін кеңінен қолданылатын әдіс -химиялық әдіс. Химиялық иммобилдеудің бірнеше тәсілдері бар (18-сурет):
:: гидрооксидті топтары бар тасымалдаушыларда иммобилдеу.
:: аминді топтары бар тасымалдаушыларда иммобилдеу.
:: карбоксил топтарын белсенді өндіретін тасымалдаушыларда
иммобилдеу.
:: Сульфгидрленген топтары бар тасымалдаушыларды иммобилдеу.
Иммобилденген жасушаларды алу. Жасушаларды иммобилдеу технологияны жеңілдетеді:
:: тұтас жасушаның қолданғандықтан, олардың құрамындағы ферменттерді бөліп және тазалап керегі жоқ;
:: жасушалар бір-екі, тағы да көп сатылы процестерді жүргізуге
мүмкіндік береді.
Өндірістік жағдайларда жиі өлтіріліп иммобилденген жасушаларды қолданады. Өлген жасушалар, тек бір сатылы процестерге жарамды.
Мұндай жасушалар инкапсуланған ферменттерге өте ұқсас болып келеді.
Тірі жасушалар жоғарыда көрсетілген жасушаларға қарағанда перспективті болып саналады; бірақ тірі жасушалар өте көп жағдайды талап етеді. Сонымен қатар популяциядан популяция аралығында жасушалардың қасиеті тұрақты болмайды.
Көптеген өнімдер өсіп жатқан жасушалардан түзілмейді. Олардың синтезі тек, жасуша станционарлы фазада болғанда байқалады.
Сондықтан жасушаларды осы фазада иммобилдейді.
Иммобилденген жасушалық органеллалар. Бөлініп алынған жасушалық органеллаларға мыналар жатады:
* хлоропластар;
* митохондриялар;
* микросомалар;
* лизосомалар.
Осылардың барлығы биотехнология объектілеріне жатады. Бөлініп алынган органеллалардың жасушалардан айырмашылығы, олар өспейді және бөлінбейді.
Қатарлас иммобилдеу - ол әртүрлі биокатализдерді біріктіріп (екі немесе бірнеше ферменттер, әртүрлі жасушалар, ферменттер мен жасушаның комбинациясы) иммобилдеу.
Әсіресе ферменттер мен жасушаларды қатар иммобилдеуге көңіл аударады:
:: жасушада ферментке тән катализдік қасиет бар, екеуін катар иммобилдеу арқылы реакцияны шапшаңдатады және катализдік белсенділікті тұрақтатады;
:: жасуша мен фермент әртүрлі реакцияларды катализдейтіндіктен, субстрат бірнеше сатылап тұтас өнімге айналады.
Иммобилденген жасушалар келесі биотехнологиялық процестерде қолданылады:
:: Saccharomyces cerevisiae, Zyrnomonas mobilis жасушалары целлобиозды этанолға дейін ыдырату үшін;
:: Saccharomyces cerevisiae, Zyrnomonas mobilis жасушалары лактозаны этанолға дейін ыдыратуға;
:: S. cerevisiae - құрамында аз мөлшерде декстриндар бар сыраны алу үшін;
:: S. cerevisiae - құрамында аз мөлшерде белоктар бар шараптар алу үшін;
:: S. cerevisiae - глюкозаның глюкон қышқылына айналуы және тағы басқалар.
Иммобилденген жасушалардың өндірісте қолданылуы:
:: фруктоза немесе фруктоза мен глюкозаның қоспаларын алады;
:: L- және Д - изомерлерден L- аминқышқылдарьш алады;
:: L- аспарагинді қышқылын аммония фумаратынан алу;
:: жартылан синтетикалық пенициллиннің негізі-табиғи бензилпенициллиннен 6-аминді пеницилинді қышқылды алу;
:: лактозасыз сүтті aлy үшін;
:: алма қышқылының биосинтезін өткізу үшін;
:: преднизолонға гидрокартизонды тасымалдау (трансорттау)үшін;
:: ферменттер.
Иммобильденген ферментгердің еритін ферменттерге қарағанда ерекшеліктері: тұрақтылығы, белсенділігі, тұтас өнімдерді жартылай немесе толық бөлу қабілеті, бірнеше қайтара биологиялық агентті қолдана отырып ферментация процесін үзіліссіз өткізу. Иммобилденген ферменттер талдау жасайтын микроқұралдарды табу және энергияны қайтадан түзу үшін жаңа мүмкіндіктер туғызады.
Пәндер
- Іс жүргізу
- Автоматтандыру, Техника
- Алғашқы әскери дайындық
- Астрономия
- Ауыл шаруашылығы
- Банк ісі
- Бизнесті бағалау
- Биология
- Бухгалтерлік іс
- Валеология
- Ветеринария
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Дін
- Ет, сүт, шарап өнімдері
- Жалпы тарих
- Жер кадастрі, Жылжымайтын мүлік
- Журналистика
- Информатика
- Кеден ісі
- Маркетинг
- Математика, Геометрия
- Медицина
- Мемлекеттік басқару
- Менеджмент
- Мұнай, Газ
- Мұрағат ісі
- Мәдениеттану
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности)
- Педагогика
- Полиграфия
- Психология
- Салық
- Саясаттану
- Сақтандыру
- Сертификаттау, стандарттау
- Социология, Демография
- Спорт
- Статистика
- Тілтану, Филология
- Тарихи тұлғалар
- Тау-кен ісі
- Транспорт
- Туризм
- Физика
- Философия
- Халықаралық қатынастар
- Химия
- Экология, Қоршаған ортаны қорғау
- Экономика
- Экономикалық география
- Электротехника
- Қазақстан тарихы
- Қаржы
- Құрылыс
- Құқық, Криминалистика
- Әдебиет
- Өнер, музыка
- Өнеркәсіп, Өндіріс
Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.
Ақпарат
Қосымша
Email: info@stud.kz